CN104232776A - 一种与奶牛产奶性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与奶牛产奶性状相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与奶牛产奶性状相关的分子标记及其应用。本发明公开一组引物，含有如下(1)-(2)和/或(3)-(4)所示的DNA分子：(1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；(2)SEQ ID No.6所示的DNA分子；(3)SEQ ID No.7所示的DNA分子；(4)SEQ ID No.8所示的DNA分子。本发明公开的分子标记可以应用于辅助鉴定具有优良产奶性状的牛群体，具有如下优点：简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，适合实验室大群体规模检测的需要。

Description

一种与奶牛产奶性状相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及一种分子标记及其应用；特别涉及一种与奶牛产奶性状相关的分子标记及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
许多研究发现，δEF1是广泛的转录抑制因子，是EEF1D基因转录和翻译出的蛋白，具有广泛的转录抑制功能，其主要通过N-端和C-端锌指结构簇与靶基因启动子中E2 box序列(5'-CA(G/C)(G/C)TG-3')结合，从而抑制靶基因的转录(Sekido etal.,1997；Higashi et al.,1997；Bellon et al.2009)。例如，δEF1可直接或间接参与多个物种的II型骨胶原基因Col2a1的负调控作用，通过与启动子中的E2 box(CACCT序列)结合达到抑制基因转录的作用(Murray et al.,2000)。在对人乳腺癌细胞去分化过程的研究中发现，δEF1通过与细胞粘连蛋白(E-cadherin)启动子序列中特定的反应元件(E2-box)直接结合而实现转录抑制作用。同时，δEF1能够显著抑制诱导成骨蛋白(BMP-2)因子，抑制小鼠前成肌细胞向成骨细胞分化(Yang etal，2007)。Takashi等(1999)研究发现δEF1氨基端靠近N-锌指结构簇存在的NR结构域也与转录抑制有关。同样，Sekido等(1997)将编码δEF1的NR结构域的cDNA连接到Gal4(1-147)基因的下游构建Gal4-NR融合基因，发现它能够显著抑制下游靶基因的转录，说明δEF1的NR结构域具有潜在的转录抑制活性。Furusawa等(1999)发现，在小鼠的胚胎发育过程中，不同组织中CtBP与δEF1的表达具有很高的协同性，CtBP可能作为共抑制物参与δEF1的转录抑制作用。但也有研究者发现，δEF1 C-端酸性结构域已被检测并证实具有一定的转录激活作用，但活性具有DNA序列或细胞特异性，物种间无特异性(Dillner et al.,2002；Dillner et al.,2004)。
对于δEF1的其他生物学功能研究有，对小鼠胚胎干细胞中靶向敲除编码δEF1的C-末端的基因序列(包括C-端锌指结构簇)后，发现纯合子小鼠的胸腺发育极差，没有形成明显的皮质和髓质，并伴有胸腺细胞数量减少和功能缺陷。上述结果表明，δEFl能够特异性调控胸腺T细胞在不同阶段的发育(Higashi Y，1997)。有一些研究者共同发现，在不同细胞的肿瘤发生过程中δEF1是一种潜在的调控因子。例如，在胸肺部的肿瘤细胞中，δEF1与肿瘤细胞EMT(上皮细胞间质样转化)过程有关，促进了肿瘤细胞向其他器官的转移(Thiery,2002；Eger et al.,2005；Yang et al.,2007)。软骨细胞增殖与分化因子(Ihh)对软骨生长与增殖具有调控作用，靶向灭活小鼠δEF1锌指结构簇区域后，导致长骨缩短、关节融合等骨骼发育畸形情况。研究表明，δEF1对Ihh的表达具有负调控作用(Bellon et al.,2009)。由于目前在牛和其他家畜上尚未发现与δEF1有关报道，根据EEF1D基因在人、鼠等物种上同源性比对结果，可以推测δEF1在牛上同样属于一种转录抑制因子，具有广泛的抑制靶基因转录的功能。
牛EEF1D基因定位于14号染色体上，全长12kb，由8个外显子和7个内含子组成。其mRNA全长1163bp，共编码280个氨基酸(Zimin et al.,2009)。
聚合酶链式反应(PCR)技术是一种特异性DNA体外扩增技术。以少量的DNA为模板，经过变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子，目前，该技术已经成为最常用、也最重要的分子生物学技术之一。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后测序即可进行基因多态的鉴定工作，检测方法简单易行。
