CN100564526C - 猪胴体性状gfat1基因的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种用于猪标记辅助育种的遗传标记的猪胴体性状GFAT1基因的克隆及多态性检测。本发明的特征是，克隆得到一种猪胴体性状GFAT1基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所述。在序列表SEQ ID NO：2的第101bp处有一个G101-A101的碱基突变，导致MvaI-RFLP多态性。本发明还公开了克隆GFAT1基因和扩增GFAT1基因第8内含子所用的引物以及用于多态性检测方法。本发明为猪胴体性状GFAT1基因的多态性检测提供了一个新遗传标记和方法。

Description

猪胴体性状GFAT1基因的克隆及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体地说涉及一种用于猪标记辅助育种的遗传标记的猪胴体性状GFAT1基因的克隆及多态性检测。

背景技术

随着人们对动物蛋白食品需求的不断增长和商品经济的发展，胴体品质评定已成为遗传、育种学家、生产者、肉品经营者、消费者普遍关心的问题。随着国内外活猪及猪肉产品的商品市场的发展及科技水平的提高，对胴体品质评定的标准化、规格化等已成为研究热门，目前世界上公认的胴体品质评定指标具体有：胴体瘦肉率(lean percentage in the carcass，CLP)、瘦肉量(lean content in the carcass，CLC)或可销售瘦肉分割块比率(lean cuts ratio，LCR)。在实际工作中，人们试图寻找一种简便的活体评定胴体品质的方法，以减少屠宰带来的经济损失，因此大量研究致力于寻找胴体组成的最佳预测指标。胴体是一个综合性状，它包括一系列的评价指标。在猪的育种中，度量胴体性状的主要指标包括以下内容：胴体长(胴体直长、胴体斜长)、背膘厚、臀中肌中点处膘厚(臀膘厚)、眼肌面积、板油比率、脂肪比率、后腿比例、骨率、皮率、瘦肉率等。胴体性状的遗传行为不是孤立的，胴体性状之间往往也存在着表型和遗传上的相关。

近年来，分子遗传学和分子生物技术有了突飞猛进的发展，利用基因组扫描和候选基因策略在不同的资源家系里，已经鉴别了一些影响猪生长和胴体性状的主效基因及候选基因。例如：(1)Geldermann等(Geldermann H等，Mapping of quantitative traits loci by means of marker genes in F2 generationsof wild boar，Pietrian and Meishan pigs.J Anim Breed Genet，1996，113：381-387)，Knorr等(KnorrC等，Association of GH gene variants with performance traits in F₂ generations of Europesan wildboar，Pietrain and Meishan pigs.Ainm Genet，1997，28：124-128)研究发现猪12号染色体上不同的生长激素(Growth hormore，GH)基因单倍型与几个胴体组成性状有显著关联。(2)有报道猪7号染色体上的主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)基因单倍型与初生重、断奶重、生长速度、背膘厚等性状有关(彭中镇等，猪的数量性状基因及其标记研究进展，国外畜牧科技，1999，26(10)：28-32)。(3)Yu等(Yu TP等，Association of PIT1 polymorphisms with growth and carcasstraits in pigs.J Anim Sci，1995，73：1282-1288)在一个含中国与美国猪品种“血液”的资源家系中检测到垂体转录因子(Pituitan transcription factor 1，PIT1)与平均背膘厚存在显著相关。(4)Jeon等(Joen J T等，A paternally expressed QTL affecting skeletal and muscle mass in pigs maps tothe IGF2 locus.Nature Genetics，1992，21：157-158)和Nezer等(Nezer C等，An imprinted QTL withmajor effect on muscle mass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs.Nature Genetics，1992，21：155-156)分别用两个家系类胰岛素生长因子2(Insulin like growth factor II，IGF-II)定位于猪2号染色体上，并检测到该基因与背膘厚有显著相关。(5)tePas等(tePas M F等，Messengerribonucleic acid expression of the MyoD gene family in mucle tissue at slaughter in relationto selection for porcine growth rate.J Anim Sci，2000，78：69-77)在大白猪的杂交群体中分析了MyoD基因家族的一个重要成员肌细胞生成素(Myogenin)基因与生长、胴体性状可能存在相关，肌细胞生成素基因位于猪9号染色体上。(6)黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4 receptor，MC4R)位于猪1号染色体上(Kim K S等，Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene.J Anim Sci，2000a，78：791-792)，Kim等(Kim K S等，A missense variant of the porcinemelanocortin-4 receptor(MC4R)gene is association with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome，2000b，11：131-135)在5个猪商品系中检测到MC4R基因遗传变异与背膘厚显著相关。(7)正在研究的与猪生长和胴体性状相关的候选基因还有：与生长、胴体性状可能有关的瘦素基因(Leptin，LEP)即肥胖基因和生肌因子3(myf3)(Kim K S等，A missense variant of the porcine melanocortin-4receptor(MC4R)gene is association with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome，2000b，11：131-135)。对骨骼肌的生长有负调控作用的肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因，该基因又称GDF-8(Growth differentiation factor 8，生长分化因子8)(Mcpherron A C等，Double musclingin cattle due to mutation in the myostatin gene.Proc Natl Acad Sci，1997，94(23)：12457-12461)，与背膘厚有显著相关的组织蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)基因(Russo V等，Investigation ofcandidate genes for meat quality in dry-cured ham production：the porcine cathepsin B(CTSB)and cystatin B(CSTB)genes.Anim Genet，2002，33：123-131)，猪CACNB1基因可作为影响猪肉质性状、繁殖性状和生长性状的候选基因(李建华等，猪CACNB1基因定位及对生产性状的潜在影响评估.中国畜牧杂志，2007，43(7)：6-8)等。

