CN106947806A - 一种基于atf3基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于ATF3基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用。通过实验表明：本发明基于ATF3基因的分子标记在第一泌乳期与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到显著或极显著水平的关联；在第二泌乳期与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到显著或极显著水平的关联。本发明的方法简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，并可用于辅助鉴定具有优良产奶性状的牛群体，适合实验室大群体规模检测的需要。不仅可对待选牛进行早期筛选，而且降低了育种花费，能有效提高实际生产中的牛的产奶量，在牛的育种工作中将发挥巨大作用。

Description

一种基于ATF3基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于ATF3基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
转录激活因子3(Activating transcription factor 3，ATF3)属于ATF/CREB转录因子家族，该家族代表一个碱性区/亮氨酸拉链区蛋白质大家族，属于受cAMP调控的同一个蛋白家族，其成员主要有：TF1(TREB36)，CREB，CREM，ATF2，(CRE-BP1)，ATF3，ATF4，ATF5(ATFX)，ATF6，ATF7和B-ATF。该家族成员具有相似的结构，即一个位于C末端的高度保守的典型锌指bZIP结构域，一个位于N末端的激酶诱导结构域(KID)或磷酸化盒(P-box)和位于KID一侧的两个反式激活结构域(CREM和CREB)。其中，碱性结构域负责与ATF/CRE启动子的特定DNA序列(TGACGTCA)相结合，亮氨酸拉链结构负责形成同源二聚体，或与其他拥有bZIP结构域的蛋白形成异二聚体(如C/EBP或Maf家族)，实现对转录的差异化调节(Thompson etal.,2009)。目前哺乳动物中己有20种以上编码与ATF/CRE位点结合的蛋白质的cDNA克隆被成功分离，所有这些cDNA编码的蛋白质都含有bZIP DNA结合结构域(Hai et al.,1999)。研究表明ATF3在不同细胞的生存中可能起不同的作用，可能与细胞的类型，应激的程度，细胞所处的内外环境、转录后修饰、相互作用蛋白的影响有关，有待进一步的研究。
牛的ATF3基因位于第16号染色体上，全长12.95kb，包含5个外显子和4个内含子。其mRNA全长1994bp，共编码181个氨基酸，mRNA序列与人的同源性为86％，氨基酸序列与人的同源性为96％。
聚合酶链式反应(PCR)技术是一种特异性DNA体外扩增技术。以少量的DNA为模板，经过变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子，目前，该技术已经成为最常用、也最重要的分子生物学技术之一。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后测序即可进行基因多态的鉴定工作，检测方法简单易行。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质的新用途。
本发明提供了检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在如下m1-m6)中任一种中的应用：
m1)鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状；
m2)制备鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状的产品；
m3)牛育种；
m4)制备牛育种的产品；
m5)选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳蛋白量高和/或乳蛋白率高的牛；
m6)制备选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳蛋白量高和/或乳蛋白率高的牛的产品。
上述应用中，所述检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组16号染色体上第72833562位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下3)或4)：
3)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对C；
4)由序列C所示的单链DNA分子和序列D所示的单链DNA分子组成的引物对D；
所述序列C为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；
所述序列D为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组16号染色体上第72819850位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下5)或6)：
5)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对E；
6)由序列E所示的单链DNA分子和序列F所示的单链DNA分子组成的引物对F；
所述序列E为将序列5删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5具有相同功能的核苷酸；
所述序列F为将序列6删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列6具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组16号染色体上第72818819位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下7)或8)：
7)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成的引物对G；
8)由序列G所示的单链DNA分子和序列H所示的单链DNA分子组成的引物对H；
所述序列G为将序列7删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列7具有相同功能的核苷酸；
所述序列H为将序列8删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列8具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组16号染色体上第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下9)或10)：
9)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对I；
10)由序列I所示的单链DNA分子和序列G所示的单链DNA分子组成的引物对G；
所述序列I为将序列9删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列9具有相同功能的核苷酸；
所述序列G为将序列10删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列10具有相同功能的核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的方法。
本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的方法为如下(1)-(8)中任一种：
(1)是检测牛个体的基因型是CC基因型还是AA基因型还是CA基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
CA基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AA基因型的牛个体；CC基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于CA基因型的牛个体，CA基因型在第一泌乳期的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；
CA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AA基因型的牛个体；
所述CC基因型为牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基均为A的纯合体；
所述CA基因型为牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基为C和A的杂合体；
