CN102776184A - 猪 ckm 5,侧翼启动子区 snp 作为猪胴体性状的遗传标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪CKM的5’侧翼启动子片段作为猪胴体性状的遗传标记及制备方法与应用。该遗传标记具有序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。其特征在于该序列的第82bp处分别存在一个A/G和G/A的突变，引起DraIII-RFLP的多态性。利用该遗传标记对大白猪和梅山猪F₂代进行了与猪胴体性状的关联分析，检测了含有不同基因型的大白猪和梅山猪肌肉组织中CKM的表达量。本发明还公开了该遗传标记的分型检测方法，为猪胴体性状分子标记辅助选择提供了新的遗传标记和检测方法。

Description

猪 CKM 5,侧翼启动子区 SNP 作为猪胴体性状的遗传标记及应用

技术领域

本发明涉及猪育种与猪的分子标记辅助选择领域，具体涉及一种与猪的胴体性状相关基因CKM 5’侧翼启动子片段的克隆及其作为猪胴体性状遗传标记的应用。

背景技术

近年来基因组研究的迅速发展，对基因结构和功能研究的不断深入，一类能够在分子水平上以DNA多态性为标记进行遗传分析从而达到识别个体基因型差异的新型选择方法——分子标记辅助选择技术应运而生。分子标记直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织各个发育阶段均可检测到，不受季节环境限制；多态性丰富，数量多；大多数为共显性，能区别纯合体和杂合体。因此，分子标记辅助选择具有高准确性，可用于早期选种，缩短世代间隔。与常规育种相结合，可大大加快育种进程。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。根据SNP在基因中的位置可分为基因编码区SNP(coding-region SNP cSNP)、基因周边SNP(perigenic SNP，pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP，iSNP)三类。启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它。因此，研究功能基因5’侧翼序列启动子中的SNP可能有更重要的生物学功能，能够影响基因的表达。

CKM(creatine kinase，muscle)编码肌酸激酶肌肉特异型同功酶，是哺乳动物细胞内表达的4种肌酸激酶亚型之一，主要在骨骼肌和心肌中大量表达，而且在快肌纤维中的表达量大约是慢肌纤维中的两倍，是肌肉发育和分化的标志(Trask et al.Developmental regulation and tissue-specific expression of the humanmuscle creatine kinase gene.J Biol Chem.1988，263：17142-17149)。同时，CKM能与肌原纤维的M带相结合，是骨骼肌能量代谢的关键酶之一(Turner et al.A protein that binds specifically to the M-line of skeletalmuscle is identified as the muscle form of creatine kinase.Proc Nati Acad Sci U S A.1973，70：702-705；Wallimann et al.Function of M-line-bound creatine kinase as intramyofibrillar ATP regenerator at the receivingend of the phosphorylcreatine shuttle in muscle.J Biol Chem.1984，259：5238-5246)。当体内ATP浓度低而机体又需要能量时，肌酸激酶催化磷酸肌酸将高能磷酸基团转给ADP形成ATP以供给机体能量的需要。当机体利用有氧氧化产生能量合成ATP的浓度增大时，也需要肌酸激酶催化将高能磷酸基团转移给肌酸，保证磷酸肌酸的重新合成。另外，肌酸激酶也是蛋白激酶C的有效底物，是细胞生长信号途径中的重要成分(Linet al.Regulation of muscle creatine kinase by phosphorylation in normal and diabetic hearts.Cell Mol Life Sci.2009，66：135-144)。缺失CKM的小鼠表现为异常的肌肉生理和增加的骨骼肌糖原水平(van Deursen et al.Skeletal muscles of mice deficient in muscle creatine kinase lack burst activity.Cell.1993，74：621-631)。可见，CKM与体内的能量代谢等密切相关，是影响猪胴体等性状的重要功能基因。但迄今为止，还未见猪CKM基因SNP的有关报道，其与猪胴体等性状的关系也未揭示。

