CN101955931B

CN101955931B - 猪板油率,内脂率和腿臀肉骨率相关基因Nudt6的分子标记及应用

Info

Publication number: CN101955931B
Application number: CN2010102786434A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 孙玲; 樊斌; 徐学文; 彭中镇
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-09-10
Also published as: CN101955931A

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与板油率，内脂率，腿臀肉骨率和眼肌面积性状相关Nudt6基因的分子标记及应用。所述的分子标记由Nudt6基因克隆得到，它的cDNA序列如SEQ ID NO：1所述。在SEQ ID NO：1序列的第169bp处有一个T169-C169的碱基替换，并通过设计引入酶切位点的突变引物方法(ACRS-PCR-RFLP)通过BclI酶切检测该SNP多态性。本发明还公开了扩增Nudt6基因部分cDNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

猪板油率,内脂率和腿臀肉骨率相关基因Nudt6的分子标记及应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率相关基因Nudt6的分子标记的制备及应用。本发明的分子标记与Nudt6基因有关。

背景技术

猪肉是我国人民摄取动物蛋白主要来源。在过去几十年间，随着人民生活水平提高，猪肉消费市场逐渐扩大，获得高经济效益猪种是猪肉生产者和猪育种努力方向。因此猪胴体性状成为猪遗传改良的目标性状，是重要的经济性状之一。胴体性状主要有屠宰率、背膘厚度、眼肌面积、腿臀比率、胴体瘦肉率、板油率和内脂率等。高的屠宰率和腿臀比率是获得较高经济效益保证。由于胴体性状无法进行活体测定，常规育种方法对这类性状的改良无法实施个体选择，往往采用同胞选择进行改良，其改良效果往往不佳，而相关分子标记的寻找是实现这一目标的重要手段。近年来随着猪QTL和分子标记的研究进展以及标记辅助选择在育种中的应用，猪胴体性状的改良速度得到了很大的提高。但是猪的胴体性状是一类数量性状是受多基因控制的，目前的研究还仅仅发现少数控制胴体性状的基因和分子标记，大量的候选基因和分子标记还有待进一步发现。

目前与猪胴体性状相关的QTL几乎分布于猪的所有染色体，并通过功能候选基因法或位置克隆的策略筛选了一些与胴体性状相关的分子标记。目前已发现许多与胴体性状存在显著关联的基因：瘦素受体(Leptin receptor，LEPR)基因和心脏脂肪酸结合蛋白(Heart fatty acid binding protein，H-FABP)是猪6号染色体上影响背膘厚度，肌内脂肪含量和眼肌面积等QTL区域候选基因，连锁分析表明H-FABP和LEPR基因位于SSC685.4cM和107eM位置，PCR-RFLP分析表明H-FABP基因单核苷酸多态与肌内脂肪和眼肌面积显著相关，LEPR基因单核苷酸多态与背膘厚和肌内脂肪是显著相关的(G.Muz et al，J.Anim.Sci.，2009，87：459-468；Cristina

et al.，Genet.Sel.Evol.，2002，34：465-479)。Lpin1，Lpin2和Lpin3是与脂肪代谢相关的三个基因，属于一个基因家族，猪上分别位于3q21-27，6q24-(1/2)q31和17(1/2)q21-q23，PCR-RFLP表明Lpin1基因第二外显子的C93T单核苷酸突变与板油率和肌内脂肪这两个胴体性状相关(Bang Liu et al，Investigation of Lpinl as a candidate gene for fat deposition in pigs.Mol.Biol.Rep，2009，36：1175-1180；Bang Liu et al，Molecular characterization，chromosomal localization and association analysis with back-fat thickness of porcine LPIN2 and LPIN3.Mol.Biol.Rep.，2008Nov 7，DOI 10.1007/s11033-008-9385-2)。原发性心肌症相关蛋白1和4(cardiomyopathy-associated 1 and 1，CMYA1和CMYA4)基因定位于猪SSC13和SSC12分别SW344与SW62微卫星标记紧密相连的区域。CMYA1基因编码区一个同义突变c.1053C＞T和三个错义突变：c.1394A＞G(p.His 465Arg)，c.1751A＞G(p.Asp582Gly)和c.3290C＞A(p.Thr1097Asp)关联分析结果表明与不同背膘后存在显著相关；CMYA4基因第十五内含子上A558G单核苷酸突变产生一个MspI酶切位点，性状关联分析结果与六七肋骨背膘厚和肩膘厚存在显著相关(Bang Liu et al，Molecular characterization，expression and association analysis of the porcine CMYA4 gene with carcass traits.J.Anim.Breed Genet.，2008Aug，125(4)：234-239；Bang Liu et al.，Porcine skeletal muscle differentially expressed gene CMYA 1：isolation，characterization，mapping，expression and association analysis with carcass traits.Anim.Genet.，2009Jun，40(3)：255-261)。