(2)是检测牛个体的基因型是CC基因型还是AA基因型还是CA基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
CC基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于CA基因型的牛个体，CA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；CC基因型的牛个体在第一泌乳期的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳蛋白率高于CA基因型的牛个体；
CA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；CA基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于CC基因型的牛个体；
所述CC基因型为牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基均为A的纯合体；
所述CA基因型为牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基为C和A的杂合体；
(3)是检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
AG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于GG基因型的牛个体；AA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；
AG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；AG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基均为A的纯合体；
所述GG基因型为牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基均为G的纯合体；
所述AG基因型为牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基为A和G的杂合体；
(4)是检测牛个体的基因型是GG基因型还是TT基因型还是GT基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
TT基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于GT基因型的牛个体，GT基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；
GT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；GT基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于TT基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基均为G的纯合体；
所述TT基因型为牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述GT基因型为牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基为G和T的杂合体；
(5)是检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量：
AA基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；
GG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述AG基因型为牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基为A和G的杂合体；
(6)是检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
GG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AA基因型的牛个体；AA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于GG基因型的牛个体；
AG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；AG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基均为G的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基均为A的纯合体；
所述AG基因型为牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基为A和G的杂合体；
(7)是检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量：
TT基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体，TC基因型在第一泌乳期的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体；
CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体；
所述TT基因型为牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述CC基因型为牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述TC基因型为牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基为T和C的杂合体；
(8)是检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
TT基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体，TC基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体；
CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳脂量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳脂量高于TC基因型的牛个体；TC基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于CC基因型的牛个体；
所述TT基因型为牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述CC基因型为牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述TC基因型为牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基为T和C的杂合体。
上述方法中，
所述(1)中，所述检测牛个体的基因型是CC基因型还是AA基因型还是CA基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(2)中，所述检测牛个体的基因型是CC基因型还是AA基因型还是CA基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(3)中，所述检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(4)中，所述检测牛个体的基因型是GG基因型还是TT基因型还是GT基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(5)中，所述检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(6)中，所述检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(7)中，所述检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(8)中，所述检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸的PCR扩增产物。
上述方法中，
所述(1)和/或(2)和/或(3)中的PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；
或所述(4)中的PCR扩增产物所用的引物为如下3)或4)：
3)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对C；
4)由序列C所示的单链DNA分子和序列D所示的单链DNA分子组成的引物对D；
所述序列C为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；
