CN105861671A - 检测奶牛β-酪蛋白基因SNP的引物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于确定奶牛β‑酪蛋白基因多态性位点(SNP)的引物系统或组合物。基于该引物系统或组合物所制备的产品，可以通过检测奶牛β‑酪蛋白基因多态性位点，筛选出具有编码蛋白质β‑酪蛋白A2基因的奶牛，从而为专产更为优质健康的A2牛奶的奶牛群的筛选和相关利用提供了指导。

Description

检测奶牛β-酪蛋白基因SNP的引物组合物及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于确定奶牛是否具有β-酪蛋白A2蛋白基因或者β-酪蛋白A1蛋白基因的检测方法，具体而言，即利用PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对奶牛的β-酪蛋白基因进行检测，确定该奶牛是否具有β-酪蛋白A2蛋白基因或者β-酪蛋白A1蛋白基因，以及它们产生含β-酪蛋白A1或β-酪蛋白A2牛奶的能力，涉及筛选专产β-酪蛋白A2牛奶的奶牛的筛选方法。
背景技术
牛乳蛋白主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类，酪蛋白中又分为β-酪蛋白(β-CN)、K-酪蛋白(k-CN)和α-酪蛋白(α-CN)，其中，β-酪蛋白约占蛋白质总量的30％，且广泛存在于各种奶制品中，是氨基酸的重要来源，能参与矿物质转运，并且可被分解成相对分子质量更小的生物活性肽，同时在体内传递重要的矿物质(如钙和磷等)，促进其消化吸收。
牛奶中的β-酪蛋白有两个主要的变异型，称为A1和A2，此外，尚有一些罕见的亚变异型(如A3等)。其中，A2-β酪蛋白是现代奶牛β-酪蛋白的天然原型。最初，所有家养的牛只含有A2型β-酪蛋白，后来因自然基因突变，出现了A1蛋白质的变体，即今天全球普遍存在的A1型牛奶β-酪蛋白。A1型与A2型β-酪蛋白的区别在于第67位的氨基酸。A1型β-酪蛋白的第67位为组氨酸，其前7个氨基酸残基可以被裂解产生β-酪啡肽-7(BCM-7)。而A2型的第67位为脯氨酸，其无法裂解。
现已发现，BCM-7能穿过胃肠壁进入血液循环，并通过阿片受体影响全身和细胞活动。此外，BCM-7和其他β-酪蛋白衍生物为阿片受体的强效外源性激动剂—外啡肽，其中与μ受体的亲合力最大。因此，BCM-7可能影响多个器官/系统的活动，尤其消化系统和免疫细胞。此外，BCM-7也可能与婴幼儿的各种疾病有关，如，Ⅰ型糖尿病和呼吸功能障碍，消化功能疾病，促使产生肛瘘，免疫功能疾病，并影响中枢神经系统活动。
牛奶与母乳的蛋白质成分差异颇大。如，母乳主要含乳清蛋白，酪蛋白:乳清蛋白约为40:60(泌乳早期10:90，泌乳后期50:50)，而牛奶的酪蛋白:乳清蛋白则高达80:20。比较而言，人乳中的β-酪蛋白与牛奶中的A2型β-酪蛋白结构更为相似，人β-酪蛋白同样不会产生BCM-7，不会发生由BCM-7导致的负面影响。因此，基于与母乳更为接近、同样不产生BCM-7的A2型β-酪蛋白制成的配方奶因其不含A1型β-酪蛋白，更有利于促进婴幼儿的生长发育。筛选专产A2型β-酪蛋白的奶牛进行挤奶并用于生产只含A2型β-酪蛋白的高端优质配方奶对于改善目前的国产奶粉品质具有重要作用。
另外，乳业是一个国家发达程度和食品消费现代化水平的重要标志，其发展对优化农业结构，促进畜牧业产业升级，增加农民收入，提高国民身体素质，都具有重要意义。当前我国的乳业正处于从传统乳业向现代乳业转型的关键时期，未来乳业的发展将从注重数量型向质量型升级。由于并不是所有的奶牛都能产出只含纯净A2型β-酪蛋白而不含A1型β-酪蛋白的牛奶，因此，A2型β-酪蛋白的奶源非常稀有。现今，西方的奶牛中只有约30％的奶牛为纯正的A2奶牛，由其所产的牛奶只含100％纯净A2型β-酪蛋白。如果我国能掌握A2β-酪蛋白的奶源的鉴定技术，根据我国庞大的奶牛牲畜资源，从中筛选出纯产A2型奶的奶牛，从而发展中国特色的A2奶制品加工产业，对于提升中国的乳业行业发展水平具有不可估量的作用。
对此，中国发明专利申请03815808，发明名称“改变牛奶中脂肪酸组成的方法”公开了一种通过检测畜群中各个奶牛的第67位脯氨酸的DNA来筛选含有在67位上带有组氨酸的β-酪蛋白的牛奶的奶牛的方法。该方法包括：①提取DNA并测定牛奶的脂肪酸组成；②将用于脂肪酸分析的样品进行气相色谱法进行分析，并将色谱图上的峰面积进行积分以定量每个脂肪酸的水平，通过将每个峰的保留时间与已知标准相比较来确定每种脂肪酸的身份；③使用广义线性模型比较基因型之间的差异。然而，该方法需要反复筛选色谱参数进行比较，同时涉及到建立模型及数学分析等过程，因此过程非常繁琐，耗时耗力，难以适应中国大规模的种畜筛查。
中国发明专利申请03817455.3，名称“动物基因分型方法”公开了确定牛是否编码β-酪蛋白A2基因或者是编码β-酪蛋白A1基因的方法，采用的不同类型的测序方法，如，寡核苷酸连接测定法，焦磷酸测序。实验结果显示，该方法所使用的测序方法能够较好地完成奶牛基因分型情况。然而，该发明中所涉及的位点AC61仍然只能适用传统的PCR测序法，在适用于最新一代的检测技术时存在一定的误差。
另外，以上技术一直独家保留在新西兰A2有限公司，同时要甄选出基因纯正的A2奶牛确保生产出合格的A2牛奶，需要极高的技术和专业的质量检测系统。目前该公司实施的技术壁垒和A2奶牛种质资源的封锁，势必又进一步导致了A2型β-酪蛋白的珍稀性。我国奶粉进口对新西兰依存度最高。2002～2011年，进口新西兰奶粉由7.04万t增加到36.71万t，占奶粉进口量的比例由62.98％提高到80.79％。其中，进口全脂奶粉15.74万t，同比增长384.4％，在我国市场占有率由2008年的70.5％提高到2009年的89.3％。进口脱脂奶粉4.65万t，同比增长156.7％，市场占有率达到66.0％，由此可见新西兰在我国奶粉进口来源国中形成绝对垄断地位。其中，A2公司是全球第一也是唯一一家掌握A2型β-酪蛋白的商业化牛奶的商业化公司，垄断了我国高端婴幼儿奶粉市场。因此，“有恃无恐”地不断涨价。从2006年7月至2010年2月，洋奶粉已经先后6次上调价格，其中单次最高涨幅超过20％。即使受欧洲债务危机的影响，在欧盟地区的多个国家原料奶和“洋乳品”售价不断下跌的状况下，国内市场洋乳品价格仍居高不下。近两年，“洋奶粉”涨价时间间隔缩短，平均每季提价1次，每次涨价幅度为10％～15％。据有关资料显示，一罐800g的雀巢超级能恩1段婴儿奶粉国内售价340元，而通过海外代购渠道，其价格仅为185元；德国特福芬有机婴幼儿奶粉2段在其官网上价格为9.95欧元，约合81元人民币，仅仅为内地销售价格的1/4，而有的“洋奶粉”国内售价约为生产国当地卖价的3倍。
