CN104232632A - 一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用。本发明公开一种引物，由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的DNA分子组成。本发明公开的分子标记可以应用于检测奶牛的产奶性状，在奶牛的分子育种中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase，FASN)是一种多功能蛋白，负责哺乳动物中乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A从头合成一种长链软脂酸(16:0)(Lock&Garnsworthy，2003)，因此，FASN作为影响不同代谢过程或脂肪性状的候选基因而被研究。FASN的多态在许多研究中显示出与奶牛和肉牛的脂肪性状相关(Morris et al.2007；Schennink et al.2009；Li et al.2011；Matsuhashi et al.2011；Maharani et al.2012；Oh et al.2012)。牛的FASN基因位于19号染色体上，在一些已知的影响牛肉脂肪酸成分，脂肪和乳脂以及相关性状的QTLs区间内(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/BT/index)。
由于FASN基因位于与乳脂相关的QTL区间内，并且是脂肪酸合成的一种关键酶。先前不同的奶牛群体研究发现，FASN与乳脂性状(Roy et al.2006；Schennink et al.2009)和乳脂肪酸组成(Morris et al.2007；Schennink et al.2009；Stoop et al.2009)显著相关，因此，它是奶牛产奶性状的重要候选基因，有望发掘分子标记应用于奶牛的分子育种中。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)是目前SNP批量检测的一种国际通用的平台，效率和准确性均较高。SNPs质谱分析方法的原理是：首先通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,然后加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。质谱分析方法特点是应用MALDI-TOF质谱仪基于根据不同的分子量可以将等位基因排序，如果SNP位点为纯合子，那么质谱仪将会捕捉到2个不同的波谱峰，如果为杂合子，质谱仪将会捕捉到四个不同的波谱峰。不同的波谱峰形状代表电荷标记的不同质量。MALDI-TOF-MS完成的SNP检测的准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短、性价比高。
发明内容
本发明的目的是提供一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用。
本发明提供一种引物，由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的DNA分子组成。
一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述引物。
上述试剂盒中，所述产奶性状为产奶量、乳脂量、乳脂率和/或乳蛋白量；
所述牛为奶牛。
一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：检测待测牛FASN基因序列自5’末端起第18663位的碱基，将在FASN基因自5’末端起第18663位的碱基均为T的个体，记作纯合TT个体，将在FASN基因自5’末端起第18663位的碱基均为C的个体，记作纯合CC个体，将在FASN基因自5’末端起第18663位的碱基为T和C的个体，记作杂合CT个体；在产奶量或乳脂量或乳蛋白量的性状上，纯合TT个体大于杂合CT个体，杂合CT个体大于纯合CC个体；杂合CT个体的乳脂率大于纯合CC个体，纯合CC个体的乳脂率大于纯合TT个体；
所述FASN基因的序列为GenBank登录号为AF285607的序列，该序列的更新日为2003年11月24日。
上述方法中，所述纯合TT个体、纯合CC个体或杂合CT个体的检测方法如下：
以待测牛的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，记作分子标记1，进一步以SEQ ID No.5所示的DNA分子为单碱基延伸引物，采用MALDI-TOF-MS检测分子标记1中的SNP位点；将分子标记1自5’末端起第36位的碱基均为T的个体，记作纯合TT个体；将分子标记1自5’末端起第36位的碱基均为C的个体，记作纯合CC个体；将分子标记1自5’末端起第36位的碱基为T和C的个体，记作杂合CT个体；
所述牛为奶牛。
上述引物或上述任一所述的试剂盒在制备检测或辅助检测牛产奶性状高低的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述产奶性状为产奶量、乳脂量、乳脂率和/或乳蛋白量。
上述引物或上述任一所述的试剂盒在牛育种中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中，所述牛为奶牛。