所述序列D为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；
或所述(5)中的PCR扩增产物所用的引物为如下5)或6)：
5)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对E；
6)由序列E所示的单链DNA分子和序列F所示的单链DNA分子组成的引物对F；
所述序列E为将序列5删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5具有相同功能的核苷酸；
所述序列F为将序列6删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列6具有相同功能的核苷酸；
或所述(6)中的PCR扩增产物所用的引物为如下7)或8)：
7)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成的引物对G；
8)由序列G所示的单链DNA分子和序列H所示的单链DNA分子组成的引物对H；
所述序列G为将序列7删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列7具有相同功能的核苷酸；
所述序列H为将序列8删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列8具有相同功能的核苷酸；
或所述(7)和/或(8)中的PCR扩增产物所用的引物为如下9)或10)：
9)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对I；
10)由序列I所示的单链DNA分子和序列G所示的单链DNA分子组成的引物对G；
所述序列I为将序列9删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列9具有相同功能的核苷酸。
本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的产品。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的产品为上述检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质。
上述应用或方法或产品中，所述牛为奶牛；
所述305天产奶量为从产犊到第305个泌乳日的总产奶量；
所述乳脂量为乳中所含脂肪的重量，它等于乳脂率与产奶量的乘积；所述乳脂率为乳中所含的脂肪的百分率；
所述乳蛋白率为乳中所含的蛋白的百分率；
所述乳蛋白量为乳中所含蛋白的重量，它等于乳蛋白率与产奶量的乘积；
所述第一泌乳期为母牛第一次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天；
所述第二泌乳期为母牛第二次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。
上述应用或方法或产品中，
所述牛基因组序列为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列。
本发明提供了一种基于ATF3基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用。通过实验表明：g.72834301C>A和/或g.72834229C>A和/或g.72833969A>G和/或g.72833562G>T和/或g.72819850A>G和/或g.72818819A>G和/或g.72818292T>C和/或g.72818161T>C分子标记在第一泌乳期与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到显著或极显著水平的关联(P＝0.0494，P＜0.0001)；在第二泌乳期与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到显著或极显著水平的关联(P＝0.0461,P＜0.0001)。
附图说明
图1为g.72834301C>A、g.72834229C>A、g.72833969A>G、g.72833562G>T、g.72819850A>G、g.72818819A>G、g.72818292T>C和g.72818161T>C的突变位置。(请去除附图中的g.72818818C>T的箭头)
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的中国荷斯坦公牛管制冻精样品和女儿群体的母牛血样分别来源于北京三元绿荷奶牛养殖中心和北京市畜牧兽医总站。
下述实施例中的305天产奶量：从产犊到第305个泌乳日的总产奶量。
下述实施例中的乳脂率：乳中所含的脂肪的百分率。
下述实施例中的乳脂量：乳中所含脂肪的重量，它等于乳脂率与产奶量的乘积。
下述实施例中的乳蛋白率：乳中所含的蛋白的百分率。
下述实施例中的乳蛋白量：乳中所含蛋白的重量，它等于乳蛋白率与产奶量的乘积。
下述实施例中的第一泌乳期：母牛第一次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。
下述实施例中的第二泌乳期：母牛第二次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。
实施例1、奶牛产奶性状相关的分子标记及鉴定奶牛产奶性状的方法
一、奶牛ATF3基因多态位点的确定
1、DNA池的制备
选择北京地区共40头中国荷斯坦公牛作为基因多态性检测的试验群体，将40头中国荷斯坦公牛随机均分为两组，利用核酸分析仪准确测定其冻精基因组DNA的浓度，并将这些DNA均稀释成浓度为50ng/μL，等量混合成两个DNA池，作为PCR扩增的模板。
2、引物的设计
根据牛ATF3基因序列(位于GenBank登录号为AC_000173.1的序列中，更新日为2014年12月31日)，设计如表1的14对引物。
表1ATF3基因PCR扩增引物序列信息
3、PCR扩增
以步骤1得到的DNA池为模板，分别采用表1中的各组引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
表1中引物1F和1R、8F和8R、10F和10R、12F和12R采用降落PCR方法(touchdownPCR)，其余引物采用了常规PCR的方法。降落PCR的原理大致如下：首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有；随着反应循环数的增加，退火温度的逐步降低，非特异扩增也会逐步增多；但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。表1中部分引物的退火温度表示为“a-b touchdown”(a>b)的形式即为降落PCR中所用的退火温度范围，表示在反应过程中退火温度逐步由a℃降落到b℃。
PCR反应体系如表2所示(表2中的正向引物F和反向引物R分别表示1F和1R、2F和2R等)。常规PCR和降落PCR反应条件如表3所示。
表2、PCR反应体系
表3、PCR反应条件
4、PCR扩增产物的测序及序列分析
将PCR扩增产物进行测序，结果发现公牛群体ATF3基因上游2000bp的侧翼序列中存在4个SNP标记、下游2000bp的侧翼序列中存在4个SNP标记，如表4所示，突变位置如图1所示。
上述ATF3基因的8个SNP中，
g.72834301C>A是以牛的基因组DNA为模板，以1F和1R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列11所示)的自5’末端起第196位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基均为C的个体的基因型命名为纯合CC基因型，将牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基为C和A的个体的基因型命名为杂合CA基因型。
g.72834229C>A是以牛的基因组DNA为模板，以1F和1R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列11所示)自5’末端起第268位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基均为C的个体的基因型命名为纯合CC基因型，将牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基为C和A的个体的基因型命名为杂合CA基因型。
g.72833969A>G是以牛的基因组DNA为模板，以1F和1R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列11所示)的自5’末端起第528位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基均为G的个体的基因型命名为纯合GG基因型，将牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基为C和A的个体的基因型命名为杂合AG基因型。