然而，自从加入WTO以后，我国乳制品关税趋于降低，非关税贸易壁垒进一步削减，而乳制品进口主要来源地却不同程度地存在倾销和补贴。针对这种国际贸易中的不公平行为，我国除了运用世贸组织规则允许的反补贴、反倾销和保障措施来维护本国乳业的利益，大力提升我国奶制品产量及质量成为振兴和发展我国乳制品行业所刻不容缓的任务。为此，发明人尝试与国内乳制品行业合作，通过建立A2奶牛饲养产业以及A2奶制品加工，为中国乳制品行业的复兴探索新的道路。
目前，对于β-酪蛋白的研究表明，β-酪蛋白(β-CN)的编码基因CSN2全长8.5kb，共发现A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G、H1、H2和I 12种基因型，其中A1和A2在奶牛中最常见。除了A2公司研究的SNP位点之外(αs2酪蛋白的外显子17-18位的AC61位点)，8101位点(即A1/A2基因型)也影响着β-酪蛋白基因的多态性。因此，对于该位点的研究分析，成为当前国内检测A2奶牛的研究重点。
检测牛乳蛋白多态性的方法主要分为蛋白和分子水平进行分析。在蛋白水平检测方面，刘建新等人(高效液相色谱法分析中国荷斯坦奶牛乳蛋白多态性，《中国食品学报》第12卷第10期，2012年)报道了通过反向高效液相色谱法分析中国荷斯坦奶牛乳蛋白多态性的方法，并成功检测了牛乳中包括A1、A2、A3、B、C、D、E多种分型的β-CN，从而为比较不同地区奶牛的差异和牛乳的加工选择提供科学依据。
在分子水平检测方面，马美蓉等人(荷斯坦奶牛乳蛋白基因多态性与泌乳性能的关联分析，《遗传育种》第48卷第9期，2012年)报道了采用焦磷酸测序法分析荷斯坦奶牛的酪蛋白复合基因的多态性，并通过数学模型分析基因多态性与奶牛泌乳性能的关联。虽然该文献报道了κ-CN B和β-CN A1基因是影响泌乳性能的主要基因，可作为改良奶牛产奶性状的分子遗传标记。但该文献进一步建议焦磷酸测序技术能有效用于基因分型和进行标记辅助育种。
在以上研究的基础上，刘建新等人(焦磷酸测序法分析中国荷斯坦牛、娟姗牛及水牛的乳蛋白基因多态性，《食品安全质量检测学报》第5卷第10期，2014年10月)全面回顾了在分子水平上对乳蛋白多态性的检测方法，包括采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP),聚合酶链反应单链构象多态(PCR-SSCP)及焦磷酸测序(Pyrosequencing)和微卫星等高通量测序技术。其中，重点介绍了使用焦磷酸测序法对包括8101位点在内的7个位点进行分析，并结合液相色谱技术分析各种基因型频率。最终结果表明荷斯坦牛和娟姗牛在乳蛋白多态位点上存在多种等位基因，具有多种基因型，但并没有明确指出CSN2的8101位点是最适宜的检测位点。
综上所述，如何筛选和建立A2奶牛种畜资源成为当前的首要任务。目前国内尚无有关检测编码A2β-酪蛋白基因方法及研究，并且现有国际上相关检测技术仍然停留在传统PCR相关测序技术。因此，考虑到我国乳业产业的转型和升级，如果需要推进A2奶业的发展，必须首先根据中国国情需要建立检测奶牛中β-酪蛋白的方法，同时筛选出只编码A2型β-酪蛋白而不编码A1型β-酪蛋白的奶牛，继而可以利用只编码A2型β-酪蛋白奶牛产的牛奶生产纯的A2型β-酪蛋白型的奶粉或鲜奶。
发明内容
本发明的原理在于：提供了一种联合PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测奶牛是否具有β-酪蛋白A2蛋白基因或者β-酪蛋白A1蛋白基因的检测方案。其中，使用针对β-酪蛋白基因的引物进行PCR扩增；然后对经过纯化的PCR产物进行单碱基延伸，特异性的延伸引物延伸一个核苷酸，所延伸的核苷酸类型与β-酪蛋白的A1蛋白或A2蛋白基因型对应相关；以质谱技术对单碱基延伸产生的由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定β-酪蛋白的基因型。
因此，本发明的第一个目的是提供一种用于核酸质谱检测奶牛是否具有β-酪蛋白A2/A1基因的引物组，其序列如下表所示。
在一个实施方案中，所述引物组如下表1所示。
编号 序列(5’→3’) 针对位点 用途
SEQ ID No:21 TAAAATCCACCCCTTTGCCC CSN2(8101) PCR引物
SEQ ID No:22 AGAGGAGGGATGTTTTGTGG CSN2(8101) PCR引物
SEQ ID No:23 TTGTGGGAGGCTGTTA CSN2(8101) 延伸引物
SEQ ID No:24 CAGAGAAACCAAAACTGCAAG A2(AC61) PCR引物
SEQ ID No:25 AATGACAATGGGCTGATACG A2(AC61) PCR引物
SEQ ID No:26 GGCTGATACGTTAAGAAAT A2(AC61) 延伸引物
在上述实施方案中，其中，延伸引物及延伸产物的分子量如下表2所示。
在一个实施方案中，上述引物组仅包括SEQ ID No:21-23或SEQ ID No:24-26的组合。
在另一个实施方案中，上述PCR扩增引物序列为核心序列，其在5’端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5’端加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，例如，在PCR引物SEQ ID No:21的5’端加入10bp的tag(ACGTTGGATG)后即为：
5’-ACGTTGGATGTAAAATCCACCCCTTTGCCC-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5’端也可以增加作为接头的碱基序列。
本发明第二个目的是提供了由上述引物组所制备的用于确定奶牛中是否存在β-酪蛋白A2/A1基因的核酸质谱检测产品。
在一个实施方案中，该检测产品为检测试剂盒，包括：
(1)用于PCR的反应试剂，包括：上述特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；