发明内容

本发明目的在于克隆猪CKM基因5’侧翼启动子区特异DNA片段，寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析其与与猪胴体性状的关系，为猪的胴体性状标记辅助选择提供有用的分子标记。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明获得了大白猪和梅山猪CKM基因5’侧翼启动子区209bp序列，其DNA序列如序列表SEQ IDNO：1(大白猪)和SEQ ID NO：2(梅山猪)所示，通过对2个猪种的上述序列进行Cluster W比对提供了位于该209bp扩增片段内部的2处核苷酸多态性(SNP)，其中：在所述的序列表SEQ ID NO：1的82bp处存在一个A/G的突变，在序列表SEQ ID NO：2的82bp处存在一个G/A突变，导致DraIII酶切位点的改变，引起DraIII-RFLP多态性。其SNP位点如图1所示。

制备该启动子片段的步骤如下所示：

选择中国地方猪种梅山猪和外来的欧洲大白猪为实验材料，从猪血液中提取基因组DNA，根据猪CKM基因5’侧翼序列设计如下引物：

正向引物F：5’AGGAGACAGCGAGTAGCG 3’，

反向引物R：5’CCCTGATGCCTGTGCTTA 3’。

利用该引物进行PCR扩增，PCR产物纯化，克隆测序，序列比对分析。

本发明提供了检测上述序列82bp处A/G变异的DraIII-RFLP基因型分型方法。

本发明进一步提供了利用DraIII-RFLP方法确定不同基因型个体与猪胴体性状之间的相关关系的关联分析的应用。

进一步利用实时定量PCR技术检测了CKM基因在含有不同基因型的梅山猪和大白猪中的表达量。

序列表、附图说明

序列表SEQ ID NO：1是外来品种大白猪CKM 5’侧翼启动子片段的核苷酸序列；

序列表SEQ ID NO：2是中国地方猪种梅山猪CKM 5’侧翼启动子片段的核苷酸序列；

图1：是大白猪和梅山猪CKM 5’侧翼启动子片段的核苷酸序列比对结果和SNP位点

图2：是CKM基因5’侧翼区DraIII-RFLP检测结果：琼脂糖浓度为2％；图中泳道M为DL2000Maker；泳道1为GG型，209bp；泳道2为AA基因型，81bp，128bp；泳道3为AG基因型，209bp，81bp，128bp。

图3：是不同基因型的CKM基因的表达量分析。

具体实施方式

实施例1猪CKM 5’侧翼启动子区特异DNA片段的获得及SNP检测方法的建立

选择外来血缘猪“大白猪”和中国地方猪种“梅山猪”两种不同基因型猪品种为试验材料，根据猪CKM基因基因组序列(GeneBank登录号DQ153192)设计如下引物，引物序列如下：

正向引物F：5’AGGAGACAGCGAGTAGCG 3’，

反向引物R：5’CCCTGATGCCTGTGCTTA3’。

用上述引物在大白猪(国外血缘猪)和梅山猪(中国地方猪)基因组DNA中进行PCR扩增(猪基因组DNA的提取方法参见文献：熊远著.猪的生化及分子遗传实验导论.北京，中国农业出版社，1999，39-51)。

PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

PCR反应条件见表2所示。

表2PCR反应条件

对上两种基因型猪种的PCR产物经纯化、克隆后，进行序列测定，测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。经ClusterW比对分析，序列比对结果见图1。发现该序列82bp处存在A/G突变(在在所述的序列表SEQIDNO：1即外来品种大白猪的该片段的82bp处存在一个A/G的突变，在序列表SEQ ID NO：2即中国地方猪品种梅山猪该片段的82bp处存在一个G/A突变)，导致DraIII酶切位点的改变，引起DraIII-RFLP多态性。

取7.0μl PCR产物加入1μl限制性内切酶DraIII(5U/μl)、1μl 10×buffer、0.1μl BSA和0.9μl ddH2O，37℃酶切4h，酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。当82bp处碱基都为A时存在DraIII酶切位点，酶切结果检测到两个片段计为AA型(81bp+128bp)，当突变位点为G时DraIII不识别该位点，酶切结果检测到一条带计为GG型(209bp)，当A和G都存在是，酶切结果为3条带计为AG型(209bp+81bp+128bp)。结果如图2所示。

