CN101148668B - 猪产肉性状相关基因btg1的克隆及其在猪分子标记辅助选择中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体地说涉及猪产肉性状相关基因BTG1的克隆及其在猪分子标记辅助选择中的应用。本发明克隆得到如序列表SEQID NO：1所示的猪产肉性状相关BTG1基因序列，其中在SEQID NO：1的第179bp处有一个A179-T179的碱基突变，第280bp处有1个C280-T280的碱基突变，分别导致Psu1-RFLP多态性和Bsh1236I-RFLP多态性。本发明还公开了获得上述基因和引物的制备方法，为猪的分子标记辅助选择提供了新的分子标记。

Description

猪产肉性状相关基因BTG1的克隆及其在猪分子标记辅助选择中的应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及猪生产性状相关基因BTG1基因的克隆以及其在猪分子标记辅助选择中的应用。

背景技术

自古以来，猪在我国一直是六畜之首。养猪业的起伏，更是牵动着人民的生活水平的提高。猪肉在全世界的消费量占红色肉类消费总量的43％，并且猪是人类身体的重要模式系统同时也是未来器官移植的重要来源(Rothschild.From a sow′s ear to a silk purse：real progress in porcine genomics.Cytogenetic and GenomeResearch.2003，102：95-99)。因此对猪的研究不管是从国民经济角度出发还是从人类健康角度出发，都有着重要的实际意义。

我国是世界上养猪最早的国家之一，养猪的历史达几千年之久，经过祖先辛勤的饲养和选育，形成了许许多多各具特色的地方品种。长期以来，猪的育种以提高生长速度、减少饲料消耗、增加瘦肉率为主要目标，并已取得显著成绩。在猪的瘦肉率和生长速度大幅度提高的同时，传统的育种手段也遭遇到发展的瓶颈，已经很难象过去那样大幅度地提高猪的生产水平和抗病能力了。猪生产水平的提高实际上降低了猪的体质和适应性，并影响到猪的肌肉品质。随着我国社会经济的发展，人民生活水平与消费水平的提高，带来了人们膳食结构与饮食观念的变化，消费者对猪肉品质的要求也越来越高。这些出现的一系列的新矛盾和新问题，迫切需要用新的手段和对策解决猪的育种问题。

分子生物学的飞速发展使得猪的育种工作出现了新的曙光。利用遗传学或分子生物学手段对传统育种工作的不足之处进行了强有力的补充，也使得猪的育种能够突破传统育种工作面临的瓶颈问题，大大地促进了猪育种工作的发展。目前，标记辅助选择(MAS)、影响猪重要数量性状的基因组区域定位(QTL)、用基因组扫描(genome scanning)法和候选基因法(Candidate gene approach)研究影响猪重要经济性状的主效基因(Economic traits loci，ETLs)已经成功地应用到国内外的猪育种实践当中，取得了巨大的经济效益和社会效益。随着分子遗传学技术在动物育种中的应用，世界各国猪的育种技术已迈入分子育种阶段。