(2)用于PCR产物纯化的试剂；
(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：上述延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。
在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶等试剂。
在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中，当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
本发明第三个目的是利用上述引物组、检测产品或试剂盒，用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)PCR反应：使用上述特异性的针对包含所选择SNP位点片段的PCR扩增引物，在一个反应体系内，得到含扩增目标区域的PCR产物；
(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸：使用上述所选择SNP位点的特异延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行单碱基延伸；
(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测，得到不同SNP位点延伸产物的核酸谱图；
(6)将得到的不同SNP位点延伸产物的核酸谱图，经过质谱仪配套软件分析后，确认SNP位点的碱基，从而判定该样本的基因型。
其中，用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为：CSN2(8101)：[C/A]，C碱基代表A2型，A碱基代表A1型；和/或
AC61：[G/A]，A碱基代表A2型，G碱基代表A1型。
在一个实施方案中，用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为：CSN2(8101)：[C/A]，C碱基代表A2型，A碱基代表A1型。
在一个实施方案中，步骤(2)的纯化过程可以选择碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoⅠ消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoⅠ消化进行纯化后，进行高温酶灭活处理。
本发明第四个目的是提供了一种生产β-酪蛋白A2牛奶的方法，步骤包括：
(1)根据前述检测产品或鉴定方法，确定奶牛的β-酪蛋白A2/A1基因分型；
(2)选择只具有编码β-酪蛋白A2基因的奶牛；
(3)对筛选的奶牛进行挤奶。
在一个实施方案中，步骤(1)可以是针对奶牛胚胎、幼体或成体。在一个具体实施方案中，步骤(3)的挤奶之前还包括对奶牛进行繁育直至生产或/及形成所需要的生产种群的步骤。
在另一实施方案中，包括步骤(4)的对奶进行加工制成奶制品。
在上述所有实施方案中，所述奶牛优选为中国荷斯坦奶牛。
在上述所有实施方案中，所述奶牛的DNA可以从含有有核细胞的任何组织中得到，该组织优选为该奶牛的血液、精液、毛发或奶。
技术效果
1.敏感：本发明综合了PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本。因此，这种多技术结合的方法远远优于单独使用PCR检测SNP，该方法具有相当高的检测灵敏度。
2.特异：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的准确性高、特异性高、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低。
3.简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染。
4.快速：速度快、通量高，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。
5.检测结果准确且稳定，抗干扰能力强：本发明是使用质谱图谱进行奶牛β-酪蛋白基因型的鉴定，质谱技术具有极强的分辨率和灵敏度，最高分辨率达到9Da，且通过计算机程序判读，人为干扰因素低。相反，传统PCR扩增后凝胶电泳检测，其各自扩增成分的电泳凝胶条带如果区分度过低，将导致结果难以分辨。
6.本发明首次突破了国外技术封锁，填补了国内A2奶产业的检测空白，对于我国乳业产业的转型和升级具有重要的促进和支撑作用。
原理与定义
本发明提供了一种联合PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测奶牛是否具有β-酪蛋白A2蛋白基因或者β-酪蛋白A1蛋白基因的检测方案。其原理在于：使用特异性PCR引物，对待测模板进行扩增，得到含待检SNP位点的PCR产物；PCR产物经过纯化处理后，进行单碱基延伸，在延伸引物后延伸一个核苷酸，该核苷酸与模板互补配对(如，模板为核苷酸A，将在对应的延伸引物上延伸T)；在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸；在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在脱盐纯化后，点至含基质的靶片上，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与其分子量呈负相关，即分子量越大，飞行时间越慢，到达检测器的时间越晚。
术语“PCR扩增”，指在引物和聚合酶的作用下，对于特定的目的片段进行扩增反应，以便进行相应的检测，例如酶切鉴定、测序鉴定等。在本发明中，由于需要考虑到质谱检测的区分度和检测窗口等限制条件，因此，扩增长度不同于普通PCR扩增检测过程，本发明中用于质谱检测的扩增产物长度一般在100-200bp左右。而通常这种扩增产物长度，是难以直接进行酶切鉴定或测序鉴定的。由此可见，本发明的PCR扩增是与常规检测所涉及的PCR扩增是不完全相同的。
术语“保护碱基”，指在PCR引物的5’端额外增加的碱基。保护碱基的序列使得PCR引物的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5’端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。