本发明提供的分子标记可以应用于检测奶牛的产奶性状，在奶牛的分子育种中具有广阔的应用前景，并且该分子标记的检测具有如下优点：简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，适合实验室大群体规模检测的需要。
附图说明
图1为MALDI-TOF-MS验证群体个体SNP位点分型实验流程。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
中国荷斯坦公牛管制冻精样品由北京三元绿荷奶牛养殖中心提供。
女儿群体血样由北京市畜牧兽医总站提供。
实施例1、基因多态性检测
一、以北京地区14头中国荷斯坦公牛作为基因多态性检测的试验群体，提取各公牛管制冻精样品的基因组DNA(方法见名称为“一种公牛冻精基因组DNA的提取方法”，专利号为ZL201110251216.1的发明专利)。用紫外分光光度计准确测定各冻精样品的基因组DNA浓度，并均将其用ddH2O稀释成50ng/μl，再将各样品等量混合成池DNA。
二、根据牛FASN基因序列(GenBank登录号为AF285607，更新日为2003年11月24日)，利用primer3.0(http://primer3.wi.mit.edu/)软件进行引物设计，共设计30对引物，覆盖了FASN基因82.83％的全长序列，发现多态性位点的引物序列如表1所示，用双蒸水将其稀释到浓度为10pmol/μl。
表1 FASN基因PCR扩增引物序列信息
三、以池DNA作为模板，以FEx-41-F和FEx-41-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应体系和反应条件分别如表2和表3所示。
表2 PCR反应体系
表2中的premix为Taq DNA聚合酶(购自TAKARA，产品目录号为R004A)所带的试剂。
表3 PCR反应条件
将PCR扩增产物进行测序，通过序列比对鉴定出公牛群体FASN基因上存在的表4所示的SNP g.18663T>C，该SNP位点在PCR扩增产物自5’末端起第415位。
表4 FASN基因发现的1个SNP情况
g.18663T>C代表该SNP位于FASN基因序列(GenBank登录号为AF285607，更新日为2003年11月24日)自5’末端起第18663位，单条染色体上该位点为T或C,因此，根据该位点个体的基因型可为TT,CC或者CT，其中牛在FASN基因序列(GenBank登录号为AF285607，更新日为2003年11月24日)自5’末端起第18663位的碱基均为T的个体，记作纯合TT个体，将牛在FASN基因序列(GenBank登录号为AF285607，更新日为2003年11月24日)自5’末端起第18663位的碱基均为C的个体，记作纯合CC个体，将牛在FASN基因序列(GenBank登录号为AF285607，更新日为2003年11月24日)自5’末端起第18663位的碱基为T和C的个体，记作杂合CT个体。
实施例2、MALDI-TOF-MS验证群体个体SNP位点分型
根据实施例1的14头中国荷斯坦公牛检测出FASN基因的SNP(g.18663T>C)情况从中选出752头女儿作为验证群体(具体是保留g.18663T>C位点为杂合子的公牛，并选取女儿数较多的并且较均匀分布在不同奶牛场的公牛的女儿)，进行群体基因型分型。
提取女儿群体血样(为非抗凝血)的基因组DNA，根据SNP(g.18663T>C)位点设计和合成表5所示的目的序列片段的扩增引物和延伸引物。MALDI-TOF-MS验证群体个体SNP位点分型，实验流程如图1所示，方法参见文献“李芹,MALDI-TOF-MS分析鸡群体遗传特性及雪山鸡肉质SNPs位点筛选[D].扬州：扬州大学，2012。”，确定个体的FASN基因的SNP(g.18663T>C)位点的碱基组成。
表5 MALDI-TOF-MS扩增和延伸引物
(SNP(g.18663T>C)位点在以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA分子为引物得到的PCR扩增产物的5’末端起第36位)
实施例3、统计分析
一、关联分析
记录实施例2的752头试验母牛的305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率等5个产奶性状的表型。分型个体系谱追溯三代(追溯每一代母牛个体的父母，一直到外祖父，构建亲缘关系矩阵A，从而导出固定效应里的G阵(G＝A*σa2),不涉及基因型和生产性状)，统计分析的动物个体数达到2212，采用MATLAB和Haploview v.4.2分别计算关系矩阵和连锁不平衡。基因型对产奶性状的影响采用SAS9.1.0软件MIXED过程，关联分析采用动物模型：Y＝μ+hys+L+G+α+e，其中Y为产奶性状(个体305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率)观察值；μ为总体均值；hys是场年季效应；L是哺乳期的固定效应；G为基因型效应；α是个体随机加性遗传效应；e为随机残差效应(参考文献“M A Alim,Y P Fan,X P Wu,et al.Geneticeffects of stearoyl-coenzyme A desaturase(SCD)polymorphism on milk productiontraits in the Chinese dairy population.Mol Biol Rep,2012,39:8733–8740.”)。