实施例2：本发明克隆的遗传标记与猪胴体性状的关联分析及应用

为了确定猪CKM基因5’侧翼启动子区SNP与猪表型差异是否先关，选择中国湖北省武汉市华中农业大学农业部猪遗传育种重点开放实验室组建的135头大白猪×梅山猪F2代资源群体为实验材料(XuDQ，XiongYZ，Liu M，Lan J，Ling XF，Deng CY，Jiang SW.Association analyses with carcass traits in the porcineKIAA 1717and HUMMLC2B genes.Asian-Aust J Anim Sci.2005，18：1519-1523)，采用PCR-DraIII-RFLP方法(Deng GR.A sensitive non-radioactive PCR-RFLP analysis for detecting point mutations at 12th codon ofoncogene c-Ha-ras in DNAs ofgastric cancer. Nucleic Acids Res.1988，16：6231)进行多态性检测，并分析猪CKM基因5’侧翼启动子区DraIII-RFLP不同基因型与猪胴体性状和肉质性状的相关关系。采用SAS统计软件glm程序进行单标记方差分析，模型如下：

模型Y_ij＝μ+G_i+S_j+F_k+βcov_ijk+e_ijk

Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表AA、AB和BB基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA、AB和BB基因型)；S_j、F_k为固定效应，分别为性别、家系效应；β为屠宰体重的回归系数，cov_ijk为屠宰体重协变量，e_ijk为残差效应。

表3猪CKM基因5’侧翼序列基因型与猪胴体性状的统计分析表

注：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；基因效应^*表示p＜0.05，”^**表示p＜0.01。

所检测的135头大白猪×梅山猪F₂代个体中，AA基因型有5个，AG基因型有75个，GG基因型有55个。不同基因型与猪胴体性状间的统计分析结果见表3。由表3可以看出，DraIII-RFLP基因型不同时，肩部最厚处膘厚、6-7胸椎间膘厚、平均背膘厚、胴体长、板油、尾重存在显著或极显著差异，显性效应显著或极显著。

实施例3本发明不同基因型的CKM基因的表达量分析

提取梅山猪和大白猪2月龄肌肉的DNA(熊远著.猪的生化及分子遗传实验导论.北京，中国农业出版社，1999，39-51)和RNA(参见invitrogen

Reagent说明书)，并将RNA反转录为cDNA。以猪基因组DNA为模板PCR扩增CKM基因5’侧翼启动子区特异DNA片段，利用DraIII对扩增片段进行酶切，获得不同的基因型，其中梅山猪该位点为AA型，大白猪为GG型。以反转录的cDNA为模板，利用设计的引物进行实时定量PCR，分析不同基因型的表达量。

实时定量PCR所用的引物的DNA序列如下：

正向引物F：TCACCTGCCCGTCTAACCT，

反向引物R：GGATACATCGAACACTGAGCC。

实时定量PCR体系见表4。

表4实时定量PCR体系

实时定量PCR反应条件见表5。

表5实时定量PCR反应条件

结果发现含有AA基因型的梅山猪肌肉表达量是含有GG基因型的大白猪的两倍多，差异显著。

Claims (4)

1.猪CKM基因5’侧翼启动子片段作为猪胴体性状的遗传标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示，在序列表SEQ ID NO：1所示序列的82bp处存在一个A/G的突变，在序列表SEQ ID NO：2所示序列的82bp处存在一个G/A突变，导致DraIII酶切位点的改变，引起DraIII-RFLP多态性。

2.根据权利要求1所述的遗传标记，克隆猪CKM基因5’侧翼启动子片段所用引物的DNA序列如下所示：

正向引物F：5’AGGAGACAGCGAGTAGCG 3’，

反向引物R：5’CCCTGATGCCTGTGCTTA 3’。

3.一种筛选猪胴体性状遗传标记的方法，其特征在于，按照以下步骤：

以猪CKM基因的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，以其5’侧翼序列为靶序列设计引物，得到如权利要求2所示引物；从猪血液中提取基因组DNA，用权利要求2所示的引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；通过序列比对，筛查SNP及其所在限制性内切酶识别位点，进行酶切分型，检测不同基因型的CKM基因的表达量，分析不同基因型与猪胴体性状的相关关系。

4.权利要求1所述的遗传标记在猪胴体性状标记辅助选择中的应用。

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