术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5’-P末端转换成5’-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。
术语“外切酶Exo I消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间的3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后剩余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此在使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3’连接形成延伸产物，即引物延伸了一个碱基。ddNTP与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3’位置缺少了一个羟基，不能与后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅可连接一个ddNTP，故而称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后方可终止延伸，因此，测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中只加入ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸。因此，单碱基延伸反应产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。
术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如，ddCTP、ddATP、ddGTP和ddTTP的分子量分别是247.2Da、271.2Da、287.2Da和327.1Da，其中，ddTTP为修饰后的分子量。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸时，将形成分子量差异。可以通过质谱检测，分辨出这种差异(质谱检测核酸的最小灵敏度约为9Da)。例如，某SNP位点若为G/A多态，对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量为6153Da)，当该SNP位点是G基因型时，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量为6400.2Da的延伸产物；当该SNP位点处为A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量为6480.1Da的延伸产物，两种产物间存在80.1Da的分子量差异。即对该SNP位点而言，使用此6153Da的延伸引物，G基因型将对应6400.2Da的质谱峰，A基因型将对应6480.1Da的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对6153Da、6400.2Da、6480.1Da三处进行观察：若6153Da处出现质谱峰，则表明有部分或全部延伸引物未与ddNTP结合；不论6153Da处是否有质谱峰，若6400.2Da与6480.1Da处仅出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，其基因型与质谱峰的位置对应。如前所述，6400.2Da的质谱峰对应G基因型，6480.1Da的质谱峰对应A基因型；若6400.2Da与6480.1Da两处均出现质谱峰，则该SNP位点的基因型为杂合型；若6400.2Da与6480.1Da两处均未出现质谱峰，则实验失败。
术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离介质，并回收相对较纯的PCR产物，属于第一种纯化方式，该方式一般耗时较长、操作复杂，尤其是样本量大时，更难以提高批量处理能力；碱性磷酸酶的作用是降解(亦称消化)dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，属于第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoⅠ不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA(在反应完成的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性磷酸酶令dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加外切酶ExoⅠ处理，则无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温灭活，其不降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此对后续实验不会产生影响。
术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。为避免不同延伸引物与产物间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对较宽的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多种物质的同时检测。
术语“SNP”基因型，表示物种基因组中单核苷酸多态性的类型。其中，在实际检查中，作为对照的用于检测的基因型既可来自于对于物种的基因组中，也可来自克隆入质粒的载体工具，而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定、易得而受到实际使用者的欢迎。
术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片(如基因芯片、液体芯片等)、检测载体，以及检测试剂盒等。
术语“CSN2(8101)”，指位于CSN2基因(β-酪蛋白基因)第8101位的一个SNP，该SNP位于6号染色体，其67位氨基酸发生变异，导致CSN2基因型的差异。CSN2基因的NCBI登陆号为281099。