SNaPshot检测方法又称微测序法(minisequencing),该技术由美国应用生物公司(Applied Biosystems,ABI)开发，是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。它的检测试剂盒中multiplex mix中只包含ddNTPs底物，在检测引物的末端延伸一个碱基，以荧光染料标记的ddNTP颜色来判断该位点的碱基，达到对目标位点进行检测的目的。具体步骤如图1所示：首先在SNP位点两侧设计1对PCR引物，然后取SNP位点上游或下游18～22 nt作为单碱基延伸引物，用以扩增SNP位点处的1个核苷酸；利用所设计的引物扩增出带有目的位点片段后，用碱性磷酸酶CIP和核酸外切酶Exo I处理，去除PCR产物中的dNTPs和引物；然后以4种荧光标记ddNTPs为底物，用单碱基延伸引物扩增SNP位点处的1个核苷酸，延伸产物用CIP处理，去除多余的荧光标记ddNTP；变性后用3100、3130测序仪(ABI公司)电泳检测。最后分型结果用Genescan或Genemapper ID软件分析(赵云坡等，2009)。在设计多重PCR引物时，为了避免峰的重叠，每个相邻片段之间的引物长度差异至少在5-6bp，而且首先要分别做单个SNaPshot反应及其产物的分析、定位，然后才能做多重SNaPshot反应及产物分析，从而进行多个单核苷酸多态性位点的同时检测。通常可以在20分钟内一次性检测10个SNP位点，且这些位点可以位于同一条DNA片段上，也可以是在不同DNA片段上(赵春霞等，2003)。该方法操作简单、经济，可以在多种遗传分析仪上进行快速、准确地基因分型，实现了SNP分析的自动化，可以方便高效地用于高通量的SNP验证及中通量的SNP筛选，在提高检测效率的同时也降低了检测的成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种与奶牛产奶性状相关的分子标记及其应用，rs137492431和/或rs136760996分子标记在第一泌乳期与305天产奶量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著及显著水平的关联(分别为p＝0.0004，p＝0.0135，p＝0.0119和p＝0.0199)；在第二泌乳期与305天产奶量、乳脂率和乳蛋白量达到极显著及显著水平的关联(分别为p＝0.0026，p＝0.0080和p＝0.0253)。
本发明提供一组引物，含有如下(1)-(2)和/或(3)-(4)所示的DNA分子：
(1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.7所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.8所示的DNA分子。
上述引物中，所述引物由如下(1)-(3)和/或(4)-(6)所示的DNA分子组成：
(1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.9所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子；
(5)SEQ ID No.8所示的DNA分子；
(6)SEQ ID No.10所示的DNA分子；
所述SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的DNA分子为以牛的基因组DNA为模板，应用SNaPshot方法检测SNP位点1时所用的PCR扩增引物对，PCR扩增产物即为含有待检测SNP位点1的分子标记1，所述SEQ ID No.9所示的DNA分子为应用SNaPshot方法检测分子标记1中SNP位点1时的单碱基延伸引物，所述SNP位点1位于GenBank登录号为AC_000171.1的序列的自5’末端起第2313101位，具有G/A多态性，也位于所述分子标记1的自5’末端起第107位；
所述SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的DNA分子为以牛的基因组DNA为模板，应用SNaPshot方法检测SNP位点2时所用的PCR扩增引物对，PCR扩增产物即为含有待检测SNP位点2的分子标记2，所述SEQ ID No.10所示的DNA分子为应用SNaPshot方法检测分子标记2中SNP位点2时的单碱基延伸引物，所述SNP位点2位于GenBank登录号为AC_000171.1的序列的自5’末端起第2313452位，具有G/A多态性，也位于所述分子标记2的自5’末端起第41位；
所述GenBank登录号为AC_000171.1的序列的更新日为2013年8月6日。
一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的引物。
上述试剂盒中，所述产奶性状为产奶量、乳脂率、和/或乳蛋白量；
所述牛为奶牛。