GFAT1(glutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase)谷氨酸盐：果糖-6-磷酸氨基转移酶，GFAT1是氨基己糖合成路径(HBP)的限速酶，也是此路径的第一个酶，控制氨基己糖合成路径，在葡萄糖毒性和胰岛素抵制中扮演重要角色。GFAT1蛋白的数量调控葡萄糖通过HBP的流量，增加GFAT1蛋白水平，直接激活氨基己糖合成路径，这个路径涉及能量代谢的能量传递和胰岛素抵制(Clara et al.，TheGellular Fate of Glucose and Its Relevance in Type 2 Diabetes.Endocrine Reviews，2004，25(5)：807-830)。

在真核细胞中，GFAT1活性易受UDP-GlcNAc反馈抑制调节，亦可被谷酰胺类似物(重氮丝氨酸等)抑制。目前已对细菌、霉菌及人类表达GFAT1的cDNA进行克隆，并研究了GFAT1的结构及功能。结果发现，霉菌中GFAT1活性是动态变化的，在霉菌生长期，细胞壁合成中需要UDP-GlcNAc，GFAT1活性不受抑制，而孢子期，GFAT1活性则受抑，并伴有一种与GFAT1活性有关的蛋白质的磷酸化(Zhou et al.，Human glutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase：characterization of mRNA and chromosomal assignment to2p13.Hum Genet，1995，96：99-101)。体外研究发现cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)可诱发类似反馈抑制过程。进一步研究发现人类GFAT1活性亦受cAMP依赖性通路介导。人类GFAT1交链区有两个同样的PKA磷酸化位置：NH₂端、COOH端分别为氨基羟化酶及醛糖还原酶的作用位点，一旦磷酸化，则GFAT1活性受抑制(侯为开，氨基己糖与胰岛素拮抗.国外医学.内分泌学分册，1997，4：21-23)。

McKnight等(McKnight等，Molecular cloning，cDNA sequence，and bacterial expression of humanglutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase.J Biol Chem，1992，267：25208-25212)克隆了人GFAT1基因，该基因的mRNA全长为3090bp，编码了一个含681个氨基酸的蛋白质，蛋白质分子量为77kDa。目前，人、小鼠和大鼠GFAT1基因的cDNA全长已被克隆和测序。DeHaven等(DeHaven et al.，Anovel variant of glutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase-1(GFAT1)mRNA is selectivelyexpressed in striated muscle.Diabetes，2001，50(11)：2419-2424)研究表明，小鼠的GFAT1基因在骨骼肌和心肌中及人的骨骼肌有两个不同转录本，两个转录本相差54bp，在其他组织只存在一个转录本。人的GFAT1被定位于2p13，基因组全长为61，919bp；小鼠的GFAT1基因定位于6号染色体，cDNA全长为2408bp，编码681个氨基酸；大鼠的GFAT1基因定位于4q34，cDNA全长为2285bp，编码681个氨基酸。目前，有人研究，在饲喂共轭亚油酸日粮的猪中，GFAT1基因的表达显著增加(Meadus et al.，Prolongeddietary treatment with conjugated linoleic acid stimulates porcine muscle peroxisomeproliferator activated receptor gamma and glutamine-fructose aminotransferase gene expressionin vivo.J Mol Endocrinol，2002，28(2)：79-8)。

尽管猪胴体性状侯选基因的研究取得了一些重要进展，但仍然存在不足：(1)目前被鉴定出来的新基因数量有限，而且能够应用于实际生产的基因很少。(2)猪的重要经济性状通常是数量性状，涉及到的生理生化过程相当复杂，即使同一个数量性状，尽管已揭述其1-2个受控基因，但仍有其它具有大效应的新基因有待发现。(3)目前有关数量性状基因的研究，基本上是选用单一候选基因进行分析，忽略了基因间的相互作用。现代分子育种的内容之一是基因组育种，即根据个体所有性状的基因和基因型的组织结构及功能效应进行整体或全基因组选择、选配、保种和杂种优势分析利用等，其基础是有完整的高密度的基因图，并充分了解所有基因的组织结构、功能表达调控机理以及与性状的关联，然而目前在猪中已经遗传定位和物理定位的基因和标记仍十分有限，这方面的工作还需要进一步的加强。(3)寻找具有重要生理功能基因的方法不够全面，效率不高，需要创新，有必要进一步寻找、挖掘与猪重要经济性状相关的新基因。

发明内容

本发明的目的在于克隆猪GFAT1基因，寻找该GFAT1基因的突变位点以及基因多态性的检测方法，通过性状关联分析的应用，为猪的标记辅助育种提供一种有用的分子标记。

本发明通过以下技术实现：

申请人克隆得到一种猪胴体性状GFAT1基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所述。序列表SEQ ID NO：2的第101bp处有一个G101-A101的碱基突变，导致MvaI-RFLP多态性。

申请人设计了四对克隆猪胴体性状GFAT1基因的引物，所述的序列如SEQ ID NO：1所示。

与此同时申请人克隆了扩增GFAT1基因第8内含子所用的引物，该引物的序列如SEQ ID NO：2所示。

一种筛选猪胴体性状基因GFAT1分子标记方法，按照以下步骤制备：

第一步

用人GFAT1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性85％以上的表达序列标签；然后拼接猪表达序列标签-重叠群；根据表达序列标签-重叠群设计四对引物，扩增得到目的片段；以成年鄂西黑猪肌肉组织提取总RNA为模板，作RT-PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列；