术语“A2(AC61)”，指位于αs2酪蛋白(CSN1S2基因)的外显子17-18上的一个SNP，其同样位于6号染色体上(参见中国专利申请03817455.3)。该基因的NCBI登陆号为282209。
应当指出的是，鉴于以上核酸质谱的特殊性，例如，其需先通过PCR反应扩增出含SNP位点的片段，然后通过延伸引物延伸出SNP位点的碱基；各SNP的PCR反应、延伸反应间无明显干扰；各SNP的延伸引物、产物间分子量要有足够大的差异以便实现区分等，因此，并非所有的已知SNP均可以用来进行核酸质谱的检测，也并不是所有针对SNP位点设计的引物均可用以进行多重PCR反应和多重单碱基延伸反应。例如，Cláudia M.B等人(Optimizationof a multiplex minisequencing protocol for population studies and medicalgenetics,Genet.Mol.Res 4(2005)115-125)指出，在进行多重PCR反应前需首先对单重PCR的反应效果进行验证，如果单重PCR扩增效率低则需要放弃；另外，若PCR产物长度偏长，多重PCR效果会比较差，也需要放弃。Nissum M等人(High-throughput genetic screeningusing matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,PsychiatrGenets 12(2002)109-117)也报道了通过MALDI–TOF MS高通量检测SNP的过程中，发现只能获得90％的准确率，其中，在标准实验条件下，竟然有5％的情况不能实施PCR扩增过程，而在单碱基延伸过程中，由于自身引物自身配对、引物二聚体的形成以及扩增产物量过低等因素，也导致有5％的情况难以实现单碱基延伸过程。因此，必须进一步优化核酸质谱实验条件(如扩增引物、实验参数等)，否则将影响MALDI–TOF MS在核酸质谱检测SNP中的应用。例如，本发明在针对AC61位点进行核酸质谱检测中，发现实际生产中的准确率仅为75％，这与利用传统PCR测序技术通过检测该位点从而获得A2奶牛分型准确率97％形成强烈对比。因此，对于已知的AC61位点，在本发明的核酸质谱检测过程中，仅仅作为辅助分型的用途。
此外，在核酸质谱检测过程中，多重扩增过程的干扰作用，对于最终获得的延伸产物也存在影响。Sascha Sauer等人(Typing of single nucleotide polymorphisms byMALDI mass spectrometry:Principles and diagnostic applications，ClinicaChimica Acta 363(2006)95–105)和Heyi Yang等人(Multiplex single-nucleotidepolymorphism genotyping by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，Analytical Biochemistry 314(2003)54–62)在利用MALDI质谱技术研究核酸质谱检测过程中提出，所设计的多重引物应具有相近的熔解温度(Tm值)并彼此间的相互作用力较弱。如果引物之间的相互作用力过于强烈(ΔG的最小值为-10kcal/mol)，那么必须放弃该理论设计的引物而重新进行设计；当同一反应体系中存在多重反应引物，那么多重扩增的规模主要受限于引物之间的相互作用程度，从而影响核酸质谱检测过程；此外，为了准确区分不同碱基之间的差异，特别是腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(4种碱基中这二者分子量之间差值最小，为9Da)，要求的寡核苷酸长度一般不超过40个碱基，实际应用中，质谱检测窗口的分子量范围一般为4000～9000Da，即要求所涉及的延伸引物和产物的分子量尽量分布在4000～9000Da范围之内。同时，要避免各延伸引物及其延伸产物之间的叠合。由此可见，并非所有已知的SNP均可应用于核酸质谱尤其是多重核酸质谱的检测，其实际效果会受到多种实验因素的影响，因此，需要通过实验来验证SNP检测的可行性以及筛选不同的引物组合。
附图说明
图1为实施例四中，对样本N1的检测结果，显示为A纯合(A1型)。
图2为实施例四中，对样本N2的检测结果，显示为CA杂合(A1/A2型)。
图3为实施例四中，对样本N3的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图4为实施例四中，对样本N4的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图5为实施例四中，对样本N5的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图6为实施例四中，对样本N6的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图7为实施例四中，对样本N7的检测结果，显示为A纯合(A1型)。
图8为实施例四中，对样本N8的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图9为实施例四中，对样本N9的检测结果，显示为CA杂合(A1/A2型)。
图10为实施例四中，对样本N10的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图11为实施例四中，对样本N11的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图12为实施例四中，对样本N12的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图13为实施例四中，对样本N13的检测结果，显示为CA杂合(A1/A2型)。
图14为实施例四中，对样本N14的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图15为实施例四中，对样本N15的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图16为实施例四中，对样本N16的检测结果，显示为C纯合(A2型)。