一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：鉴定待测牛是纯合AA个体、纯合GG个体还是杂合AG个体，将在GenBank登录号为AC_000171.1的序列自5’末端起第2313101位的碱基均为A或自5’末端起第2313452位的碱基均为A的待测牛个体记作纯合AA个体，将在所述序列自5’末端起第2313101位的碱基均为G或自5’末端起第2313452位的碱基均为G的待测牛个体记作纯合GG个体，将在所述序列自5’末端起第2313101位的碱基为A和G或自5’末端起第2313452位的碱基为A和G的待测牛个体记作杂合AG个体；在产奶量或乳蛋白量上，纯合AA个体优于杂合AG个体，杂合AG个体优于纯合GG个体；在乳脂率上，纯合GG个体优于杂合AG个体和纯合AA个体；
所述GenBank登录号为AC_000171.1的序列的更新日为2013年8月6日。
将AC_000171.1的序列自5’末端起第2313101位的多态性位点记作rs137492431，将AC_000171.1的序列自5’末端起第2313452位的多态性位点记作rs136760996，rs137492431和rs136760996完全连锁；
H1H1单倍型组合个体是指在所述rs137492431、rs136760996处的基因型均为AA的个体，H2H2单倍型组合个体是指在所述rs137492431、rs136760996处的基因型均为GG的个体，H1H2单倍型组合个体是指在所述rs137492431、rs136760996处的基因型均为AG的个体。H1H1、H1H2和H2H2三种单倍型组合与单标记关联分析结果完全一致，即在第一泌乳期与305天产奶量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著及显著水平的关联；在第二泌乳期与305天产奶量、乳脂率和乳蛋白量达到极显著及显著水平的关联。H1H1单倍型组合个体在305天产奶量和乳蛋白量两性状上优于H2H2单倍型组合个体和H1H2单倍型组合个体，H2H2单倍型组合个体在乳脂率性状上优于H1H1单倍型组合个体和H1H2单倍型组合个体。
上述方法中，所述纯合AA个体、纯合GG个体或杂合AG个体的鉴定方法为SNaPshot检测方法，具体如下：
应用SNaPshot检测方法，以待测牛的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的引物对和/或以SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子组成的引物对为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该PCR扩增产物含有GenBank登录号为AC_000171.1的序列自5’末端起第2313101位碱基的分子标记1和/或GenBank登录号为AC_000171.1的序列自5’末端起第2313452位碱基的分子标记2；以SEQ ID No.9所示的DNA分子和/或SEQ ID No.10所示的DNA分子为SNaPshot检测方法的单碱基延伸引物，延伸得到分子标记1的单碱基和/或分子标记2的单碱基，如果所述分子标记1的所述单碱基均为A或所述分子标记2的所述单碱基均为A，则待测牛为纯合AA个体，如果所述分子标记1的所述单碱基均为G或所述分子标记2的所述单碱基均为G，则待测牛为纯合GG个体，如果所述分子标记1的所述单碱基为A和G或所述分子标记2的所述单碱基为A和G，则待测牛为杂合AG个体；
所述分子标记1为以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到的PCR扩增产物；
所述分子标记2为以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到的PCR扩增产物；
所述PCR扩增中，所用的引物含有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的DNA分子时，所述SNaPshot检测方法的单碱基延伸引物含有SEQ ID No.9所示的DNA分子；
所述PCR扩增中，所用的引物含有SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的DNA分子时，所述SNaPshot检测方法的单碱基延伸引物含有SEQ ID No.10所示的DNA分子；
所述SEQ ID No.9所示的DNA分子为所述分子标记1对应的单碱基延伸引物；
所述SEQ ID No.10所示的DNA分子为所述分子标记2对应的单碱基延伸引物；
所述分子标记1的所述单碱基位于分子标记1的自5’末端起第107位；
所述分子标记2的所述单碱基位于分子标记2的自5’末端起第41位；
所述牛为奶牛。
上述任一所述的引物、上述任一所述的试剂盒在制备检测或辅助检测牛产奶性状高低的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述产奶性状为产奶量、乳脂率和/或乳蛋白量。
上述任一所述的引物、上述任一所述的试剂盒在牛育种中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中，所述牛为奶牛。