第二步

从猪血液基因组提取DNA，以猪GFAT1基因cDNA序列为模板设计引物，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所述DNA序列，应用PCR-RFLP方法检测猪GFAT1基因的多态性。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

本发明的效果是：

1.猪GFAT1基因的克隆结果

以成年品种为“鄂西黑猪”的肌肉组织提取总RNA反转录合成的cDNA为模板，分别用表3所列的四对引物GF-A₁和GF-B₁，GF-A₂和GF-B₂，GF-A₃和GF-B₃，以及GF-A₄和GF-B₄进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物(如图4所述)。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示A₁B₁片段长度为547bp，A₂B₂片段长度为398bp，A₃B₃和A₄B₄片段大小分别为716bp和1038bp。

将四个片段A₁B₁，A₂B₂，A₃B₃和A₄B₄用GeneTool 1.0软件中的ASSEMBLY程序进行拼接，得到一条长度为2345bp的cDNA整合序列(图2所示)。将这段cDNA序列在GenBank中进行同源性检索，检索结果该序列与人GFAT1基因cDNA(GenBank收录号：NM_002056)的同源性达96％，序列分析表明该cDNA序列具有2100bp(nt 41-2140)的开放阅读框，编码一个由681个氨基酸组成的蛋白质。

2.猪GFAT1基因的定位结果

用GFAT1-P引物在SCHP中分型结果表明，19个猪×中国仓鼠体细胞杂种细胞系(1-19号)中，1、6-10、16、19号出现与猪基因组DNA阳性对照扩增一致的490bp的目的片段，而在8个猪×小鼠体细胞杂种细胞系(20-27号)中，23号杂种细胞系扩增得到490bp的目的片段。将上述实际观测的PCR分型数据提交给HybWeb(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果是GFAT1基因定位于猪3号染色体上(P＝1.000)，进一步的区域定位结果为SSC3q21-q27(P＝0.8091，与该区域标记间的相关系数为1.000，P＜0.1％)。

用GFAT1-P引物在IMpRH分型结果是00001000？01110010110 0000000000 0000000101 00？？0100001010000000 0000000011 0011101001 0000000010 0001010？0？ 11100111 0100010011(其中0和1分别表述扩增结果为阴性和阳性，？表示不确定的结果)。统计分析结果，GFAT1基因与猪3号染色体上的SW828紧密连锁，LOD值为12.39，RH图距是0.29Ray。进一步证实该基因位于猪3号染色体上。

3.PCR-RFLP诊断方法建立

用GFAT1-PL1和GFAT1-PR1扩增猪基因组DNA得到310bp特异扩增片段，包括部分外显子8、9，以及内含子8的序列(详见图3)。测序的结果发现在该310bp片段中第101位发现一个G-A转换，位于内含子8中，造成一个MvaI酶切位点(CCWGG)，其中第98bp处为多态性切点，用GFAT1-PL1和GFAT1-PR1扩增猪的6FAT1基因获得长度为310bp的PCR产物，酶切产生三种基因型，基因型AA型有310bp一条带，GG型有212bp和98bp两条带，杂合子GA型有310bp，212bp和98bp的三条带，如图5所述。

4.标记性状关联分析

(1)对猪GFAT1基因第8内含子MvaI-RFLP多态性位点与部分胴体、肉质性状进行关联分析，基因型检测结果表明在124个个体中AA基因型有80个，AG基因型有38个，GG基因型有6个(由于个别测定性状的数据缺失，因此得到的实际值如表1所示)，所得到相关的性状是胴体直长、臀中肌中点处膘厚(臀膘厚)。

由表可知，G等位基因是胴体直长、臀中肌中点处膘厚的有利标记(胴体长、臀膘薄)，GG基因型标记可用于同时提高体长和降低臀中肌中点处膘厚的选择标记。

表1不同GFAT1基因MvaI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	个体数	胴体直长(cm)	臀中肌中点处膘厚(mm)
				AA	51	92.298±0.450<sup>ab</sup>	2.178±0.087<sup>ab</sup>
AG	38	93.311±0.507<sup>a</sup>	2.289±0.098<sup>a</sup>
				GG	6	90.372±1.284<sup>b</sup>	1.691±0.248<sup>b</sup>

注：同列含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母，表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极为显著(P＜0.01)

(2)对猪GFAT1基因第8内含子MvaI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，基因型检测结果表明在298个个体中AA基因型有161个，AG基因型有114个，GG基因型有23个(由于个别测定性状的数据缺失，因此得到的实际值如表2所示)，所得到相关的性状是瘦肉率、校正背膘厚。

由表可知，G等位基因是瘦肉率、校正背膘厚的优势等位基因(瘦肉率高、校正背膘厚薄)，GG基因型标记可用于同时提高瘦肉率和降低校正背膘厚的选择标记。

表2不同GFAT1基因MVaI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	个体数	瘦肉率(％)	校正背膘厚(mm)
				AA	161	63.2023664±0.1756344<sup>a</sup>	14.3928255±0.1779203<sup>a</sup>
GA	114	63.6662577±0.2195804<sup>ab</sup>	13.9189154±0.2224382<sup>ab</sup>
				GG	23	64.1059016±0.4253155<sup>b</sup>	13.3915863±0.4308509<sup>b</sup>