图17为A1型β-酪蛋白奶牛的质粒的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、A2型(C)延伸产物、A1型(A)延伸产物的理论峰值，A位置出峰，代表该质粒为A纯合(A1型)。
图18为对A2型β-酪蛋白奶牛的质粒的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、A2型(C)延伸产物、A1型(A)延伸产物的理论峰值，C位置出峰，代表该质粒为C纯合(A2型)。
图19为对照实施例一中，对样本N1的测序结果，显示为A纯合(A1型)。
图20为对照实施例一中，对样本N2的测序结果，显示为CA杂合(A1/A2型)。
图21为对照实施例一中，对样本N3的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图22为对照实施例一中，对样本N4的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图23为对照实施例一中，对样本N5的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图24为对照实施例一中，对样本N6的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图25为对照实施例一中，对样本N7的测序结果，显示为A纯合(A1型)。
图26为对照实施例一中，对样本N8的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图27为对照实施例一中，对样本N9的测序结果，显示为CA杂合(A1/A2型)。
图28为对照实施例一中，对样本N10的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图29为对照实施例一中，对样本N11的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图30为对照实施例一中，对样本N12的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图31为对照实施例一中，对样本N13的测序结果，显示为CA杂合(A1/A2型)。
图32为对照实施例一中，对样本N14的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图33为对照实施例一中，对样本N15的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图34为对照实施例一中，对样本N16的测序结果，显示为C纯合(A2型)。
图35为对照实施例二中，CK1对照组的质谱检测结果，其中A2(AC61)位点残余的延伸引物(第二条虚线)与CSN2(8101)位点C碱基的延伸产物(第三条虚线)叠加，将会干扰8101位点延伸产物的判定情况。
图36为对照实施例二中，CK2对照组的PCR产物电泳结果(泳道1为表1中引物PCR产物电泳结果、泳道2为CK2引物PCR结果)，与表1引物相比，CK2的引物二聚体较为严重，目的条带模糊，扩增效率低。
图37为对照实施例三中，对样本N5的质谱检测结果，从左至右六条虚线分别是CSN2(8101)位点的延伸引物、CSN2(8101)的A2型(C)延伸产物、CSN2(8101)的A1型(A)延伸产物、A2(AC61)位点的延伸引物、A2(AC61)的A1型(G)延伸产物、A2(AC61)的A2型(A)延伸产物的理论峰值；其中，CSN2(8101)的A位置出峰，显示为A1型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果不匹配。
图38为对照实施例三中，对样本N11的质谱检测结果，CSN2(8101)的A位置出峰，显示为A1型，A2(AC61)的GA位置出峰，显示为A1/A2型，二者判定结果不匹配。
图39为对照实施例三中，对样本N19的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰，显示为A1/A2型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果不匹配。
图40为对照实施例三中，对样本N20的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰，显示为A1/A2型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果不匹配。
图41为对照实施例三中，对样本N21的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰，显示为A1/A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为A1型，二者判定结果不匹配。
图42为对照实施例三中，对样本N26的质谱检测结果，CSN2(8101)的C位置出峰，显示为A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为A1型，二者判定结果不匹配。
图43为对照实施例三中，对样本N29的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰，显示为A1/A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为A1型，二者判定结果不匹配。
图44为对照实施例三中，对样本N32的质谱检测结果，CSN2(8101)的A位置出峰，显示为A1型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果不匹配。
图45为对照实施例三中，对样本N35的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰，显示为A1/A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为A1型，二者判定结果不匹配。
图46为对照实施例三中，对样本N36的质谱检测结果，CSN2(8101)的C位置出峰，显示为A2型，A2(AC61)的GA位置出峰，显示为A1/A2型，二者判定结果不匹配。
图47为对照实施例三中，对样本N43的质谱检测结果，CSN2(8101)的CA位置出峰，显示为A1/A2型，A2(AC61)的G位置出峰，显示为A1型，二者判定结果不匹配。