Nudix类模体6(Nudt6，nudix(nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 6)基因最早于1989年通过在非洲爪蟾卵母细胞的cDNA文库中用小鼠bFGF序列筛选分离得到的，它编码蛋白在物种间高度保守。小鼠Nudt6位于3号染色体，长约1.1kb。小鼠该基因与FGF-2相向转录且在3’末端有460个左右核苷酸有互补性，所以又称反义FGF。猪中该基因位于8号染色体，与猪FGF2也是相向转录。由于基因结构上的特点，Nudt6可以通过3’端非翻译区调节FGF的翻译起始和mRNA稳定，调控FGF-2的生物学作用。

Nudt6和FGF-2在同一组织中表达，且FGF-2在心脏以及骨骼肌发育，维持神经系统功能，促进祖细胞分裂，对于耳毒性药物有很强的拮抗作用等方面有重要意义，所以Nudt6可以通过调节FGF-2共同影响生理过程。FGF2因子对于肌细胞的生长调控而言是一种关键的调控因子。它对骨骼肌细胞的增殖具有显著的刺激作用，而对其分化具有强烈的抑制作用。在肌肉生成的过程中，FGF2因子具有抑制肌细胞生成素(肌管形成时需要的调节因子)转录的功能。通过抑制肌细胞生成素，FGF2能维持了骨骼肌细胞不断增殖的状态。由于其对FGF2调控作用，我们不难发现该基因在肌肉发育方面具有重要功能，因此我们开展猪Nudt6基因的克隆和SNP筛查、检测及与性状关联分析等相关工作。

发明内容

本发明的目的在于克隆一种与猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率相关基因Nudt6的分子标记，其制备方法及其在猪标记辅助选择关联分析上的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过克隆方法获得一种与猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率相关基因Nudt6的分子标记，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在序列表SEQ ID NO：1的169bp处有1个T169-C169的碱基替换。

申请人提供了一种与猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率性状相关分子标记的制备方法，其步骤如下：

用鼠Nudt6基因(GenBank收录号：NM_153561.2)cDNA为探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)，然后拼接猪EST-重叠群，根据EST-重叠群序列设计引物对，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：正向引物为5′-AGCCTGGAGAAGATATTGGA-3′，反向引物为5′-ATAGCATTTACCATTATCCAGT-3′。

从猪肌肉组织中提取mRNA并反转录成cDNA，以反转录cDNA作为模板通过PCR方法克隆得到如序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列。

根据序列表SEQ ID NO：1和附图2所述的序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示：正向引物为5′-TTTTTTTTTTCGCTTAAAGCCACGTTCATTGA-3′，反向引物为5′ATAGAGCAGCAGCCGAGCAAC-3′，该引物对正向引物所示序列的第11-32位碱基与SEQ ID NO：1所述序列大部分相同，其中第31位为引物引入C→G变异，第1-10位碱基与SEQ ID NO：1所述序列不同，是在引物序列5′端添加的10bp的oligodT，即PCR扩增序列如SEQ ID NO：2和附图4所示，在该序列的1-10位碱基为T且第31位碱基为G，通过这种ACRS-PCR(amplification-created-restriction site-PCR)方法设计的引物为SEQIDNO：2和附图4所示序列第33位碱基T169C变异的识别提供了简易的BclI(TGATCA)酶切多态性鉴别方法。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的与猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率相关基因Nudt6的cDNA序列(如附图2对应)。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的与猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率相关基因Nudt6用于ACRS-BclI-RFLP检测的核苷酸序列(该序列如附图4对应)。

图1：是本发明的技术流程图；

图2：是本发明中获得猪Nudt6基因用于克隆的cDNA片段。所用的引物序列用下划线标注；突变位置为为169位，括号外的Y代表括号内的T/C突变。

图3：筛查T169C SNP的测序图；

图4：是本发明中猪Nudt6基因用于BclI-RFLP检测的核苷酸序列。所用的引物序列用下划线标注。突变位置为33位，括号外的Y代表括号内的T/C突变。在图4所示序列的31位的“G”为引入的突变。

图5：是本发明中猪Nudt6基因BclI-RFLP的三种基因型(TT TC CC)电泳结果。图中Marker：DNA分子量标准(DL2000ladder)。

具体实施方式

实施例1、Nudt6基因的克隆

1、引物设计

用鼠(GenBank收录号：NM_153561.2)Nudt6基因mRNA在互联网上进行同源搜索，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)，然后用DNASTAR拼接猪EST-重叠群，再根据EST-重叠群序列设计引物，通过扩增获得猪Nudt6部分cDNA序列，引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5′-AGCCTGGAGAAGATATTGGA-3′，