通过候选基因法与标记辅助选择(MAS)，已经找到了一些影响猪的生产性状的基因。Casas-Carrillo等(Casas-Carrillo等，Relationship of growth hormone and insulin-like growth factor-1 genotypes with growthand carcass traits in swine.Anim Genet，1997，28(2)：88-93.)在以6头公猪与18头无相关的母猪杂交群体中，发现在一个公猪家系中位于猪5号染色体上的类胰岛素样生长因子1(Insulin like growth factor 1，IGF-1)基因型与断奶后日增重存在连锁(LOD＝2.3)；Nezer等(Nezer等，An imprinted QTL with major effect on musclemass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs.Nat Genet.1999，21(2)：155-6.)以大约克与皮特兰杂交的677头后代作为试验对象，研究了影响体脂与肌肉性状的QTL，同样发现了位于2号染色体短臂的QTL，同时筛选到2个候选基因：MYODI和IGF-II；位于猪9号染色体上的肌细胞生成素(Myogenin)是MyoD基因家族的成员，Te Pas等(Te Pas等，Influences of myogenin genotypes on birth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.J Anim Sci，1999，77：2352-2356)在两个大白猪群中检测了该基因的多态性，分析发现不同基因型的个体在出生重、生长速度和瘦肉量等性状上有显著差异。对两个选择系肌肉的MyoD基因家族成员mRNA表达水平比较发现F-系(选择生长速度)中myogenin、myf-5、MyoD1的mRNA表达水平比L-系(选择瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚与成肌细胞的表达成负相关(Te Pas等，Messenger ribonucleic acid expression of the myoD gene family in muscle tissue at slaughter in relation toselection for porcine growth rate.J Anim Sci，2000，7：69-77)；Fujii等(Fujii等，Identification of a mutation inporcine Ryanodine Receptor Associated With Malignant Hypothermia.Science，1991，253：448-451.)发现氟烷基因(Hal)是导致猪产生灰白水样肉(Pale，soft，exudative pork，PSE肉)的主效基因，该基因的编码产物为钙释放通道蛋白(calcium release channel，CRC)或兰尼定受体1(ryanodine receptor 1，RYR1)。如果猪只携带两个隐性突变基因(nn)就发生猪应激综合征(Porcine stress syndrome，PSS)，严重影响到猪的存活率和猪肉品质，导致猪的应激死亡和产生劣质肉(PSE肉)，但隐性基因却对胴体性状具有正效应(Hamilton等，The effect of the Halothane and Rendement Napole genes on carcass and meat quality characteristics of pigs.JAnim Sci，2000，78(11)：2862-7)。进一步的研究也证明，RYR1位点的突变虽然对肉质性状具有负效应，但对几乎所有的胴体组成性状均具有正效应，有商业价值的RYR1位点基因型的简化DNA检测法已成为专利并得到广泛应用(彭中镇等，猪数量性状基因及其标记研究进展.国外畜牧科技，1999，26(1)：28-32)；RN(Rendement Napole)基因又称酸肉基因，Le Roy等(Le Roy等，Evidence for a new major gene influencing meatquality in pigs.Genet Res，1990，55(1)：33-40)首先在汉普夏猪及其杂种中发现不利等位基因RN-可使肌肉中肌糖原含量升高，终端pH值降低，造成酸肉和烹调损失，猪肉工艺学品质下降，影响火腿的产量。Milan等(Milan等，A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle.Science，2000，288(5469)：1248-51)通过对候选区域进行大规模的测序分析，发现单磷酸腺苷活化酶γ3亚基基因(AMP-activated protein kinase(AMPK)，γ-subunit3，PRKAG3)编码第200位氨基酸的密码子的错义突变与汉普夏猪的酸肉表型直接相关，RN-猪的该位点均为不利的等位基因Q(即谷氨酰胺)。Ciobanu等(Ciobanu等，Evidence for new alleles in the protein kinase adenosine monophosphate-activated gamma(3)-subunit geneassociated with low glycogen content in pig skeletal muscle and improved meat quality.Genetics，2001，159(3)：1151-62)在1800个商品猪群中对该基因进行分型，结果发现了新的等位基因与肌糖原含量相关并进一步影响肉质性状。与Milan等发现的位点不同的是，这个位点的不同等位基因不仅仅在汉普夏猪中分离，它在典型的商品猪群中多态性也比较丰富，对育种具有更广泛的适用价值；猪FOS原癌基因(proto-oncogene)被认为是骨骼肌肌纤维特性的候选基因，位于猪7号染色体上影响肌纤维的QTL区域内。Reiner等(Reiner等，Indications of associations of the porcine FOS proto-oncogene with skeletal muscle fibre traits.Anim Genet，2002，33(1)：49-55)报道了FOS染色体区域与骨骼肌纤维特性的关系，发现代表欧洲猪种的BB基因型个体比AA基因型梅山猪的白肌纤维多10.9％。

