CN101586164B - 猪wfikkn2基因作为胴体性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪胴体性状相关的分子标记的制备及应用，所述的猪胴体性状涉及屠宰率，内脂率和眼肌面积相等相关性状。本发明制备的分子标记从猪WFIKKN2基因中克隆得到，所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在序列表SEQ ID NO：1的第109bp处有一个G109-A109的碱基突变，导致Eco72I-RFLP多态性。本发明为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

猪WFIKKN2基因作为胴体性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记制备领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与胴体性状相关的分子标记的制备及应用。

背景技术

猪胴体性状一直是猪遗传改良的目标性状，是重要的经济性状之一。胴体性状主要有背膘厚度、胴体长度、眼肌面积、腿臀比例、胴体瘦肉率等。屠宰率和胴体瘦肉率高的猪能带来更高的经济效益。由于胴体性状无法进行活体测定，常规育种方法对这类性状的改良无法实施个体选择，往往采用同胞选择进行改良，其改良效果往往不佳。近年来随着猪QTL和分子标记的研究进展以及标记辅助选择在育种中的应用，猪胴体性状的改良速度得到了很大的提高。但是猪的胴体性状是一类数量性状是受多基因控制的，目前的研究还仅仅发现少数控制胴体性状的基因和分子标记，大量的候选基因和分子标记还有待进一步发现。

目前与猪胴体性状相关的QTL几乎分布于猪的所有染色体，通过功能候选基因法或位置克隆的策略筛选了一些与胴体性状相关的分子标记。目前已发现许多与胴体性状存在显著关联的基因：瘦素受体(Leptinreceptor，LEPR)基因和心脏脂肪酸结合蛋白(Heart fatty acid binding protein，H-FABP)是猪6号染色体上影响背膘厚度，肌内脂肪含量和眼肌面积等QTL区域候选基因，连锁分析表明H-FABP和LEPR基因位于SSC685.4cM和107cM位置，PCR-RFLP分析表明H-FABP基因单核苷酸多态与肌内脂肪和眼肌面积显著相关，LEPR基因单核苷酸多态与背膘厚和肌内脂肪是显著相关的(G.Muz et al，J.Anim.Sci.，2009，87：459-468；Cristina

et al.，Genet.Sel.Evol.，2002，34：465-479)。Lpin1，Lpin2和Lpin3是与脂肪代谢相关的三个基因，属于一个基因家族，猪上分别位于3q21-27，6q24-(1/2)q31和17(1/2)q21-q23，PCR-RFLP表明Lpin1基因第二外显子的C93T单核苷酸突变与板油率和肌内脂肪这两个胴体性状相关(Bang Liuet al，Investigation of Lpin1 as a candidate gene for fat deposition in pigs.Mol.Biol.Rep，2009，36：1175-1180；Bang Liu et al，Molecular characterization，chromosomal localization andassociation analysis with back-fat thickness of porcine LPIN2 and LPIN3.Mol.Biol.Rep.，2008Nov 7，DOI 10.1007/s11033-008-9385-2)。原发性心肌症相关蛋白1和4(cardiomyopathy-associated 1 and1，CMYA1和CMYA4)基因定位于猪SSC13和SSC12分别SW344与SW62微卫星标记紧密相连的区域。CMYA1基因编码区一个同义突变c.1053C＞T和三个错义突变：c.1394A＞G(p.His 465Arg)，c.1751A＞G(p.Asp582Gly)和c.3290C＞A(p.Thr1097Asp)关联分析结果表明与不同背膘后存在显著相关；CMYA4基因第十五内含子上A558G单核苷酸突变产生一个MspI酶切位点，性状关联分析结果与六七肋骨背膘厚和肩膘厚存在显著相关(BangLiu et al，Molecular characterization，expression and association analysis of the porcine CMYA4gene with carcass traits.J.Anim.Breed Genet.，2008 Aug，125(4)：234-239；Bang Liu et al.，Porcineskeletal muscle differentially expressed gene CMYA1：isolation，characterization，mapping，expression and association analysis with carcass traits.Anim.Genet.，2009 Jun，40(3)：255-261)。

WFIKKN2(又名growth and differentiation factor-associated serum proein-1，Gasp1)基因编码蛋白是通过亲和纯化和质谱的方法在正常的老鼠和人的血清中发现的一个与内源肌肉生长抑制素(Myostatin)相关的蛋白，在鼠的骨骼肌和心脏中表达最高，在肝脏和肾脏中表达相对较低，在脑、脾、肺、睾丸等组织也有表达，该基因编码的蛋白具有5个保守蛋白酶抑制剂结构域，能通过抑制对碱性蛋白酶活性来阻止Myostatin的加工，使Myostatin处于失活的前体状态，而Myostatin是肌肉发育负调控因子。猪中该基因定位在12p11，与微卫星SSC8F12(LOD＝9.86，43cR)和SW874(LOD＝6.74，59cR)紧密连锁，目前已经报道很多猪12号染色体上与背膘厚，眼肌面积等胴体性状相关QTL，根据位于该区域的QTL有眼肌面积，肌纤维数目，肌纤维直径，胸腰椎间背膘厚，脂肪比率等与胴体性状相关的QTL。由上述资料我们不难发现WFIKKN2基因在肌肉发育过程中具有重要作用，因此我们开展猪WFIKKN2基因的克隆和SNP筛查、检测及与性状关联分析等相关工作。