注：同列含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母，表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极为显著(P＜0.01)。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪GFAT1基因的cDNA序列；

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的猪GFAT1基因的DNA序列；

图1：是本发明关于GFAT1基因制备的流程图；

图2：是本发明中猪GFAT1基因cDNA序列，起始密码子和终止密码子用标有下划线的斜体字母表述，引物GF-A₁和GF-B₁，GF-A₂和GF-B₂，GF-A₃和GF-B₃，以及GF-A₄和GF-B₄的序列用阴影显述。

图3：是本发明中猪GFAT1基因DNA序列，图中用下划线标出推测的外显子，其余序列为内含子区域，5’和3’拼接位点的两个保守核苷酸(GT/AG)用边框标出，突变位点用加粗及斜体标出，引物序列用阴影显述。

图4：是本发明中猪GFAT1基因编码区四个片段的RT-PCR扩增结果，琼脂糖胶浓度为2％。M泳道：DNA分子量标记(100-1000bp ladder)；1泳道：A₁B₁片段，片段长度547bp；2泳道：A₂B₂片段，片段长度398bp；3泳道：A₃B₃片段，片段长度716bp；4泳道：A₄B₄片段，片段长度1038bp。

图5：是本发明中猪GFAT1基因第8内含子的MvaI-RFLP的三种基因型(AA GA GG)电泳结果。M：DNA分子量标准(100bp ladder)

具体实施方式

实施例1

1.GFAT1基因的克隆：

(1)引物设计：

用人GFAT1基因cDNA(GenBank收录号：NM_002056)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为85％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计四对引物GF-A₁和GF-B₁，GF-A₂和GF-B₂，GF-A₃和GF-B₃，以及GF-A₄和GF-B₄扩增得到四条片段A₁B₁；A₂B₂；A₃B₃和A₄B₄(如表3所示)。将PCR产物回收纯化后克隆测序，序列拼接获得猪GFAT1基因的完整编码区序列及部分非翻译区序列。

表3用于GFAT1基因cDNA克隆的引物序列

引物标号	引物序列(5′-3′)	退火温度	预期PCR产物长度(bp)	引物设计所依据的序列
					GF-A<sub>1</sub>GF-B<sub>1</sub>	GCCACTCGCTGTTTCCTGTGCTGGTATCTTGACTTTCCCG	62℃	约547	EST重叠群

GF-A<sub>2</sub>GF-B<sub>2</sub>	CGCATAATGGAATCATCACCGCTTCCTTTCTTATCCTTGC	58℃	约398	EST重叠群
					GF-A<sub>3</sub>GF-B<sub>3</sub>	GCGAGGATAAGAAAGGAAGCGCCCAGCATTGATGTGAACT	62℃	约716	EST重叠群
GF-A<sub>4</sub>GF-B<sub>4</sub>	TACTGTAAGGAGAGAGGAGCTCAGATTCAAGTAGAGGACC	60℃	约1038	EST重叠群

(2)反转录PCR扩增反应：

利用TRIzoL试剂盒(购自美国GIBCO公司)从成年“鄂西黑猪”(一种具有中国地方猪血缘的地方猪种)肌肉组织中提取总RNA，具体操作方法参照试剂盒说明书的方法进行。

cDNA第一链的的合成：反应总体积为50μl，首先将2μg总RNA与oligo d(T)₁₁混合于一Ependorff管中，70℃温育5min以解除RNA的二级结构，立即置于冰上冷却以避免二级结构的重新生成，经短暂离心后按照表4的加样条件加入其余组分，于37℃温育1h后将温度升至95℃灭活反转录酶，置于-20℃保存备用。

PCR反应：反应总体积为20μl，各组分的加样体积及终浓度如表5所述。PCR扩增程序是94℃3min，94℃ 30s，退火45s，72℃ 1min，循环35次，最后72℃延伸5min，退火温度见表3。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

表4反转录反应体系                             表5PCR反应体系

(3)PCR产物的纯化、克隆和测序

在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml Resin，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minicolumn挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

将纯化PCR产物与pGEM-T载体(购自Promega公司)的连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T载体，0.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T₄连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。

感受态细胞的制备是从37℃培养了16～20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD₆₀₀达到0.3～0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10～15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

序列测定策略是每个片段均同时采用PCR产物直接测序和克隆测序两种方法。克隆测序是挑取单个克隆子用于测序，序列测定由上海博亚生物技术公司完成，每个基因片段至少测两个克隆子。

(4)DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。

2.物理定位：

(1)用于物理定位的引物序列是

GFAT1-P：PL 5′-TGACTTAGAGACCTGGCACAC-3′

         PR 5′-CTGACGGGCATCAACTTATC-3′

该引物扩增片段长度为490bp。

(2)用于物理定位的实验材料

用猪×啮齿类体细胞杂种板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)进行染色体区域定位，用美国Minnesota大学共同构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，IMpRH)进行染色体精确定位，两套体细胞杂种板均由法国Martin Yerle博士(Laboratoire de GénétiqueCellulaire，INRA，Castanet-Tolosan，France)惠赠。

其中SCHP包括27个体细胞杂种细胞系，1-19号是猪×仓鼠体细胞杂种细胞系，20-27号是猪×小鼠体细胞杂种细胞系，并以仓鼠、小鼠和猪基因组DNA作为阳性对照。经细胞遗传学鉴定该杂种板保留了猪的除Y染色体外的全部18条常染色体以及X染色体，其中含有127个非重叠的染色体区域，各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)获得。

IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpRH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29.3％，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理论分辨率是145kb。

(3)PCR分型条件

进行扩增的PCR反应总体积为15μl，其中模板DNA为20ng，含1×buffer(购自Promega公司)，1.5mmol/LMgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃4min，循环35次94℃30s，62℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.PCR-RFLP诊断方法建立

(1)引物序列

GFAT1：PL 5′-AGCCCTCTGTTGATTGGTGT-3′

       PR 5′-CCCACCGTGTGAATTTTGAT-3′

该引物扩增片段长度310bp。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(购自Promega公司)，1.5mmol/LMgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃4min，循环34次94℃30s，58℃30s，72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

(3)RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3~5μl，限制性内切酶MvaI为0.5μl(5U)，用双蒸水补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

3.标记性状关联分析的应用

(1)利用申请人所在的农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室、湖北省通城县畜牧局和湖北省通城县种畜场合作组建的试验猪群中的“通城”(一个具有中国地方猪血缘的猪种)纯种群体、大白(外国血缘)纯种、长白(外国血缘)纯种、长大通(中外杂交品种)和大长通(中外杂交品种)做性状关联分析的应用，取124个DNA样品作基因型检测。分析的性状有部分生产性能，部分胴体性状。运用SAS Vergion8.1软件中GLM程序按以下模型进行基因型和性状间的关联分析。分析有两个步骤，先建立如下模型剔除所有系统效应：

y_ijkl＝μ+S_j+C_k+ε_ijkl，

其中，y_ijkl为性状观察值，μ为总体均数，S_j为性别效应，C_k为组合效应，ε_ijkl为随机误差，假定独立且服从N(0，σ²)分布。用最小二乘分析获得每一个体的残差，以残差做为新的性状值进一步进行基因型的单因素方差分析及多重比较检验。

y_ij＝μ+GENOTYPE_i+e_ij

其中，y_ij是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPE_i为基因型效应，e_ij为随机误差。

(2)利用广东华农温氏畜牧股份有限公司的清远和水台两个原种猪场提供的长白(国外血缘)和大白(国外血缘)猪群做性状关联分析，分别有112和186个DNA样品用于基因型检测。所分析的性状有部分生产性能，部分胴体性状。运用SAS Vergion 8.1软件中GLM程序进行基因型和性状间的关联分析。具体模型如下：

y_ijklm＝μ+L_j+L(B)_k+G_l+S_k+ε_ijklm，

其中，y_ijklm为性状观察值，μ为总体均数，L_j为场间效应，L(B)_k为同一个场中品种或品系效应，G_l为基因型效应，S_k为性别效应，ε_ijklm为随机误差，假定独立且服从N(0，σ²)分布。

实施例2PCR-RFLP-MvaI多态性在各猪品种中的分布情况

利用PCR-MvaI-RFLP检测了五个猪群：通城纯种(中国地方猪血缘)群体、大白纯种(外国血缘)、长白纯种(外国猪血缘)、长大通(中外杂交猪血缘)和大长通(中外杂交猪血缘)，各猪群的基因频率如表6所示，GFAT1基因各基因型在长白、大长通猪种都有分布，大白和长大通猪中没有检测到GG纯合基因型，在通城猪中只有AA纯合基因型。

表6GFAT1基因PCR产物基因型频率及基因频率

实施例3猪标记性状关联分析的应用

在一个通城猪群中对猪GFAT1基因第8内含子MvaI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，所分析的性状是胴体直长和臀中肌中点处膘厚。分析结果表明，GA与GG基因型的胴体直长和臀中肌中点处膘厚呈显著性差异(P＜0.05)(表7)

由表7可知，G等位基因是胴体直长、臀中肌中点处膘厚的有利标记(胴体长、臀膘薄)，GG基因型标记可用于同时提高体长和降低臀中肌中点处膘厚的选择标记。

表7不同GFAT1基因MvaI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	个体数	胴体直长(cm)	臀中肌中点处膘厚(mm)
				AA	51	92.298±0.450<sup>ab</sup>	2.178±0.087<sup>ab</sup>
GA	38	93.311±0.507<sup>a</sup>	2.289±0.098<sup>a</sup>
				GG	6	90.372±1.284<sup>b</sup>	1.691±0.248<sup>b</sup>

注：同列含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母，表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极为显著(P＜0.01)

实施例4PCR-RFLP-MvaI多态性在广东华农温氏畜牧股份有限公司的清远和水台两个原种猪场的大白和长白猪群中的分布情况

利用PCR-MvaI-RFLP分别检测了广东华农温氏畜牧股份有限公司的广东清远原种猪场和水台原种猪场的大白和长白猪群，各猪群的基因频率如表8所示，GFAT1基因各基因型在大白(清远)、大白(水台)、长白(水台)猪种都有分布，长白(清远)猪中没有检测到GG纯合基因型。

表8GFAT1基因PCR产物基因型频率及基因频率

实施例5猪标记性状关联分析的应用

在广东华农温氏畜牧股份有限公司的广东清远原种猪场和水台原种猪场的大白和长白猪群中对猪GFAT1基因第8内含子MvaI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，所分析的性状是体长、体高、瘦肉率、校正背膘厚、0-100kg日增重、30-100kg日增重和达100kg日龄体重。由于这两个种猪场纯种猪来源不同，品系特点差别较大。水台原种猪场的纯种猪均是法系长白、大白猪，而清远原种猪场的纯种猪主要有美系和加系长白、大白，故分析时不仅要考虑品种或品系间的效应，还要考虑两个场间的效应。分析结果表明，AA与GG基因型的瘦肉率和校正背膘厚呈显著性差异(P＜0.05)(表9)。