本实验室长期以来致力于猪重要功能基因的分离鉴定工作，曾经利用代表性差异显示技术、基因芯片技术、基因表达序列分析技术(SAGE)等分离了一些与经济性状有关的基因，并对其中一些效应显著的基因进行了功能分析。BTG1基因正是从本室构建的长白和通城猪胚胎发育不同时期的骨骼肌SAGE文库中筛选出来的对骨骼肌发育具有显著影响的基因。BTG1基因是抗增殖基因家族BTG/TOB家族成员之一，在脊椎动物中该家族至少包括6种不同的成员，即BTG1、BTG2/TIS21/PC3、BTG3/ANA、TOB及TOB2、PC3b。它们蛋白质N端110个氨基酸具有高度同源性，这个同源区包括两个短的、高度保守的同源区A-box和B-box，A-box具有抗增殖作用，B-box具有同许多靶分子结合的功能(Matsuda等，In search of a function forthe TIS21/PC3/BTG1/TOB family.FEBS Lett，2001，497：67-72)。越来越多的研究表明，BTG1基因抑制成肌细胞的增殖并刺激它们的分化(Marchal等，Stimulation of avian myoblast diferentiation by triiodothyronine：possible involvement of the cAMP pathway.Exp Cell Res，1995，220：1-10)。Rodier等(Rodier等，BTG1：atriiodothyronine target involved in the myogenic influence ofthe hormone.Exp Cell Res，1999，249(2)：337-48)认为，BTG1除了抗增殖作用之外，对细胞的分化和器官形成也起着重要作用。Kevnji等(Kenji等，Ananti-proliferative gene BTG1 regulates angiogenesis in vitro.Biochem Biophys Res Commun，2004，316(3)：628-635.)认为BTG1在上皮细胞向管状的形成过程中上调，尤其在血管发生过程中起着重要作用。Busson等(Busson等，Coactivation of nuclear receptors and myogenic factors induces the major BTG1 influence onmuscle differentiation.Oncogene，2005，24(10)：1698-710)发现，BTG1能够刺激细胞核受体、c-JUN和一些成肌因子(CMD1，myf5，myogenin)的活性，这种作用通过转录因子相应的激活域、BTG1的A盒和C末端介导。所有这些表明，BTG1基因可能在肌纤维的早期发育过程中起到重要作用。

猪瘦肉产量和质量在遗传因素上主要取决于胚胎发育期肌纤维数量的增生和生后期肌纤维体积的膨大(Nissen等，Within-litter variaion in muscle fiber characteristics，pig performance，and meat quality traits.JAnim Sci，2004，82，414-21)。除了对生产性状的常规选择之外，肌纤维的数量和体积的遗传变异与遗传力是很高的(Rehfeld等，Myogenesis and postnatal skeletal muscle cell growth as influenced by selection.LivestockProduction Science，2000，66：177-188)。猪日增重和肌肉生长速度与胚胎期形成的肌纤维数目呈正相关，同时也受肌纤维中蛋白质的合成和降解速度差异的影响，但胚胎肌发生时期形成的肌纤维数量是动物产肉量的重要决定因素。肌肉的生长暨肌纤维的发育是一个涉及到大批基因表达与调控的复杂过程，虽然目前已经对参与肌发生过程的相关基因有一定认识，如MRFs(myogenic regulatory factors)家族，MEF2基因家族等等，但更多的影响肌纤维形成与发育的基因有待鉴定。

鉴于BTG1基因对成肌细胞的作用，我们认为它很可能在猪的肌纤维发育过程中起到重要作用，进而影响猪的重要经济性状-生产性状。但是到目前为止，仍没见到研究猪BTG1基因功能的报导。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它对生产性状的影响。

发明内容

本发明的目的在于克隆猪生产性状相关基因BTGL，寻找BTG1基因的突变位点以及作为猪生产性状相关基因的多态性检测方法，为标记辅助育种提供一种有用的分子标记。

本发明是这样实现的：

一种猪生产性状相关基因BTG1，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

PCR扩增的BTG1基因的目的片段全长为578bp，其序列如附图5所述。

所获得的BTG1基因目的片段的DNA序列中有如附图3所述的A179-T179和C280-T280两处碱基突变，分别导致Psul-RFLP和Bsh1236I-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性。