g.72833562G>T是以牛的基因组DNA为模板，以2F和2R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列12所示)的自5’末端起第416位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基均为G的个体的基因型命名为纯合GG基因型，将牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基均为T的个体的基因型命名为纯合TT基因型，将牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基为G和T的个体的基因型命名为杂合GT基因型。
g.72819850A>G是以牛的基因组DNA为模板，以11F和11R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列13所示)的自5’末端起第100位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基均为G的个体的基因型命名为纯合GG基因型，将牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基为A和G的个体的基因型命名为杂合AG基因型。
g.72818819A>G是以牛的基因组DNA为模板，以13F和13R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列14所示)的自5’末端起第246位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基均为A的个体的基因型命名为纯合AA基因型，将牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基均为G的个体的基因型命名为纯合GG基因型，将牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基为A和G的个体的基因型命名为杂合AG基因型。
g.72818292T>C是以牛的基因组DNA为模板，以14F和14R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列15所示)的自5’末端起第82位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基均为T的个体的基因型命名为纯合TT基因型，将牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基均为C的个体的基因型命名为纯合CC基因型，将牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基为T和C的个体的基因型命名为杂合TC基因型。
g.72818161T>C是以牛的基因组DNA为模板，以14F和14R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列15所示)的自5’末端起第213位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基均为T的个体的基因型命名为纯合TT基因型，将牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基均为C的个体的基因型命名为纯合CC基因型，将牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基为T和C的个体的基因型命名为杂合TC基因型。
表4、ATF3基因发现的8个SNPs
二、奶牛ATF3基因多态位点与产奶性状的相关性分析
1、基因型检测
根据步骤1中获得的ATF3基因的SNPs，采用各个SNP对应的引物对40头荷斯坦公牛家系共1093头女儿群体进行群体基因型分型。具体步骤如下：提取女儿群体的母牛血样(为非抗凝血)的基因组DNA，基因组样品交由博淼生物科技(北京)有限公司使用“用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法”，即MALDI-TOF-MS检测技术对步骤一获得的8个SNPs位点的基因型进行检测。基因型检测结果如表5所示。
2、产奶性状检测
分别检测上述1093头试验母牛的305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5个产奶性状。每个个体的测定日的记录依次包括牛只个体号、父号、母号、外祖父号、出生日期、泌乳期、产犊日期、测定日期、测定日产奶量、测定日乳脂率、测定日乳蛋白率、测定日体细胞数、估计的305天产奶量、估计的305天乳脂量和305天乳蛋白量15项信息。
3、单个SNP位点与性状的关联分析模型
采用SAS 9.13软件中的MIXED过程对奶牛305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率等5个产奶性状和基因型进行关联分析。关联分析采用动物模型，具体模型如下：Y＝μ+hys+b×M+G+a+e。其中，Y：产奶性状(个体305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)观察值，μ：总体均值，hys：场年季效应，b：协变量M的回归系数，M：产犊月龄效应，G：基因型效应，a：个体随机加性遗传效应，e：随机残差效应。关联分析方法参见文献“东天，基于GWAS后分析策略研究EEF1D基因与奶牛产奶性状遗传效应[D].北京：中国农业大学，2013.”。
5个产奶性状和基因型关联分析结果如表5所示。从表5中可以看出：
在第一泌乳期时，
g.72834301C>A与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到极显著关联水平(P＜0.001)，优势等位基因为C。CA基因型的牛个体的305天产奶量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体的305天产奶量高于AA基因型的牛个体；CC基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于CA基因型的牛个体，CA基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体。
g.72834229C>A与乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到显著或极显著关联水平(P＝0.0494-P＝0.003)，优势等位基因为C。CC基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于CA基因型的牛个体，CA基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；CC基因型的牛个体的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的乳蛋白率高于CA基因型的牛个体。
g.72833969A>G与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到极显著关联水平(P＜0.0057)，优势等位基因为A。AG基因型的牛个体的305天产奶量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的305天产奶量高于GG基因型的牛个体；AA基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体。
g.72833562G>T与乳脂量和乳蛋白量分别达到极显著关联水平(P＝0.0029)和显著关联水平(P＝0.0275)，优势等位基因为T。TT基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于GT基因型的牛个体，GT基因型的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体。
g.72819850A>G与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到极显著相关(P<0.0021)，优势等位基因为A。AA基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体。
g.72818819A>G与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到显著或极显著关联水平(P＝0.0108-P＝0.0004)，优势等位基因为C。GG基因型的牛个体的305天产奶量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体的305天产奶量高于AA基因型的牛个体；AA基因型的牛个体的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于GG基因型的牛个体。