反向引物：5′-ATAGCATTTACCATTATCCAGT-3′。

2、PCR产物的克隆和测序

将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取150～200μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将7μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，后冰浴3～4min，加入450μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl 涂布于带有氨苄青霉素(浓度60μg/μL)平板，37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于1ml LB中，37℃220r/min培养过夜。取1μl菌液PCR扩增验证后，用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上对重组质粒进行测序，序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。用DNASTAR软件中的SEQMAN程序进行拼接，得到一条长度为650bp的cDNA序列。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的猪的EST序列进行序列同源性比较，以鉴定获得的cDNA序列。检索结果表明所测序列与猪Nudt6基因EST拼接结果一致。

实施例2、Nudt6基因SNP的筛查和ACRS-PCR-RFLP诊断方法的建立

1、SNP的筛查

运用序列表SEQ ID NO：1引物对扩增中国地方猪品种“通城猪“，外来猪品种“大白”和“长白“纯种猪的cDNA序列，通过琼脂糖胶回收试剂盒(购自北京原平皓生物技术有限公司)获得PCR产物pool送该公司测序，结果表明：在该片段第169位碱基处有一个C-T的碱基突变，该位点变异引起(Ile-Ser)氨基酸的改变，通过引入酶切位点PCR方法在该序列167位碱基引入C→G突变，为C169T的SNP位点的BclI-RFLP多态性检测引入BclI的识别序列，测序结果如图2和图3所示。

2、ACRS-PCR-RFLP诊断方法的建立

(1)引物设计

所述的引物对的序列如下：

Nudt6(BclI-RFLP) NuSNP1-S 5′-TTTTTTTTTTCGCTTAAAGCCACGTTCATTGA-3′，

NuSNP1-R 5′-ATAGAGCAGCAGCCGAGCAAC-3′。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×缓冲液(buffer，购自宝生物工程(大连)有限公司)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，0.1U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。BclI-RFLP PCR扩增程序是：95℃4min，循环38次94℃30s，61℃30s，然后72℃10s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到148bp特异扩增片段(如图4)，测序的结果发现在该148bp片段中31位碱基处引物序列中引入C→G的变异，且存在一个BclI酶切位点(TG↓ATCA)，其中第33bp处为多态性切点。

(3)PCR-RFLP酶切检测条件

BclI-RFLP PCR产物的酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物4～6μl，限制性内切酶BclI 为0.2μl(10U)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，55℃水浴8h，用3.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，凝胶成像系统中拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第33bp位置是C33时，则该BclI酶切位点不存在，BclI酶切后检测结果只有1个片段，长度是148bp(定为等位基因C)；但存在C33→T33的替换时，其结果导致第33bp处一个BclI酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为117bp和31bp(定为等位基因T)，三种基因型CC，TC，TT如图5所述。

(4)、本发明制备的分子标记在猪肉质性状标记性状关联分析中的应用

试验共检测了140个猪个体，包括中国地方猪品种“通城猪”纯种27头，外来猪“大白”纯种28头，“长白”纯种27头，中国地方猪与外来猪的杂交培育的杂交猪“大长通”(大白×(长白×通城))29头、长大通(长白×(大白×通城))29头的多态，确定其基因型，并进行基因型与生产性状(出生至上市平均日增重、胴体直长、胴体斜长、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、滴水损失、肌肉pH值、肌内脂肪含量、肉色、眼肌面积、臀部膘厚)的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：

y_ijk＝μ+G₁+C_j+P_k+B_j+ε_ijk

其中，y_ijk是性状观察值，μ为总体均数，G₁为基因型效应，C_j为品种效应，P_k为父本效应，B_j为批次效应，ε_ijk为随机误差，假定ε_ijk相互独立，服从N(0，σ²)分布。BclI-RFLP基因型检测结果表明在140个个体中CC基因型有48个个体，TC基因型有59个个体，TT基因型有33个个体，基因型与性状关联分析的结果是：Nudt6基因与板油率，内脂率和腿臀肉骨率呈显著相关。

由表1可知，Nudt6基因BclI-RFLP SNP位点对屠宰率，内脂率和眼肌面积有显著影响(P＜0.05)，此位点对其它胴体性状没有显著影响。

表1：Nudt6基因BclI-RFLP多态不同基因型均值及与部分胴体性状的关联分析

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。

表1表明，TT基因型个体的内脂率和板油率显著高于CC基因个体的对应值，而TT基因型个体的腿臀肉骨率显著低于CC基因型个体。

Claims

1.一种用于猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率相关性状检测的分子标记，其核苷酸序列是序列表SEQ ID NO：1所示序列在第169bp位碱基处有一个T169-C169碱基替换的序列。

2.一种检测如权利要求1所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-TTTTTTTTTTCGCTTAAAGCCACGTTCATTGA-3′，

反向引物：5′-ATAGAGCAGCAGCCGAGCAAC-3′。

3.权利要求1所述的分子标记在猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率标记辅助选择中的应用。

4.权利要求2所述的引物对在猪板油率，内脂率和腿臀肉骨率标记辅助选择中的应用。