一种筛选适用于猪生产性状分子标记的方法，按照以下步骤制备：

用人BTG1基因的mRNA序列为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的猪ESTs(片段长度大于100bp)序列，然后拼接猪EST-重叠群，获得猪BTG1基因的cDNA序列全长。设计扩增引物，从猪血液基因组提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，应用PCR产物直接测序的方法检测猪BTG1基因扩增目的片段第179和280位的多态性，并进行其基因型与猪的部分生产性状之间的关联分析。本发明为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记。

依照本发明，猪生产性状相关基因BTG1可以用于猪分子标记辅助选择中

以下对本发明作进一步的描述：

1、BTG1基因的cDNA 3’UTR部分序列的克隆

(1)引物设计：

用人BTG1基因的mRNA序列(GenBank登录号：NM 001731)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的猪ESTs(片段长度大于100bp)序列，然后用DNAstar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群，并获得由重叠群拼接构成的一致序列(consensus)，将获得的一致序列与人的mRNA作同源性比对以确认序列的正确性。然后用Primer Premier5.0软件设计引物扩增猪BTG1基因3’-UTR区578bp的片段。引物序列如下：

B1POLF：5’-TAAGTGACAGTGCCATAGTT-3’(正向)，

B1POLR：5’-CAAACCAGACCTCCACTT-3’  (反向)

(2)PCR产物的纯化、克隆和测序：

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照该试剂盒说明书操作，具体步骤是每100mg的凝胶中加300μL的S1液，于65℃温育10min至凝胶完全融化，将S1/DNA混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出。将下面管子中的废液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液。再加入500μL的W1液，静置1min，9200g离心30s，取下Minicolumn装入1.5mlEpendorff管中，加入25μL的灭菌水或者TE液，静置1min之后，9200g离心1min，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

连接反应：将纯化的PCR产物与pMD18-T载体(购自TAKARA公司)连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl2×ligation buffer，0.5μl载体，1μl纯化PCR产物，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16～20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3～0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10～15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min后42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的含Amp的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

克隆子通过PCR鉴定为阳性的用于送上海英骏生物技术有限公司测序。将大白、杜洛克和梅山三个品种的各一个克隆子分别测序或混合测序，测序结果用Seqman^TM软件比对寻找可能的SNP。

2.标记性状关联分析

利用申请人与中国湖北省通城县畜牧局种畜场合作组建的试验群体(含纯种通城猪、长白猪、大白猪、大白×长白×通城、长白×大白×通城)为实验对象进行性状关联分析。所分析的性状有部分生长性状，部分胴体性状和部分肉质性状。对基因型资料用如下模型进行性状关联分析：

Y_ijkl＝μ+G_i+B_j+S_k+ε_ijkl

Y_ijkl表示观测值，μ表示均值，G_i表示基因型效应，B_j表示组合效应，S_k表示性别效应，ε_ijkl表示残差，假定服从N(0，Iσ²)分布。

本发明的效果是：

1、猪BTG1基因部分DNA序列的克隆

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR产物的长度为578bp。测序结果表明在该片段的179bp处存在A、T两个等位基因，测序峰图见图3A；在该片段的280bp处存在C、T两个等位基因，测序峰图见图3B。

2、PCR-RFLP诊断方法建立

用B1POLF和B1POLR扩增猪基因组DNA得到578bp特异扩增片段(附图2)。测序的结果发现在该578bp片段中存在PsuI酶切位点(R*GATCY)和Bsh1236I酶切位点(CG*CG)，其中第176-177bp间为PsuI酶的多态性切点，第279-280bp间为Bsh1236I酶的多态性切点。扩增的PCR产物经PsuI酶切产生三种基因型，其中AA基因型只有578bp的一条带，杂合子AT型有578bp，402bp和176bp三条带，TT型有176bp和402bp两条带，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测能明显的判别带型(图4A)；PCR产物经Bsh1236I酶切产生三种基因型，CC基因型有279bp和299bp两条带，杂合子CT型有578bp，279bp和299bp三条带，TT型只有578bp一条带，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测电泳时间较短时279bp和299bp两条带不易分开，但不影响判型(图4B)。