发明内容

本发明的目的在于克隆一种作为猪标记辅助选择的与胴体性状相关的分子标记，为猪标记辅助选择育种提供有用的分子标记。

本发明通过以下技术方案实现：

从猪WFIKKN2基因片段中克隆得到一种作为猪标记辅助选择的与胴体性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在序列表的第109bp处有一个G109-A109的突变，导致Eco72I-RFLP多态性。

申请人制备了扩增如序列表SEQ ID NO：1所述G109-A109的碱基突变的引物对，该引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′，

反向引物：5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′。

申请人设计了四对克隆猪WFIKKN2基因组序列的引物，这四对引物扩增的DNA序列拼接结果如附图3所示。

申请人提供了一种制备上述分子标记的方法，它按照以下步骤实施：

用人和鼠WFIKKN2基因mRNA进行序列比对，用获得的保守序列作为模版，根据该模版设计引物，用成年中国地方猪“通城猪”血样提取总DNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序如图2所示的cDNA序列和图3所示的基因组核苷酸序列。

应用常规的PCR-RFLP的方法对序列SEQ ID NO：1所示的第109位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪胴体性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明制备的猪基因WFIKKN2与胴体性状相关的分子标记的核苷酸序列；

图1：是本发明的分子标记的制备流程图；

图2：是本发明中获得猪WFIKKN2基因用于克隆的CDS片段；

图3：本发明用于筛查SNP的DNA片段；

图4：本发明筛查SNP的测序峰图；

图5：是本发明中猪WFIKKN2基因Eco72I-RFLP的三种基因型(GG AG AA)电泳结果。图中Marker：DNA分子量标准(DL2000 ladder)。

具体实施方式

实施例1、WFIKKN2基因的克隆

1、引物设计

用人(GenBank收录号：NM_175575.4)和鼠(GenBank收录号：NM_181819.1)WFIKKN2基因mRNA用DNAstar进行两序列比对获得一保守序列，利用获得保守序列设计一对引物扩增WFIKKN2基因第二外显子序列，该引物对的DNA序列如下所示：

WFIKKN2：W2-F1 5′-AGGGCTCTGAGTGTGACATCTGG-3′

         W2-R1 5′-TCCTTGAGGACGTCACAGGTCTT-3′

2、PCR产物的克隆和测序

将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体(购自Promega公司)在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将7μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，后冰浴3-4min，加入450μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于带有氨苄抗生素平板，37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于1ml LB中，37℃220r/min培养过夜。取1μl菌液PCR扩增验证后，用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上对重组质粒采进行测序，序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成。用DNASTAR软件中的Seqman程序进行拼接，得到一条长度为1357bp的CDs序列。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该CDs序列的功能信息。检索结果表明所测序列与人WFIKKN2基因mRNA(GenBank收录号：NM_175575.5)的部分序列同源性达90％。

3、基因组序列获得

利用人鼠保守序列和已经获得CDs序列信息，设计一对引物，扩增得到包含唯一内含子和部分第一外显子的序列，引物对的DNA序列如下：

WFIKKN2：W2-F2 5′-ACGACATGAATCCCAACCTCT-3′

         W2-R2 5′-TGCTTCTCCCAAGTGATCTCT-3′

将纯化后PCR产物进行上述克隆测序以及生物信息学分析鉴定，再用已经获得基因组序列在NCBI猪记HTG基因组数据库中进行检索，获得了一条同源性达98％的未注释的猪基因组序列(GenBank收录号：CU929570.2)，将获得序列，进行内含子外显子分析，并找到相应读码框架。利用该序列设计两对引物获得了WFIKKN2基因完整编码区(见图2所示)。相应引物对的DNA序列如下：

WFIKKN2：W2-F3 5′-GATACGCCGCCTAAACTGCTTCC-3′

         W2-R3 5′-GGCTTCCAGATTCGCACTCACC-3′

         W2-F4 5′-GATACGCCGCCTAAACTGCTTCC-3′

         W2-R4 5′-GGCTTCCAGATTCGCACTCACC-3′

实施例2、WFIKKN2基因SNP的筛查和PCR-RFLP诊断方法的建立

1、SNP的筛查

运用W2-F1/W2-R1和W2-F2/W2-R2引物分离猪基因组片段，通过在不同猪种(包括中国地方猪种和国外猪种)的基因组中扩增，通过回收获得PCR产物pool送北京奥科生物技术有限公司测序，发现在该基因编码区(见附图2)的第342位碱基处有一个G-A的碱基突变(即与序列表SEQ ID NO的G109-A109的突变相同)，导致Eco72I-RFLP多态性。测序结果如图4所示。