图48为对照实施例三中，对样本N45的质谱检测结果，CSN2(8101)的C位置出峰，显示为A2型，A2(AC61)的A位置出峰，显示为A2型，二者判定结果一致(A2型)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一：引物设计及合成
针对奶牛β-酪蛋白A2/A1蛋白基因的SNP位点(CSN2(8101))，设计特异性PCR引物核心序列和特异性延伸引物核心序列，如下表所示：
编号 序列(5’→3’) 针对位点 用途
SEQ ID No:21 TAAAATCCACCCCTTTGCCC CSN2(8101) PCR引物
SEQ ID No:22 AGAGGAGGGATGTTTTGTGG CSN2(8101) PCR引物
SEQ ID No:23 TTGTGGGAGGCTGTTA CSN2(8101) 延伸引物
其中，编号为SEQ ID No:23的延伸引物及其延伸产物的分子量见下表：
其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR引物的5'端可以在核心序列(SEQ ID No:21-22)的基础上增加一定数目的碱基，常见如10bp的tag(ACGTTGGATG)，以使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。
相关引物均由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。
实施例二：样本DNA提取
采用商业化的核酸提取试剂盒(如QIAGEN公司的DNeasy Blood and Tissue kit)进行提取，提取后的基因组DNA，在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过两年，-80℃可长期保存，应避免反复冻融，并置于冰盒中进行运输。
(一)关于样本为奶牛精液，其DNA提取步骤如下：
(1)洁净1.5mL离心管中加入1支冻精，用消毒小剪剪去一端，然后再剪另一端，加入500μL生理盐水，涡旋混匀，12,000rpm离心1min，去上清；
(2)重复步骤1，12,000rpm离心2min；
(3)向管中加入400μL含DTT的牛冻精裂解液，再加入100μL 20％的SDS，涡旋混匀，使底部沉淀完全溶解，加入10μL蛋白酶K后颠倒混匀；
(4)将混合样品放置在56℃分子杂交炉中消化20-22h；
(5)向消化好的样品中加入300μL饱和食盐水，颠倒2-3min，4℃放置10min；
(6)4℃，12,000g离心10min，将上清转移到新的2mL离心管中；
(7)加入1mL预冷的无水乙醇，颠倒1-2min，12,000rpm离心2min，去上清；
(8)向离心管中加入500μL 75％的乙醇，颠倒混匀，12,000rpm离心2min，去上清；
(9)重复步骤7，开盖放置5min，挥发乙醇；
(10)向离心管中加入适量的pH8.0ddH2O，溶解沉淀；
(11)浓度测定及电泳检测，-20℃保存。
(二)关于样本为奶牛血液，其DNA提取步骤如下：
(1)取全血200μL放入洁净1.5mL离心管中，加入500μL Lysis Buffer 1，10μL蛋白酶K，充分混匀(涡旋)，于56℃放置30min(期间颠倒混匀3-4次)；
(2)离心，吸上清到新管；
(3)于上清中加入850μL Binding Buffer 2和150μL磁珠(磁珠使用前要充分悬浮)，充分混匀(轻微涡旋)，室温放置5min；
(4)将离心管置于磁力架上1min，使管内磁珠被吸附，用移液器移走管内液体；
(5)在离心管中加入200μL Wash Buffer 3，颠倒混匀数次(也可轻微涡旋)，将磁珠团打散即可，置于磁力架吸附磁珠1min，然后移走管内液体；
(6)在离心管中加入200μL Wash Buffer 4，颠倒混匀数次(也可轻微涡旋)，将磁珠团打散即可，置于磁力架吸附磁珠1min，然后移走管内液体；
(7)在离心管中加入200μL Wash Buffer 5，颠倒混匀数次(也可轻微涡旋)，将磁珠团打散即可，置于磁力架吸附磁珠1min，然后移走管内液体；
(8)在离心管中加入200μL Wash Buffer 6，颠倒混匀数次(也可轻微涡旋)，将磁珠团打散即可，置于磁力架吸附磁珠1min，然后移走管内液体；
(9)将留有磁珠的离心管开盖、于56℃放置10min，充分干燥(注：在加入洗脱液之前，磁珠必须充分干燥)；
(10)加入70μL Elution Buffer 7(可根据实验要求决定洗脱体积)，使用移液器吹打，使磁珠重新悬浮，室温放置10min；
(11)将离心管置于磁力架上1min，使磁珠吸附，将DNA转移至新的1.5mL离心管中，经过浓度测定及电泳检测后，-20℃保存备用。
(三)样本为DNA，则经质检合格后，-20℃保存备用。
实施例三：生物学实验
在本实施例中，用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分见表3：
序号 组分名称 主要成分 规格
1 PCR混合物 dNTPs、MgCl2、PCR引物 360μL/管x1管
2 PCR酶 Taq酶 24μL/管x1管
3 SAP酶混合物 SAP酶 24μL/管x1管
4 延伸引物混合液 延伸引物 24μL/管x1管
5 延伸酶混合物 iPLEX酶、ddNTPs 24μL/管x1管
6 阳性质控品 基因组DNA(30ng/μL) 40μL/管x1管
使用ABI 9700型PCR仪分别进行单重或多重核酸质谱检验。操作按照说明书进行，具体方法如下：
1.PCR扩增
1.1在PCR配液区，按照待检样品数准备200μL PCR反应管，并在管上标记样本编号；
1.2从试剂盒中取出PCR混合物、PCR酶，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底；
1.3根据样本数目，按下表的比例取出PCR混合液和PCR酶，置于一个离心管中混匀，按每PCR反应管加入16μL混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如，有10份待测样品时，可按10.5至11份样品配制混合物。
组分名称 单反应体积(μL)
PCR混合物 15
PCR酶 1
合计 16