3、标记性状关联分析

对猪BTG1基因3’UTR区扩增序列PsuI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，基因型检测结果表明在179个个体中AA基因型有144个，AT基因型有33个，TT基因型有2个。不同基因型与性状之间显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)见表1，其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。

分析结果表明，该位点的基因型与肩膘、6-7肋膘厚、屠宰率以及肉色存在显著相关。AT型肩膘显著高于纯合基因型AA和TT型；AT型6-7膘厚显著高于TT型；TT型屠宰率显著高于AA型；AA型肉色显著高于AT型。AT基因型是有利于提高膘厚的选择标记，TT基因型是有利于屠宰率的选择标记，AA基因型是有利于肉色的选择标记。T等位基因是胴体性状的有利标记，A等位基因是肉质性状的有利标记。

表1 猪BTG1基因3’-UTR区PsuI酶切基因型与几个生产性状的相关分析

基因型	个体数	肩膘	6-7膘厚	屠宰率	肉色
						AA	144	4.399±0.080	3.157±0.080	75.816±0.080	3.148±0.080
AT	33	4.780±0.167	3.445±0.168	76.112±0.167	2.777±0.168
						TT	2	3.394±0.680	1.891±0.681	77.261±0.680	4.049±0.681
AA-AT		0.042*	0.124	0.113	0.048*
						AA-TT		0.143	0.067	0.036*	0.191
AT-TT		0.049*	0.028*	0.103	0.071

^*表示差异显著(p＜0.05)，^**表示差异极显著(p＜0.01)。

对猪BTG1基因3’UTR区扩增序列Bsh1236I-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，基因型检测结果表明在通城试验猪群184头猪中，CC基因型有68个，CT基因型有92个，TT基因型有24个。不同基因型与性状之间显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)见表2，其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。

分析结果表明，该位点的基因型与肉色及肌内脂肪含量存在显著相关，CC基因型的肉色和肌内脂肪含量显著高于CT基因型。CC基因型是有利于肉质的选择标记。

表2 猪BTG1基因3’-UTR区Bsh1236I酶切基因型与几个肉质性状的相关分析

基因型	个体数	肉色	肌内脂肪
				CC	68	3.313±0.117	2.557±0.117
CT	92	2.947±0.101	2.231±0.101
				TT	24	3.001±0.197	2.547±0.197
CC-CT		0.018*	0.037*
				CC-TT		0.175	0.965
CT-TT		0.802	0.156

^*表示差异显著(p＜0.05)，^**表示差异极显著(p＜0.01)。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪生长性状相关基因BTG1的DNA序列。

图1：是本发明关于BTG1基因制备的流程图。

图2：是本发明中猪BTG1基因3’UTR区扩增序列的电泳图谱，片段大小为578bp(琼脂糖胶浓度为2％)。M：DNA分子量标记(DL2000 ladder)。

图3A：是本发明中猪BTG1基因测序发现的179bp处存在A、T两个等位基因；图3B：本发明中猪BTG1基因测序发现的280bp处存在C、T两个等位基因。

图4A：是本发明中猪BTG1基因扩增序列的PsuI-RFLP三种基因型电泳图谱；图4B：是本发明中猪BTG1基因扩增序列Bsh1236I-RFLP的三种基因型电泳图谱。M：DNA分子量标准(DL2000 ladder)图5：是本发明的猪BTG1基因位于3’UTR区的扩增DNA序列，括号中所示的为碱基突变。