本发明基于检测牛EEF1D基因rs137492431或rs136760996多态位点以及他们的连锁程度的分析，提供了辅助鉴定具有优良产奶性状的牛群体的方法，该方法具有如下优点：简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，适合实验室大群体规模检测的需要。
附图说明
图1为SNaPshot检测步骤。
图2为rs137492431和rs136760996的突变位置。
图3为rs137492431和rs136760996的连锁不平衡估计。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
中国荷斯坦公牛管制冻精样品和女儿群体的母牛血样分别来源于北京三元绿荷奶牛养殖中心和北京市畜牧兽医总站。
Taq plus DNA聚合酶购自Fermentas公司，产品目录号为EP0406。
ExoI购自Fermentas公司，产品目录号为EN0582。
Fast AP购自Fermentas公司，产品目录号为EF0652。
SNaPshot试剂盒购自ABI公司。
实施例1、基因多态性检测
一、选择北京地区共21头中国荷斯坦公牛作为基因多态性检测的试验群体，并将各管制冻精样品的基因组DNA均稀释成50ng/μl的浓度，再将各样品等量混合成池DNA。
二、根据牛EEF1D基因序列(位于GenBank登录号为AC_000171.1的序列中，更新日为2013年8月6日)，设计如表1的两对引物。
表1 EEF1D基因PCR扩增引物序列信息
三、以步骤一得到的池DNA为模板，分别以1-F和1-R、2-F和2-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
由于扩增片段GC含量较高，一种PCR方法是使用常规rTaq DNA聚合酶(购自TAKARA，产品目录号为R004A)，另一种PCR方法使用MightyAmp DNA聚合酶(购自TAKARA，产品目录号为R071A)进行PCR反应，这种酶在扩增片段GC含量高导致退火温度高的情况下可有效的进行扩增，提高扩增效率和成功率。
两种PCR反应体系和各自的PCR反应条件分别如表2和表3所示。
表2 PCR反应体系
表2中的premix为rTaq DNA聚合酶(购自TAKARA，产品目录号为R004A)中的试剂。MightyAmp Buffer和MightyAmp Polymerase为MightyAmp DNA聚合酶(购自TAKARA，产品目录号为R071A)中的试剂。正向引物F和反向引物R分别为1-F和1-R，或，2-F和2-R。
表3 PCR反应条件
将PCR扩增产物进行测序，结果发现公牛群体EEF1D基因上游3000bp的侧翼序列中存在2个SNP标记，如表4所示，突变位置如图2所示。
表4 EEF1D基因发现的2个SNPs
表4表明，发现的EEF1D基因的2个SNP rs137492431和rs136760996，分别是在GenBank登录号为AC_000171.1的序列的5’末端起第2313101位、第2313452位，均具有G/A多态性。其中rs137492431是以1-F和1-R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析获得的，rs136760996是以2-F和2-R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析获得的。
rs137492431是以牛的基因组DNA为模板，以1-F和1-R为引物进行PCR扩增得到的产物的自5’末端起第326位。
rs136760996是以牛的基因组DNA为模板，以2-F和2-R为引物进行PCR扩增得到的产物的自5’末端起第147位。
将在rs137492431处的碱基均为G的个体记作在rs137492431处的纯合GG个体，均为A的个体记作在rs137492431处的纯合AA个体，为A和G的个体记作在rs137492431处的杂合GA个体。
将在rs136760996处的碱基均为G的个体记作在rs136760996处的纯合GG个体，均为A的个体记作在rs136760996处的纯合AA个体，为A和G的个体记作在rs136760996处的杂合GA个体。
实施例2、SNaPshot微测序技术验证群体个体SNP位点分型
一、根据实施例1的21头荷斯坦公牛检测出EEF1D基因5’调控区2个SNPs(rs137492431和rs136760996)情况从中选出8头杂合型公牛(即公牛的rs137492431和rs136760996位点处的基因型均为GA)家系共506头女儿群体进行群体基因型分型。提取女儿群体的母牛血样(为非抗凝血)的基因组DNA，基因组样品采用ABI公司的Multiplex SNaPshot微测序技术进行SNP分型。
二、引物的设计和合成
(一)设计多重PCR引物。
引物的设计标准为：PCR扩增产物片段长度在300-500bp左右，引物最佳长度为21bp，最佳变性温度为62℃，引物浓度0.3μmol/L。引物信息如表5所示。
表5 SNaPshot多重PCR扩增所用引物