g.72818292T>C与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到显著相关(P＝0.0253-P＝0.0156)，优势等位基因为T。TT基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体，TC基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体。
g.72818161T>C与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到显著相关(P<0.0004)，优势等位基因为T。TT基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体，TC基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体。
在第二泌乳期时，
g.72834301C>A与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著关联水平(P＜0.0051)。CA基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AA基因型的牛个体。
g.72834229C>A与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著关联水平(P＜0.001)，优势等位基因是C。CA基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；CA基因型的牛个体的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的乳蛋白率高于CC基因型的牛个体。
g.72833969A>G与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著关联水平(P＜0.0015)，优势等位基因是A。AG基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；AG基因型的牛个体的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体。
g.72833562G>T与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著关联水平(P＜0.0014)，优势等位基因是T。GT基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；GT基因型的牛个体的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体的乳蛋白率高于TT基因型的牛个体。
g.72819850A>G与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到极显著相关(P<0.003)。GG基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体。
g.72818819A>G与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著关联水平(P＜0.0003)，优势等位基因为A。AG基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；AG基因型的牛个体的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体。
g.72818292T>C与305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量达到显著相关(P<0.0057)，优势等位基因为C。CC基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体。
g.72818161T>C与305天产奶量极显著相关(P＝0.0078)，与乳脂量和乳蛋白率达到显著相关(P<0.0239)，优势等位基因为C。CC基因型的牛个体的305天产奶量和乳脂量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体的305天产奶量和乳脂量高于TC基因型的牛个体；TC基因型的牛个体的乳蛋白率高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体的乳蛋白率高于CC基因型的牛个体。
表5ATF3基因与产奶性状关联分析(最小二乘均值±标准误)
注：*P<0.05，表示差异显著；**P<0.01，表示差异极显著。a,b同一列数据有不同上标表示差异显著；A,B同一列数据有不同上标表示差异极显著。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种基于ATF3基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用
<160>15
<210>1
<211>22bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tgtaagggag ggaaatagac ac 22
<210>2
<211>18bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
tctggagctt cgggaaag 18
<210>3
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
tgcgaaagct gaaggtgtat 20
<210>4
<211>17bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
ggcatgagcc aatggtg 17
<210>5
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gagatggtga tgtagggagt 20
<210>6
<211>21bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
aagccttcac gaagagttct a 21
<210>7
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
gagatggtga tgtagggagt 20
<210>8
<211>21bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
aagccttcac gaagagttct a 21
<210>9
<211>16bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
ggaagccttg acacct 16
<210>10
<211>17bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
tattccacgg catagac 17
<210>11
<211>1077bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
tgtaagggag ggaaatagac acagagaggc ccttccatga cggctgttaa cagtcgagtg 60
gggcggggct gtgggagaga tctgggctcc cagagccttc tagttcctac ccccaaattg 120
ccacactagg accctggacc gtctctctct ctctctaaag gcaggtggaa gcaggtaccc 180
ctaaacccca cgggcgcgcg gttctccctc tcccataggt gccaaacaga gctggccaca 240
gtcgcgtcca cccacattcg tcaatgagca gttgagacgg tctctggtcc tagacagctg 300
ggctcgggga atcggaactg gaagctcgat tttaagattc agatccagtt ctgatgaaga 360
ctcggctcga gtctgggccg cgagatcccg cccttcccgc cacacgactt tagggagaaa 420
aggatttctg ctacggggcc taatttgcta tacggttaat gcgtctacag cccgggcggt 480
ccggtccccg cgcgatcctc tctgggcgca ggaaaacatg cgaaagctga aggtgtattt 540
tccagcaaca ctgccagaaa gccgggcgac ccccgcccgg cccggcccgc ggagaccaaa 600
gcaccttctc tttacttctc ctcctagtct ctaggcttca atcttacttt tagcccttct 660
ctgagttgac tctgattttt tccaggtcgc tcatcttttc tcgggcttgt tcgtttcact 720