基因组测序的引物对的DNA序列如下：

WFIKKN2：W2-F1 5′-AGGGCTCTGAGTGTGACATCTGG-3′/W2-R1 5′-TCCTTGAGGACGTCACAGGTCTT-3′

         W2-F2 5′-ACGACATGAATCCCAACCTCT-3′/  W2-R2 5′-TGCTTCTCCCAAGTGATCTCT-3′

2、PCR-RFLP诊断方法的建立

(1)、扩增SEQ ID NO：1的引物对的DNA序列如下：

WFIKKN2：WSNP2-F 5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′

         WSNP2-R 5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′

(2)、PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(购自宝生物工程(大连)有限公司，TaKaRa)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，0.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环38次94℃30s，61℃30s，然后72℃15s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到289bp特异扩增片段，该片段位于第二外显子内(如图2)。测序的结果发现在该289bp片段中存在一个Eco72I酶切位点(CA↓CGTG)，其中第109bp处为多态性切点，位于第二外显子中。

(3)、PCR-RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶Eco72I为0.1μl(10U)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，凝胶成像系统中拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第109bp位置是A109时，则该Eco72I酶切位点不存在，Eco72I酶切后检测结果只有1个片段，长度是289bp(定为等位基因A)；但存在A109→G109的替换时，其结果导致第109bp处一个Eco72I酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为109bp和181bp(定为等位基因G)，三种基因型GG，GA，AA如图5所述。

(4)、本发明的分子标记在猪肉质性状标记性状关联分析中的应用

试验共检测了153个猪个体：中国地方猪“通城纯种”31头，外来猪“大白纯种”32头，“长白纯种”27头，中国地方猪与外来猪的杂交猪“大长通”(大白×(长白×通城))31头、“长大通”(长白×(大白×通城))32头的多态，确定其基因型，并进行基因型与生产性状(出生至上市平均日增重、胴体直长、胴体斜长、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、滴水损失、肌肉pH值、肌内脂肪含量、肉色、眼肌面积、臀部膘厚)的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：

y_ijk＝μ+G_i+C_j+P_k+B_j+ε_ijk

其中，y_ijk是性状观察值，μ为总体均数，G_i为基因型效应，C_j为品种效应，P_k为父本效应，B_j为批次效应，ε_ijk为随机误差，假定ε_ijk相互独立，服从N(0，σ²)分布。基因型检测结果表明在153个个体中AA基因型有29个个体，AG基因型有70个个体，GG基因型有54个个体。基因型与性状关联分析的结果是：WFIKKN2基因与屠宰率，内脂率和眼肌面积呈显著相关，见表1。

由表1可知，WFIKKN2基因SNP位点对屠宰率，内脂率和眼肌面积有显著影响(P＜0.05)，此位点对其它胴体性状没有显著影响。

表1：WFIKKN2基因Eco72I-RFLP多态不同基因型与部分肉质性状的关联分析

对屠宰率，内脂率和眼肌面积有显著影响(P＜0.05)的WFIKKN2基因的SNP位点基因型的最小二乘均数如表2所示。

表2：SNP位点(WFIKKN2)基因型滴水损失和失水率的最小二乘均数

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。

表2表明，GG基因型个体的屠宰率，内脂率和眼肌面积都显著高于GA、AA基因个体的对应值，因此可以看出GG基因型个体的屠宰率，内脂率和眼肌面积较高。

序列表

<110>华中农业大学

<120>猪WFIKKN2基因作为胴体性状相关的分子标记及应用

<130>

<141>2009-06-16

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>289

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(289)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(270)..(289)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(23)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(109)..(109)

<223>

<400>1

ctatgagaag tgctgtccca acgtgtgcgg gaccaagagc tgtgtggcag cccgctacat     60

ggacgtgaag gggaagaagg gccctgtggg catgcccaag gaggccacgt gcgaccactt    120

catgtgtctg cagcagggct ccgagtgtga cacctgggat ggccagcccg tgtgcaagtg    180

cagagaccgc tgcgagaagg agcccagctt tacctgcgcc tccgacggcc ttacctacta    240

taaccgctgc tacatggacg ccgaggcctg ctccaaaggc atcaccctg                289

Claims (3)

1.一种克隆的猪WFIKKN2基因片段，其核苷酸序列如下所述：

ctatgagaagtgctgtcccaacgtgtgcgggaccaagagctgtgtggcagcccgctacatggacgtgaaggggaagaagggccctgtgggcatgcccaaggaggccacRtgcgaccacttcatgtgtctgcagcagggctccgagtgtgacacctgggatggccagcccgtgtgcaagtgcagagaccgctgcgagaaggagcccagctttacctgcgcctccgacggccttacctactataaccgctgctacatggacgccgaggcctgctccaaaggcatcaccctg；

在上述序列中的R是G或A，导致Eco72I-RFLP的多态性。

2.扩增权利要求1所述基因片段的引物对，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′，

反向引物：5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′。

3.权利要求1所述的基因片段在猪屠宰率，内脂率和眼肌面积标记辅助选择中的应用。

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