(二)在紧邻待测SNP位点设计SNaPshot延伸引物，用不同延伸引物长度区分不同检测SNP位点，位点的基因型由SNaPshot反应后引物标记上的不同荧光进行代表(蓝色代表G，绿色代表A，红色代表T，黄色代表C)。
两个位点分型单碱基延伸的延伸引物如下：
rs137492431 F：5’-TTTTTTTTTTTCTGCGCGGGCTCCTGGTTGAC-3’(SEQ ID No.9)
rs136760996 F：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCCAGCCGCGCAGCGTGCC-3’(SEQ IDNo.10)
三、SNP位点分型
(一)多重PCR反应
多重PCR(总体系20μl)：DNA模板(基因组DNA)1μl，Taq plus DNA聚合酶1U，10×PCR Buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.5μl，正向引物、反向引物混合物(表5中的四种引物)(浓度均为10μM)各1μl，ddH2O补足体系至20μl。
Touch-down PCR反应程序：95℃，15min；94℃ 40s，63℃ 1min(每个循环下降0.5℃)，72℃ 1.5min，10个循环；94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃延伸8min；结束后4℃保存。
用琼脂糖凝胶电泳分离多重PCR扩增产物，通过EB染色在紫外灯下观察目的条带，条带单一清晰，产物大小与预期一致的为合格PCR产物。条带模糊或没有扩增条带的样品重新扩增。
对合格PCR产物进行纯化：每15μl PCR产物中加入4U Fast AP，2U Exo I，37℃加热15min，4℃保存，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的dNTP。
此时多重PCR产物中含有两种目的条带。
(二)SNP位点分型扩增
取步骤(一)纯化后的多重PCR产物3μl、SNaPshotTM Multiplex反应液(SNaPshot试剂盒自带)5μl、SNaPshot延伸引物(SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，每条引物浓度均为10μM)1μl，ddH2O 1μl组成PCR反应体系，采用如下PCR反应程序进行分型扩增。
PCR反应程序：96℃，10s；96℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 30s，30个循环；60℃，30s；结束后4℃保存。
反应完成后在反应液中加入1U Fast AP，37℃加热1h，75℃加热15min。
四、分型结果检测：将步骤三处理完成的SNaPshot反应液取1ul，加8ul上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴，之后对处理样品采用ABI 3730XL基因分析仪进行电泳检测。使用ABI3730 Data collection v3.0收集实验数据，用ABI PeakScanner Software v1.0进行数据分析，得到506头女儿群体个体的rs137492431和rs136760996位点的分型结果。
rs137492431是以牛的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为引物进行PCR扩增得到的产物的自5’末端起第107位。
rs136760996是以牛的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为引物进行PCR扩增得到的产物的自5’末端起第41位。
实施例3、关联分析
一、记录实施例2中的506头试验母牛的305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5个产奶性状。每个个体的测定日的记录依次包括牛只个体号、父号、母号、外祖父号、出生日期、泌乳期、产犊日期、测定日期、测定日产奶量、测定日乳脂率、测定日乳蛋白率、测定日体细胞数、估计的305天产奶量、估计的305天乳脂量和305天乳蛋白量15项信息。
二、单个SNP位点与性状的关联分析模型
采用SAS 9.1软件中的MIXED过程对奶牛305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率等5个产奶性状和基因型进行关联分析。关联分析采用动物模型，具体模型如下：
Y＝μ+hys+b×M+G+a+e
其中，Y：产奶性状(个体305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)观察值，μ：总体均值，hys：场年季效应，b：协变量M的回归系数，M：产犊月龄效应，G：基因型效应，a：个体随机加性遗传效应，e：随机残差效应。
关联分析方法参见文献“东天，基于GWAS后分析策略研究EEF1D基因与奶牛产奶性状遗传效应[D].北京：中国农业大学，2013.”。结果如表6所示。