由表可知，G等位基因是瘦肉率、校正背膘厚的优势等位基因(瘦肉率高、校正背膘厚薄)，GG基因型标记可用于同时提高瘦肉率和降低校正背膘厚的选择标记。

表9不同GFAT1基因MVaI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	个体数	瘦肉率(cm)	校正背膘厚(mm)
				AA	161	63.2023664±0.1756344<sup>a</sup>	14.3928255±0.1779203<sup>a</sup>
GA	114	63.6662577±0.2195804<sup>ab</sup>	13.9189154±0.2224382<sup>ab</sup>
				GG	23	64.1059016±0.4253155<sup>b</sup>	13.3915863±0.4308509<sup>b</sup>

注：同列含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母，表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极为显著(P＜0.01)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>猪胴体性状GFAT1基因的克隆及应用

<130>

<141>2007-07-18

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2434

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2434)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(41)..(2140)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(1)..(2434)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(2415)..(2434)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1397)..(1416)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1477)..(1496)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(780)..(799)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(404)..(421)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(527)..(547)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(19)

<223>

<400>1

gcc act cgc tgt ttc ctg tgc cga ccg tgc ctc ctg cat cat gtg cgg    48

Ala Thr Arg Cys Phe Leu Cys Arg Pro Cys Leu Leu His His Val Arg

1               5                   10                  15

tat att tgc tta ctt aaa cta cca tgt tcc tcg cac aag acg aga aat    96

Tyr Ile Cys Leu Leu Lys Leu Pro Cys Ser Ser His Lys Thr Arg Asn

            20                  25                  30

ctt gga gac cct aat caa agg cct tca gag act gga gta cag agg ata    144

Leu Gly Asp Pro Asn Gln Arg Pro Ser Glu Thr Gly Val Gln Arg Ile

        35                  40                  45

tga ttc tgc tgg tgt ggg agt tga tgg agg caa tga caa aga ttg gga    192

    Phe Cys Trp Cys Gly Ser     Trp Arg Gln     Gln Arg Leu Gly

        50                      55                      60

agc caa tgc ctg caa aat cca act cat taa gaa gaa ggg aaa agt taa    240

Ser Gln Cys Leu Gln Asn Pro Thr His     Glu Glu Gly Lys Ser

            65                  70                      75

ggc act gga tga aga agt tca caa aca aca aga tat gga ttt gga tat    288

Gly Thr Gly     Arg Ser Ser Gln Thr Thr Arg Tyr Gly Phe Gly Tyr

                    80                  85                  90

aga att tga tgt aca cct tgg gat agc tca tac ccg ttg ggc aac gca    336

Arg Ile     Cys Thr Pro Trp Asp Ser Ser Tyr Pro Leu Gly Asn Ala

                    95                  100                 105

tgg aga acc caa tcc tgt caa tag cca tcc cca gcg ctc tga taa aaa    384

Trp Arg Thr Gln Ser Cys Gln     Pro Ser Pro Ala Leu         Lys

                110                     115

taa tga att tat tgt tat tca taa tgg aat cat cac caa cta taa aga    432

        Ile Tyr Cys Tyr Ser     Trp Asn His His Gln Leu     Arg

            120                     125                     130

ctt gaa aaa gtt ttt gga aag caa agg cta tga ctt tga gtc tga aac    480

Leu Glu Lys Val Phe Gly Lys Gln Arg Leu     Leu     Val     Asn

                135                 140

aga cac aga gac aat tgc caa gct tgt taa ata cat gta tga caa tcg    528

Arg His Arg Asp Asn Cys Gln Ala Cys     Ile His Val     Gln Ser

    145                 150                     155

gga aag tca aga tac cag ttt tac tac ctt ggt gga gag agt cat cca    576

Gly Lys Ser Arg Tyr Gln Phe Tyr Tyr Leu Gly Gly Glu Ser His Pro

        160                 165                 170

aca att gga agg tgc ttt tgc act tgt att taa aag tgt tca ttt tcc    624

Thr Ile Gly Arg Cys Phe Cys Thr Cys Ile     Lys Cys Ser Phe Ser

    175                 180                     185

tgg cca agc agt tgg cac aag act agg tag ccc tct atc gat tgg tgt    672

Trp Pro Ser Ser Trp His Lys Thr Arg     Pro Ser Ile Asp Trp Cys

    190                 195                     200

acg aag tga aca taa gct ctc tac tga tca cat tcc aat act cta cag    720

Thr Lys     Thr     Ala Leu Tyr     Ser His Ser Asn Thr Leu Gln

    205                             210                 215

aac agc tag gac tca gat tgg atc aaa att cac acg gtg ggg atc aca    768

Asn Ser     Asp Ser Asp Trp Ile Lys Ile His Thr Val Gly Ile Thr

                220                 225                 230

ggg aga aag agg caa gga taa gaa agg aag ctg caa tct ctc tcg tgt    816