gtcaatttca aacgttttgt ggctgttaaa aaaaattctc tccctgccgc tcgccctggc 780
ctcagcgtcg ggttcccaag ccgccgggag gcggttccgc gtgtgcgcct atgtggggtg 840
tgctcgagcc ccgggcgtgg gcgcaccgtg ccctccgatc gctgacaagt cttctcacgg 900
tcccggccac agaggtcacc ctcggcggta acggcgtgga ttcaccgtag ggtgcctcta 960
agctcttctc ccacactggg gaaatgacac tcctcttcgt accccgtccc ctacttgaaa 1020
aggaggcttt tgacggggaa gcggaagggg gggtgtgtac tttcccgaag ctccaga 1077
<210>12
<211>739bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
tgcgaaagct gaaggtgtat tttccagcaa cactgccaga aagccgggcg acccccgccc 60
ggcccggccc gcggagacca aagcaccttc tctttacttc tcctcctagt ctctaggctt 120
caatcttact tttagccctt ctctgagttg actctgattt tttccaggtc gctcatcttt 180
tctcgggctt gttcgtttca ctgtcaattt caaacgtttt gtggctgtta aaaaaaattc 240
tctccctgcc gctcgccctg gcctcagcgt cgggttccca agccgccggg aggcggttcc 300
gcgtgtgcgc ctatgtgggg tgtgctcgag ccccgggcgt gggcgcaccg tgccctccga 360
tcgctgacaa gtcttctcac ggtcccggcc acagaggtca ccctcggcgg taacggcgtg 420
gattcaccgt agggtgcctc taagctcttc tcccacactg gggaaatgac actcctcttc 480
gtaccccgtc ccctacttga aaaggaggct tttgacgggg aagcggaagg gggggtgtgt 540
actttcccga agctccagaa aatgaccacg cattttagag aaaggtcgtt tctagcttcc 600
cagtctcacc tagtctgggc agcgtccagg acccacctct ccaacctcac ccccaacccc 660
cacctcccca gcctagcgga gggagagatg ccagcgcggt ggagtcatgc cgctggcttg 720
ggcaccattg gctcatgcc 739
<210>13
<211>317bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
gagatggtga tgtagggagt gatttgagct ttgactattc ttcaggtgtt ctttgttctc 60
tggggtgcca ctaggtgggc tttttgactt tcaatcctgt tcctcaattt ctggtttcta 120
atgctcaatc tctcattgac aaacactagg acacagcagc aagtatatcc tttagacttt 180
tggtactaag acagaaattt tatataaaat ctgaatacct gaacttgctg tttctctgaa 240
tatacaaagg cctaaaatgt acacctgttg ttcaacttga atcttacagt ctgtggtaga 300
actcttcgtg aaggctt 317
<210>14
<211>718bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
tttctcccag caatcttgat tccagtctgt gcttcatcca gcccagaatt tcacatgatg 60
tactctgcat ataagtcaat aagcagggtg acaatataca gcctggtgta ctccttcccc 120
aatttggaac cagtctgttg ttccatgtcc agttctaact gttgcttctt gacctgcata 180
cagatttctc aggaggcagg taaggtggtt tggtattccc atctcttgaa aaatttgcca 240
cagtttgttg tgatctatac agtaaagggt tttggcataa tcaataaagc agaagtagat 300
gtttttctgg aactctcttg ctttttcgat gatccaatgg atgttggcaa tttgatctct 360
ggttcctctg ccttttctaa atccagcttg aacatgagga agttcacggt tcacgtactg 420
ttgaagcctg gcttggagaa ttttgagcat tactttgcta gcgtgtgaga tgagtgcaat 480
tgtgcaggaa tttgaacatt ctttggcatt gcccttcttc tttatgcttg tgcaaacagc 540
ccctgcgtgg aaacctacat cttcgctctc ggcacacttc cgcccatggt gaattggggg 600
atgggtagcc tgaaatgtaa gctccagttc caaaagtctg ctaggtgccc tcctggaggg 660
taatatctct ctactgggca gaaattgttt ggaagccttg acacctacag ggaacacg 718
<210>15
<211>282bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
gaagccttga cacctacagg gaacacgtac tgttagacac tctgcttcac tgccactctc 60
acagagctaa tcacagaata aatgatttct aaattgtggc ttgaaagttc tgagaaaggc 120
ccctgctccc aactctttta tccgaagttt gattgcaatg cctgaactcc caccttaggg 180
ggtcatgcct tgaggataag ggcgatcttt ccattaaaat acacacagat gcccatcaac 240
agatgattgg ataaacaaac tgtagtctat gccgtggaat ac 282

Claims (9)

1.检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状中的应用；
或检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状的产品中的应用；
所述产奶性状为305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率。
2.检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在牛育种中的应用；
或检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备牛育种的产品中的应用。
3.检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳蛋白量高和/或乳蛋白率高的牛中的应用；
或检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备选育选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳蛋白量高和/或乳蛋白率高的牛的产品中的应用。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：
所述检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组16号染色体上第72833562位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下3)或4)：
3)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对C；
4)由序列C所示的单链DNA分子和序列D所示的单链DNA分子组成的引物对D；
所述序列C为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；