表6 EEF1D基因与产奶性状关联分析(最小二乘均值±标准误)
注：*P<0.05，表示差异显著；**P<0.01，表示差异极显著。a,b同一列数据有不同上标表示差异显著；A,B同一列数据有不同上标表示差异极显著。
表6表明，在第一泌乳期时，rs137492431和rs136760996与305天产奶量达到极显著关联水平(p＝0.0004)，与乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率达到显著关联(p<0.05)。对于305天产奶量和乳蛋白量，AA型个体优于AG基因型个体，AG基因型个体优于GG基因型个体，对于乳脂率GG基因型个体优于AA型和AG基因型个体。
第二泌乳期的关联分析结果与第一泌乳期有相似之处，不同之处在于：rs137492431和rs136760996与乳脂率的关联程度由显著关联(p＝0.0135)提高为极显著关联(p＝0.008)，而与乳蛋白率的关联程度由显著关联(p＝0.0199)改变为关联不显著(p>0.05)。对于305天产奶量和乳蛋白量，AA型个体优于AG基因型个体，AG基因型个体优于GG基因型个体，对于乳脂率GG基因型个体优于AA型和AG基因型个体。
三、遗传效应分析
利用SAS 9.1软件进行SNP加性效应、显性效应及替代效应显著性检验。
基本计算公式如下：
a＝(XAA-XBB)/2，d＝XAB/XAA+XBB，α＝a+d(p-q),a为加性效应，d为显性效应，α为等位基因替代效应；XAA、XAB、XBB为相应基因型产奶性状最小二乘均值,p等位基因A的频率，q为等位基因q的频率。
方法参见文献“东天，基于GWAS后分析策略研究EEF1D基因与奶牛产奶性状遗传效应[D].北京：中国农业大学，2013.”。
加性效应、显性效应和等位基因替代效应检验结果如表7所示。
表7 EEF1D基因等位基因加性效应、显性效应和替代效应检验结果
注：*P<0.05，表示差异显著；**P<0.01，表示差异极显著。
表7表明，对于第一泌乳期数据，rs137492431和rs136760996对305天产奶量、乳蛋白量和乳蛋白率的加性效应显著；对305天产奶量和乳蛋白量的等位基因替代效应显著，即每个A等位基因替代G等位基因会导致305天产奶量提高380.56kg(p<0.01)，乳蛋白量提高9.43kg(p<0.05)。
对于第二泌乳期数据，rs137492431和rs136760996对305天产奶量、乳脂率和乳蛋白量的加性效应显著；对乳脂率的等位基因替代效应显著，即每个A等位基因替代G等位基因会导致乳脂率下降0.14％。
四、单倍型分析
应用Haploview(version 4.2)软件构建单倍型，估计单倍型频率与连锁程度分析，并与性状进行关联分析。利用SAS 9.1软件中的MIXED过程，模型如下：
Y＝μ+hys+b×M+G+a+e
Y：产奶性状(个体305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率)观察值，μ：总体均值，hys：场年季效应，b：协变量M的回归系数，M：产犊月龄效应，G：基因型效应，a：个体随机加性遗传效应，e：随机残差效应
单倍型分析结果如表8所示。
表8 EEF1D基因2个SNPs构成的单倍型
表8表明，在本研究群体中，EEF1D基因两个SNPs(rs137492431和rs136760996)共构成两种单倍型，其中H2(GG)单倍型频率为80.2％，H1(AA)单倍型频率为19.8％。对这两个SNPs进行连锁不平衡估计，结果表明这两个SNPs处于完全连锁状态(r2＝1)，如图3所示。
由于rs137492431和rs136760996完全连锁，因此H1H1、H1H2和H2H2三种单倍型组合与单标记关联分析结果完全一致，即在第一泌乳期与305天产奶量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著及显著水平的关联(分别为p＝0.0004，p＝0.0135，p＝0.0119和p＝0.0199)；在第二泌乳期与305天产奶量、乳脂率和乳蛋白量达到极显著及显著水平的关联(分别为p＝0.0026，p＝0.0080和p＝0.0253)。H1H1单倍型组合个体在305天产奶量和乳蛋白量两性状上优于其他个体，H2H2单倍型组合个体在乳脂率性状上优于其他。
(H1H1单倍型组合个体是指rs137492431、rs136760996的基因型均为AA，H2H2单倍型组合个体是指rs137492431、rs136760996的基因型均为GG，H1H2单倍型组合个体是指rs137492431、rs136760996的基因型均为GA)
与单标记SNP分析相比，单倍型分析对复杂性状检测遗传变异具有更好的效果(Zhao et al.,2003)。

Claims (9)

1.一组引物，含有如下(1)-(2)和/或(3)-(4)所示的DNA分子：