具体实施方式

实施例1：(1)PCR-RFLP-PsuI多态性在各猪品种中的分布与检测的应用

利用PCR-PsuI-RFLP检测了七个猪种：其中包括来自欧洲血缘的外来猪品种(下同)：大白猪、长白猪和杜洛克猪，来自中国地方猪血缘的品种(下同)：通城猪、二花脸猪、清平猪和江西玉山猪，这些猪种基本涵盖各猪种的基因型。试验使用的猪种的基因频率如表3所示，检测发现长白、大白、通城、二花脸和清平猪中等位基因A占优势，杜洛克和江西玉山猪中等位基因T占优势。

表3 BTG1基因PCR-RFLP-PsuI基因型频率及基因频率的检测

猪品种	数量	基因型分布			等位基因频率
							AA	AT	TT	A	T
		长白	23	23	0	0						1	0
大白	24						22	2	0	0.958333	0.041667
		杜洛克	26	3	12	11						0.346154	0.653846
通城	42						27	14	1	0.809524	0.190476
		二花脸	18	17	1	0						0.972222	0.027778
清平	28						14	12	2	0.714286	0.285714
		玉山	16	3	8	5						0.4375	0.5625

几个品种间基因型频率的卡方检验结果如表4。x²检验表明，杜洛克和玉山猪与长白、大白、通城、二花脸、清平猪之间存在显著或极显著差异，长白、大白之间差异不显著。

表4 BTG1基因对不同猪品种基因型分布x²检验结果

大白

杜洛克

通城

二花脸

清平

玉山

长白

2.00185

38.3447**

10.6786**

1.30972

15.8514**

28.0313**

大白

32.5549**

6.0512*

0.119658

10.6761**

22.3333**

杜洛克

25.3245**

29.6327**

13.2926**

0.709255

通城

5.88023

1.88451

14.8275**

二花脸

9.89157**

20.1967**

清平

6.4072*

注：肩注^*表述P＜0.05；肩注^**表述P＜0.01；df＝2，x² _0.05(2)＝5.99，x² _0.01(2)＝9.21

(2)PCR-RFLP-Bsh1236I多态性在各猪品种中的分布与检测

利用PCR-Bsh1236I-RFLP检测了同样的七个猪种。试验使用的猪种的基因频率如表5所示。结果显示杜洛克、通城、二花脸、清平猪和江西玉山猪中C等位基因占优势，长白猪中T等位基因占优势，大白猪中两种基因频率相同。

表5 BTG1基因对不同猪品种PCR产物基因型频率及基因频率的检测

品种	数量	基因型分布			等位基因频率
							CC	CT	TT	C	T
		长白	24	1	9	14						0.229167	0.770833
大白	25						5	15	5	0.5	0.5
		杜洛克	26	25	1	0						0.980769	0.019231
通城	43						34	9	0	0.895349	0.104651
		二花脸	18	15	2	1						0.888889	0.111111
清平	30						20	9	1	0.816667	0.183333
		玉山	16	12	4	0						0.875	0.125

几个品种间基因型频率的卡方检验结果如表6。x²检验结果表明杜洛克、通城、二花脸、清平和玉山猪与长白、大白猪之间存在极显著差异。

表6 BTG1基因PCR-RFLP-Bsh1236I基因型分布x²检验结果

大白

杜洛克

通城

二花脸

清平

玉山

长白

8.41292*

42.5419**

43.2003**

27.6789**

28.1379**

24.6154**

大白

30.5755**

25.055**

16.9166**

12.8181**

12.8966**

杜洛克

3.81612

2.46011

7.70917*

4.2262

通城

3.09601

2.39037

0.112429

二花脸

2.31342

1.88889

清平

0.729808

注：肩注^*表述P＜0.05肩注^**表述P＜0.01；df＝2，x² _0.05(2)＝5.99，x² _0.01(2)＝9.21

实施例2：猪标记-性状关联分析的应用举例

用BTG1基因检测了通城试验猪群179头猪，对该基因3’-UTR区扩增序列PsuI-RFLP多态检测的三种基因型与通城试验猪群部分生产性状进行了初步相关分析。基因型检测结果表明在179个个体中AA基因型有144个，AT基因型有33个个体，TT基因型有2个。分析结果表明，该位点的基因型与肩膘、6-7肋膘厚、屠宰率以及肉色存在显著相关。AT型肩膘显著高于纯合基因型AA和TT型；AT型6-7膘厚显著高于TT型；TT型屠宰率显著高于AA型；AA型肉色显著高于AT型。