所述序列D为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组16号染色体上第72819850位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下5)或6)：
5)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对E；
6)由序列E所示的单链DNA分子和序列F所示的单链DNA分子组成的引物对F；
所述序列E为将序列5删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5具有相同功能的核苷酸；
所述序列F为将序列6删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列6具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组16号染色体上第72818819位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下7)或8)：
7)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成的引物对G；
8)由序列G所示的单链DNA分子和序列H所示的单链DNA分子组成的引物对H；
所述序列G为将序列7删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列7具有相同功能的核苷酸；
所述序列H为将序列8删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列8具有相同功能的核苷酸；
或所述检测牛基因组16号染色体上第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下9)或10)：
9)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对I；
10)由序列I所示的单链DNA分子和序列G所示的单链DNA分子组成的引物对G；
所述序列I为将序列9删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列9具有相同功能的核苷酸；
所述序列G为将序列10删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列10具有相同功能的核苷酸。
5.一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的方法，为如下(1)-(8)中任一种：
(1)是检测牛个体的基因型是CC基因型还是AA基因型还是CA基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
CA基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AA基因型的牛个体；CC基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于CA基因型的牛个体，CA基因型在第一泌乳期的牛个体的乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；
CA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AA基因型的牛个体；
所述CC基因型为牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基均为A的纯合体；
所述CA基因型为牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸位点的碱基为C和A的杂合体；
(2)是检测牛个体的基因型是CC基因型还是AA基因型还是CA基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
CC基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于CA基因型的牛个体，CA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；CC基因型的牛个体在第一泌乳期的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳蛋白率高于CA基因型的牛个体；
CA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体；CA基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于CC基因型的牛个体；
所述CC基因型为牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基均为A的纯合体；
所述CA基因型为牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸位点的碱基为C和A的杂合体；
(3)是检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
AG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于GG基因型的牛个体；AA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；
AG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；AG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基均为A的纯合体；
所述GG基因型为牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基均为G的纯合体；
所述AG基因型为牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸位点的碱基为A和G的杂合体；
(4)是检测牛个体的基因型是GG基因型还是TT基因型还是GT基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
TT基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于GT基因型的牛个体，GT基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；
GT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；GT基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于TT基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基均为G的纯合体；
所述TT基因型为牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述GT基因型为牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸位点的碱基为G和T的杂合体；
(5)是检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量：
AA基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；
GG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AG基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述AG基因型为牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸位点的碱基为A和G的杂合体；
(6)是检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
GG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于AA基因型的牛个体；AA基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于AG基因型的牛个体，AG基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于GG基因型的牛个体；
AG基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于AA基因型的牛个体，AA基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于GG基因型的牛个体；AG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于GG基因型的牛个体，GG基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于AA基因型的牛个体；