(1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.7所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.8所示的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物由如下(1)-(3)和/或(4)-(6)所示的DNA分子组成：
(1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.9所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子；
(5)SEQ ID No.8所示的DNA分子；
(6)SEQ ID No.10所示的DNA分子。
3.一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述产奶性状为产奶量、乳脂率、和/或乳蛋白量。
5.一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的方法，包括如下步骤：鉴定待测牛是纯合AA个体、纯合GG个体还是杂合AG个体，将待测牛的基因组中的GenBank登录号为AC_000171.1的序列自5’末端起第2313101位的碱基均为A或自5’末端起第2313452位的碱基均为A的待测牛个体记作纯合AA个体，将待测牛的基因组中的在GenBank登录号为AC_000171.1的序列自5’末端起第2313101位的碱基均为G或自5’末端起第2313452位的碱基均为G的待测牛个体记作纯合GG个体，将待测牛的基因组中的GenBank登录号为AC_000171.1的序列自5’末端起第2313101位的碱基为A和G或自5’末端起第2313452位的碱基为A和G的待测牛个体记作杂合AG个体；在产奶量或乳蛋白量上，纯合AA个体优于杂合AG个体，杂合AG个体优于纯合GG个体；在乳脂率上，纯合GG个体优于杂合AG个体和纯合AA个体；
所述GenBank登录号为AC_000171.1的序列的更新日为2013年8月6日。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述纯合AA个体、纯合GG个体或杂合AG个体的鉴定方法为SNaPshot检测方法，具体如下：
应用SNaPshot检测方法，以待测牛的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的引物对和/或以SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子组成的引物对为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该PCR扩增产物为含有GenBank登录号为AC_000171.1的序列自5’末端起第2313101位碱基的分子标记1和/或GenBank登录号为AC_000171.1的序列自5’末端起第2313452位碱基的分子标记2；以SEQ ID No.9所示的DNA分子和/或SEQ ID No.10所示的DNA分子为SNaPshot检测方法的单碱基延伸引物，延伸得到分子标记1的单碱基和/或分子标记2的单碱基，如果所述分子标记1的所述单碱基均为A或所述分子标记2的所述单碱基均为A，则待测牛为纯合AA个体，如果所述分子标记1的所述单碱基均为G或所述分子标记2的所述单碱基均为G，则待测牛为纯合GG个体，如果所述分子标记1的所述单碱基为A和G或所述分子标记2的所述单碱基为A和G，则待测牛为杂合AG个体；
所述分子标记1为以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到的PCR扩增产物；
所述分子标记2为以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到的PCR扩增产物；
所述PCR扩增中，所用的引物含有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的DNA分子时，所述SNaPshot检测方法的单碱基延伸引物含有SEQ ID No.9所示的DNA分子；
所述PCR扩增中，所用的引物含有SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的DNA分子时，所述SNaPshot检测方法的单碱基延伸引物含有SEQ ID No.10所示的DNA分子；
所述SEQ ID No.9所示的DNA分子为所述分子标记1对应的单碱基延伸引物；
所述SEQ ID No.10所示的DNA分子为所述分子标记2对应的单碱基延伸引物。
7.权利要求1或2所述的引物、权利要求3或4所述的试剂盒在制备检测或辅助检测牛产奶性状高低的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述产奶性状为产奶量、乳脂率和/或乳蛋白量。
9.权利要求1或2所述的引物、权利要求3或4所述的试剂盒在牛育种中的应用。
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