Gly Arg Lys Arg Gln Gly     Glu Arg Lys Leu Gln Ser Leu Ser Cys

            235                     240                 245

gga cag cac aac ttg tct ttt ccc tgt tga aga aaa agc agt gga gta    864

Gly Gln His Asn Leu Ser Phe Pro Cys     Arg Lys Ser Ser Gly Val

        250                     255                     260

tta ctt tgc ttc tga tgc atg tgc tgt cat aga aca tac caa tcg cgt    912

Leu Leu Cys Phe     Cys Met Cys Cys His Arg Thr Tyr Gln Ser Arg

            265                     270                 275

cat ctt tct tga aga cga tga tgt cgc agc agt ggt aga cgg ccg tct    960

His Leu Ser     Arg Arg     Cys Arg Ser Ser Gly Arg Arg Pro Ser

                280                     285                 290

ttc tat cca tcg aat taa acg gac tgc ggg aga tca ccc tgg acg tgc    1008

Phe Tyr Pro Ser Asn     Thr Asp Cys Gly Arg Ser Pro Trp Thr Cys

                295                     300                 305

tgt gca gac cct cca gat gga gct gca gca gat cat gaa ggg caa ctt    1056

Cys Ala Asp Pro Pro Asp Gly Ala Ala Ala Asp His Glu Gly Gln Leu

                310                 315                 320

cag ttc gtt tat gca gaa gga aat ttt tga gca gcc tga gtc agt tgt    1104

Gln Phe Val Tyr Ala Glu Gly Asn Phe     Ala Ala     Val Ser Cys

            325                 330                         335

gaa cac aat gag agg aag agt caa ctt tga tga tta tac tgt gaa ttt    1152

Glu His Asn Glu Arg Lys Ser Gln Leu         Leu Tyr Cys Glu Phe

                340                         345

ggg agg ttt gaa gga tca cat taa gga aat cca gag gtg tcg gcg ctt    1200

Gly Arg Phe Glu Gly Ser His     Gly Asn Pro Glu Val Ser Ala Leu

350                 355                     360

aat cct tat tgc ttg cgg aac aag tta tca tgc tgg tgt agc gac gcg    1248

Asn Pro Tyr Cys Leu Arg Asn Lys Leu Ser Cys Trp Cys Ser Asp Ala

365                 370                 375                 380

tca agt tct tga aga gct gac tga gct gcc tgt tat ggt gga gct agc    1296

Ser Ser Ser     Arg Ala Asp     Ala Ala Cys Tyr Gly Gly Ala Ser

                    385                     390

cag tga ttt cct gga tag aaa tac acc agt ttt tcg aga tga tgt ttg    1344

Gln     Phe Pro Gly     Lys Tyr Thr Ser Phe Ser Arg     Cys Leu

395                         400                 405

ctt ttt cat tag tca atc agg tga gac agc aga tac cct gat ggg tct    1392

Leu Phe His     Ser Ile Arg     Asp Ser Arg Tyr Pro Asp Gly Ser

        410                         415                 420

ccg gta ctg taa gga gag agg agc ttt aac tgt ggg gat cac aaa cac    1440

Pro Val Leu     Gly Glu Arg Ser Phe Asn Cys Gly Asp His Lys His

                425                 430                 435

agt cgg cag ttc cat atc aag aga gac aga ctg tgg agt tca cat caa    1488

Ser Arg Gln Phe His Ile Lys Arg Asp Arg Leu Trp Ser Ser His Gln

            440                 445                 450

tgc tgg gcc gga gat tgg cgt ggc cag cac aaa ggc ata cac cag cca    1536

Cys Trp Ala Gly Asp Trp Arg Gly Gln His Lys Gly Ile His Gln Pro

        455                 460                 465

gtt tgt gtc cct tgt gat gtt tgc cct tat gat gtg tga tga cag gat    1584

Val Cys Val Pro Cys Asp Val Cys Pro Tyr Asp Val         Gln Asp

    470                 475                 480

ctc cat gca gga gag acg caa aga gat cat gct tgg att gaa gcg gct    1632

Leu His Ala Gly Glu Thr Gln Arg Asp His Ala Trp Ile Glu Ala Ala

        485                 490                 495

gcc tga ttt gat taa gga agt ttt gag cac gga tga tga aat tca aaa    1680

Ala     Phe Asp     Gly Ser Phe Glu His Gly         Asn Ser Lys

        500                     505                         510

act ggc aac aga act tta tca tca gaa gtc ggt ctt gat aat ggg acg    1728

Thr Gly Asn Arg Thr Leu Ser Ser Glu Val Gly Leu Asp Asn Gly Thr

                515                 520                 525

tgg cta tca tta tgc tac ttg tct tga agg ggc cct gaa aat caa aga    1776

Trp Leu Ser Leu Cys Tyr Leu Ser     Arg Gly Pro Glu Asn Gln Arg

            530                     535                 540

aat cac tta cat gca ctc tga agg tat cct tgc tgg tga gtt gaa gca    1824

Asn His Leu His Ala Leu     Arg Tyr Pro Cys Trp     Val Glu Ala

            545                 550                         555

cgg ccc cct ggc ttt ggt gga taa gtt gat gcc cgt cat cat gat cat    1872

Arg Pro Pro Gly Phe Gly Gly     Val Asp Ala Arg His His Asp His

                560                     565                 570