所述GG基因型为牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基均为G的纯合体；
所述AA基因型为牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基均为A的纯合体；
所述AG基因型为牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸位点的碱基为A和G的杂合体；
(7)是检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量：
TT基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体，TC基因型在第一泌乳期的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体；
CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体；
所述TT基因型为牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述CC基因型为牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述TC基因型为牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸位点的碱基为T和C的杂合体；
(8)是检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：
TT基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于TC基因型的牛个体，TC基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体；
CC基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳脂量高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量和乳脂量高于TC基因型的牛个体；TC基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于TT基因型的牛个体，TT基因型的牛个体在第二泌乳期的乳蛋白率高于CC基因型的牛个体；
所述TT基因型为牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；
所述CC基因型为牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；
所述TC基因型为牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸位点的碱基为T和C的杂合体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述(1)中，所述检测牛个体的基因型是CC基因型还是AA基因型还是CA基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72834301个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(2)中，所述检测牛个体的基因型是CC基因型还是AA基因型还是CA基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72834229个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(3)中，所述检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72833969个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(4)中，所述检测牛个体的基因型是GG基因型还是TT基因型还是GT基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72833562个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(5)中，所述检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72819850个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(6)中，所述检测牛个体的基因型是AA基因型还是GG基因型还是AG基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72818819个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(7)中，所述检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72818292个核苷酸的PCR扩增产物；
所述(8)中，所述检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型的方法为直接测序或测序含有牛基因组16号染色体上第72818161个核苷酸的PCR扩增产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述(1)和/或(2)和/或(3)中的PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；
或所述(4)中的PCR扩增产物所用的引物为如下3)或4)：
3)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对C；
4)由序列C所示的单链DNA分子和序列D所示的单链DNA分子组成的引物对D；
所述序列C为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；
所述序列D为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；
或所述(5)中的PCR扩增产物所用的引物为如下5)或6)：
5)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对E；
6)由序列E所示的单链DNA分子和序列F所示的单链DNA分子组成的引物对F；
所述序列E为将序列5删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5具有相同功能的核苷酸；
所述序列F为将序列6删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列6具有相同功能的核苷酸；
或所述(6)中的PCR扩增产物所用的引物为如下7)或8)：
7)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成的引物对G；
8)由序列G所示的单链DNA分子和序列H所示的单链DNA分子组成的引物对H；
所述序列G为将序列7删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列7具有相同功能的核苷酸；
所述序列H为将序列8删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列8具有相同功能的核苷酸；
或所述(7)和/或(8)中的PCR扩增产物所用的引物为如下9)或10)：
9)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对I；
10)由序列I所示的单链DNA分子和序列G所示的单链DNA分子组成的引物对G；
所述序列I为将序列9删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列9具有相同功能的核苷酸。
8.一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的产品，为权利要求1-4中任一所述的应用中的所述检测牛基因组16号染色体上第72834301位脱氧核糖核苷酸和/或第72834229位脱氧核糖核苷酸和/或第72833969位脱氧核糖核苷酸和/或第72833562位脱氧核糖核苷酸和/或第72819850位脱氧核糖核苷酸和/或第72818819位脱氧核糖核苷酸和/或第72818292位脱氧核糖核苷酸和/或第72818161位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质。
9.根据权利要求1-4中任一所述的应用或权利要求5-7中任一所述的方法或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述牛为奶牛。
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