表7猪BTG1基因3’-UTR区PsuI酶切基因型与几个生产性状的相关分析

基因型	个体数	肩膘	6-7膘厚	屠宰率	肉色
						AA	144	4.399±0.080	3.157±0.080	75.816±0.080	3.148±0.080
AT	33	4.780±0.167	3.445±0.168	76.112±0.167	2.777±0.168
						TT	2	3.394±0.680	1.891±0.681	77.261±0.680	4.049±0.681
AA-AT		0.042*	0.124	0.113	0.048*
						AA-TT		0.143	0.067	0.036*	0.191
AT-TT		0.049*	0.028*	0.103	0.071

^*表示差异显著(p＜0.05)，^**表示差异极显著(p＜0.01)。

对猪BTG1基因3’UTR区扩增序列Bsh1236I-RFLP多态的基因型与部分生产性状进行关联分析，基因型检测结果表明在通城试验猪群184头猪中，CC基因型有68个，CT基因型有92个，TT基因型有24个。分析结果表明，该位点的基因型与肉色及肌内脂肪含量存在显著相关，CC基因型的肉色和肌内脂肪含量显著高于CT基因型。

表8猪BTG1基因3’-UTR区Bsh1236I酶切基因型与几个肉质性状的相关分析检测

基因型	个体数	肉色	肌内脂肪
				CC	68	3.313±0.117	2.557±0.117
CT	92	2.947±0.101	2.231±0.101
				TT	24	3.001±0.197	2.547±0.197
CC-CT		0.018*	0.037*
				CC-TT		0.175	0.965
CT-TT		0.802	0.156

^*表示差异显著(p＜0.05)，^**表示差异极显著(p＜0.01)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>猪产肉性状相关基因BTG1的克隆及其应用

<130>

<141>2007-05-22

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>578

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(578)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(280)..(280)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(179)..(179)

<223>

<400>1

taagtgacag tgccatagtt tggacagtac ctttcaatga cttaatagcc tgtgagtcca     60

agtaaattga tcaccttatt tgctagggag tgaagtcctg gggtggtttc agtttctccc    120

ggacatgata cctaaatttt tacatcagtc cctttaacac aaatccatat ttcaaagarc    180

ctttctctgc ggtagaactt ggcagaggaa atttgcacta ttacacttaa attgttatcc    240

tttttggcag ctcgatagga aagctcaaca ttttaaacgy ggtagtactg gaaattttat    300

aacaagactt ttacctagca cttaaatatg tataaatgta cataagacaa aactagtaag    360

catgacctgg ggaaatggtc agaccttgta ttgtgttttt ggccttgaaa gtagcaagtg    420

accagaatct gccatggcaa caggctttaa aaaagacctt aaaaagacac tgtctcaact    480

gtggtgttag caccagccag ctctctgtac atttgctagc ttgtagtttt ctaagactga    540

gtaaacttct tatttttaga aagtggaggt ctggtttg                            578

Claims (3)

1.一种与猪产肉性状关联的分子标记，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，在序列表SEQ ID NO：1的第179bp处有一个A179-T179的碱基突变，导致Psul-RFLP多态性；在序列表SEQ ID NO：1的第280bp处有1个C280-T280的碱基突变，导致Bshl236I-RFLP多态性。

2.一种扩增如权利要求1所述分子标记的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：5’-TAAGTGACAGTGCCATAGTT-3’，

反向引物：5’-CAAACCAGACCTCCACTT-3。

3.权利要求1所述的分子标记在猪标记辅助选择中的应用。

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