FASN的SNP位点(g.18663T>C)与奶牛产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率等5个产奶性状进行关联分析，结果如表6所示。表6表明，该位点与305天产奶量，乳脂量,乳蛋白量和乳脂率均达到显著关联水平(p<0.05)，TT基因型个体的产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量大于CT个体，CT个体的产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量大于CC个体；CT个体的乳脂率大于CC个体，CC个体的乳脂率大于TT个体。
表6g.18663T>C与中国荷斯坦奶牛产奶性状的关联分析(最小二乘均值±标准误差)
(表6中的P值是经过Bonferroni法校正之后的P值：通过选择使用的显著性阈值0.05除以同时进行假设检验的次数作为校正后的显著性阈值与每个位点假设检验的P值进行比较。如果仍然小于校正后的阈值，可判定该位点与性状之间的关联是显著的。)
注释：*P<0.05表示差异显著，**P<0.01表示差异极显著。a,b同一列数据有不同上标表示差异显著；A,B同一列数据有不同上标表示差异极显著。
二、遗传效应分析
利用SAS9.1软件进行SNP的加性效应(a)，显性效应(d)和等位基因替代效应(α)显著性检验，验证基因型效应的准确性，检验基因型和等位基因之间的替代效应是否显著。
计算公式如下：
a＝(XAA-XBB)/2，d＝XAB-(XAA+XBB)/2和α＝a+d(q-p)。
其中XAA,XBB和XAB为相应基因型产奶性状的最小二乘均值。
p和q分别代表C和T在对应位点的基因频率。
方法参见文献“Effect of FASN gene on milk yield and milk composition inthe Chinese Holstein dairy population.Alim MA,Wang P,Wu XP,Li C,Cui XG,Zhang SL,Zhang Q,Zhang Y,Sun DX.Anim Genet.2013 Sep 9.doi:10.1111/age.12089.[Epub ahead of print]”。
加性效应和等位基因替代效应检测结果如表7所示。
表7表明，g.18663T>C对产奶量、乳蛋白量和乳脂量的加性效应和等位基因替代效应显著，即每个T等位基因替代C等位基因会导致305天产奶量提高122.59kg(p<0.01)，乳脂量提高6.53kg(p<0.01)和乳蛋白量提高2.758kg(p<0.01)。
表7 g.18663T>C对中国荷斯坦奶产奶性状的遗传效应
注释：*P<0.05表示差异显著；**P<0.01表示差异极显著。
Claims (8)
1.一种引物，由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的DNA分子组成。
2.一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述产奶性状为产奶量、乳脂量、乳脂率和/或乳蛋白量。
4.一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的方法，包括如下步骤：检测待测牛FASN基因序列自5’末端起第18663位的碱基，将在FASN基因自5’末端起第18663位的碱基均为T的个体，记作纯合TT个体，将在FASN基因自5’末端起第18663位的碱基均为C的个体，记作纯合CC个体，将在FASN基因自5’末端起第18663位的碱基为T和C的个体，记作杂合CT个体；在产奶量或乳脂量或乳蛋白量的性状上，纯合TT个体大于杂合CT个体，杂合CT个体大于纯合CC个体；杂合CT个体的乳脂率大于纯合CC个体，纯合CC个体的乳脂率大于纯合TT个体；
所述FASN基因的序列为GenBank登录号为AF285607的序列，该序列的更新日为2003年11月24日。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述纯合TT个体、纯合CC个体或杂合CT个体的检测方法如下：
以待测牛的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，记作分子标记1，进一步以SEQ ID No.5所示的DNA分子为单碱基延伸引物，采用MALDI-TOF-MS检测分子标记1中的SNP位点；将分子标记1自5’末端起第36位的碱基均为T的个体，记作纯合TT个体；将分子标记1自5’末端起第36位的碱基均为C的个体，记作纯合CC个体；将分子标记1自5’末端起第36位的碱基为T和C的个体，记作杂合CT个体。
6.权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测牛产奶性状高低的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述产奶性状为产奶量、乳脂量、乳脂率和/或乳蛋白量。
8.权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂盒在牛育种中的应用。
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