cat gag aga tca cac cta cgc caa gtg cca gaa tgc tct tca gca ggt    1920

His Glu Arg Ser His Leu Arg Gln Val Pro Glu Cys Ser Ser Ala Gly

                575                 580                 585

ggt tgc tag gca ggg aag gcc agt ggt gat ctg tga taa gga aga cac    1968

Gly Cys     Ala Gly Lys Ala Ser Gly Asp Leu         Gly Arg His

                590                 595

tga gac cat taa gaa cac caa acg aac aat caa ggt gcc cca ctc ggt    2016

    Asp His     Glu His Gln Thr Asn Asn Gln Gly Ala Pro Leu Gly

    600                     605                 6l0

gga ctg cct gca ggg cat tct cag cgt cat ccc gct aca gtt gct ggc    2064

Gly Leu Pro Ala Gly His Ser Gln Arg His Pro Ala Thr Val Ala Gly

    615                 620                 625

ctt cca cct ggc tgt gct cag agg cta tga tgt tga ttt ccc ccg gaa    2112

Leu Pro Pro Gly Cys Ala Gln Arg Leu     Cys     Phe Pro Pro Glu

630                 635                         640

tct tgc caa atc ggt aac cgt aga ata agg agc atc tga gat tgg gcg    2160

Ser Cys Gln Ile Gly Asn Arg Arg Ile Arg Ser Ile     Asp Trp Ala

    645                 650                 655

att aag caa cac aag aca cct ttt gta ttt aaa acc ttg att taa aat    2208

Ile Lys Gln His Lys Thr Pro Phe Val Phe Lys Thr Leu Ile     Asn

    660                 665                 670

atc acc cct cta agc ctt ttt taa gta aat cct tat tta tat atc agt    2256

Ile Thr Pro Leu Ser Leu Phe     Val Asn Pro Tyr Leu Tyr Ile Ser

    675                 680                     685

aat aat tat tcc att caa ttt gtg act ttt gtg aaa tta cct cct att    2304

Asn Asn Tyr Ser Ile Gln Phe Val Thr Phe Val Lys Leu Pro Pro Ile

    690                 695                 700

ttt cca gta agt tgt gag gga gtt taa ata atg caa tct ata ttg gta    2352

Phe Pro Val Ser Cys Glu Gly Val     Ile Met Gln Ser Ile Leu Val

705                 710                     715

ttg gta tca gaa aga gat tta gct ctc att ttc ttt aaa cga tgc tga    2400

Leu Val Ser Glu Arg Asp Leu Ala Leu Ile Phe Phe Lys Arg Cys

720                 725                 730

gta ttg gat tta tgg gtc ctc tac ttg aat ctg a                      2434

Val Leu Asp Leu Trp Val Leu Tyr Leu Asn Leu

735                 740                 745

<210>2

<211>310

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(310)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(291)..(310)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(275)..(310)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(1)..(73)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(74)..(274)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(101)..(101)

<223>

<400>2

agc cct cta ttg att ggt gta cga agt gaa cat aag ctc tct act gat       48

Ser Pro Leu Leu Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp

1               5                   10                  15

cac att cca ata ctc tac aga aca g gtaaaaacta ttcctacatc               93

His Ile Pro Ile Leu Tyr Arg Thr

            20

atgccagggg gaaaatgtat catttgaatg caggaggtct aaagaattgt tttccctaaa    153

ttgaataaat gcccctttgg tcagatccac tcatatatat atagttctgt ctagatatga    213

aaaggatttg tttttgtgat ttctctgacg agtagaattt tcttctgttg tatatcctta    273

g ct  agg act cag att gga tca aaa ttc aca cgg tgg g                  310

  Ala Arg Thr Gln Ile Gly Ser Lys Phe Thr Arg Trp

                      30                  35

Claims (6)

1、一种作为分子标记的猪胴体性状GFAT1基因，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所述，在序列表SEQ ID NO：2的第101bp处有一个G101-A101的碱基突变，导致MvaI-RFLP多态性。

2、根据权利要求1所述的猪胴体性状GFAT1基因，其中克隆GFAT1基因所用的引物序列如下所示：

GF-A₁ 5′GCCACTCGCTGTTTCCTGT 3′；

GF-B₁ 5′GCTGGTATCTTGACTTTCCCG 3′；

GF-A₂ 5′CGCATAATGGAATCATCACC 3′；

GF-B₂ 5′GCTTCCTTTCTTATCCTTGC 3′；

GF-A₃ 5′GCGAGGATAAGAAAGGAAGC′：

GF-B₃ 5′GCCCAGCATTGATGTGAACT 3′；

GF-A₄ 5′TACTGTAAGGAGAGAGGAGC 3′；

GF-B₄ 5′TCAGATTCAAGTAGAGGACC 3′。

3、根据权利要1所述的猪胴体性状GFAT1基因，其中扩增GFAT1基因第8内含子所用的引物序列如下所示：

GFAT1：PL 5′-AGCCCTCTGTTGATTGGTGT-3′；

       PR 5′-CCCACCGTGTGAATTTTGAT-3′。

4、权利要求1所述的猪胴体性状GFAT1基因在猪分子标记辅助选择中的应用。

5、权利要求2或3所述的引物在猪分子标记辅助选择中的应用。

6、一种筛选猪胴体性状关联的分子标记的方法，按照以下步骤制备：第一步

用人GFAT1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性85％以上的表达序列标签；然后拼接猪表达序列标签-重叠群；根据表达序列标签-重叠群设计如权利要求2所示的四对引物，扩增得到目的片段；以成年鄂西黑猪肌肉组织提取总RNA为模板，作RT-PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列；

第二步

从猪血液基因组提取DNA，以猪GFAT1基因cDNA序列为模板设计引物，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所述核苷酸序列，应用PCR-RFLP方法检测猪GFAT1基因的多态性。

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