1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入4μL待测样品，使每份PCR反应体系总体积为20μL。其中，阴性对照为超纯水，空白对照为不加模板。
1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。
2.SAP酶消化
PCR反应结束后，依次取5μL PCR产物至新管，每管加入SAP酶混合物1μL，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。
温度(℃) 时间(min) 循环数
37 45 1
85 15 1
3.单碱基延伸
3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混合物，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份PCR产物时，可按10.5至11份样品配制混合物。
组分名称 单反应体积(μL)
延伸引物混合液 1
延伸酶混合物 1
合计 2
3.2在PCR扩增区，按每管PCR产物加入2μL延伸混合物进行分装。
3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。
4.纯化
在PCR扩增区向每管延伸产物中加入16μL纯水，6mg树脂，颠倒混匀30min。
5.点样
使用微量移液器，吸取1μL纯化产物，点样至含基质靶片。
实施例四：上机检测及结果判读
使用毅新兴业(北京)科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。
另外，分别设置奶牛β-酪蛋白基因CSN2(8101)位点的A1型、A2型质粒对照，该质粒来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的对照质粒A1、A2为在商品化质粒pMD18-T Vector(Takara公司)的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法，用引物和奶牛DNA进行PCR后，将PCR产物插入pMD18-T Vector，再分别定点突变，即CSN2(8101)位点的碱基分别为A、C，即构建对照质粒A1和A2。所述质粒可长期保存于-20℃甘油中，用时活化并提取质粒DNA。
如前述表2所示，CSN2(8101)位点编号为SEQ ID No:23的延伸引物及其在2个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)。
判断标准：
(1)若A1型和A2型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
(2)若A1型和A2型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型；
(3)若A1型和A2型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。
质谱结果如图1-18所示，其中，图1-16为N1-N16样本的质谱图，图17为A1型质粒的质谱图，图18为A2型质粒的质谱图。根据前述表2中编号为SEQ ID No:23的延伸引物及延伸产物的分子量检查样本N1-N16的质谱结果(图1-16)，确定SNP位点的基因型，结果如表4所示：
对照实施例一：PCR测序检测
一.根据实施例一，另行设计并使用如下引物，对β-酪蛋白基因CSN2(8101)位点进行扩增和测序：
编号 引物序列(5’→3’)
正向扩增引物 ACCAAACCAAATGGAAGA
反向扩增引物 CAAGACTGGAGCAGAGGC
二.样本来源
为使不同实验之间产生的数据具有可比性，测序验证采用与实施例二中用于质谱检测一致的样本，即编号N1至N16的样本。
三.测序鉴定
1.PCR反应体系为25L，具体配方如下所示：
2.反应条件
使用ABI公司9700PCR热循环仪进行PCR反应。
反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸10min，15℃保存。
3.PCR产物纯化和测序
用试剂盒(OMEGA D2500-01)回收PCR扩增目的条带，定量后进行测序。
测序反应体系为：2μL Mix(Bigdye 3.1、5X sequencing buffer、H2O)，2μL纯化后的PCR产物，1μL引物(5μmol/L)；使用ABI 9700PCR扩增仪进行测序反应。
循环条件为：
96℃2min→(95℃10s→50℃5s→60℃4min)×30cycles→终止反应
测序反应产物用试剂盒(OMEGA 1320-01)进行纯化，然后上ABI 3730遗传分析仪进行序列测定。
4.结果分析
将测序得到的序列，在NCBI上进行BLAST，确定所扩增序列确实为目的序列后，用SeqMan进行比对，确定所测样本β-酪蛋白基因CSN2(8101)位点的基因型，测序峰图见图19-34，结果汇总如表5所示。
经过比较，表5与实施例四中的质谱检验结果表4完全一致，说明本发明方法的准确性。
对照实施例二：多重SNP位点的核酸质谱检测
对CSN2(8101)位点和A2(AC61)位点分别设计对照的扩增引物(SEQ ID No:27-28；SEQ ID No:30-31)和延伸引物(SEQ ID No:29；SEQ ID No:32)，具体序列如下表所示。
其中，编号为SEQ ID No:29和SEQ ID No:32的延伸引物及其延伸产物的分子量见下表所示。
将CK1与表1所述引物比较发现，8101位点的SEQ ID No:29的基因型2延伸产物分子量为5884，与AC61位点的延伸引物分子量5875.8之间过于接近，小于9Da，质谱检测时难以将两者实现有效分离(见图35)，当AC61位点的UEP未消耗干净时则会严重影响8101位点延伸产物的结果识别，因此不能选用。
对CK2与表1的引物比较发现，CK2所述引物的二级结构较多，进行PCR时，二聚体明显，而目的条带模糊，PCR扩增效率较低(见图36)，因此不能选用。由于PCR效率差，继而则不必进行质谱检测，直接弃而不用。
通过对照实施例二，可证明对于已知的SNP所设计的所有核酸质谱引物组，并非都能适用于目的检测。
实施例五：奶牛样本盲检
根据本发明的方法，依照实施例一、二中所描述的操作步骤，对45例未知β-酪蛋白基因型的奶牛样本进行盲检。根据实施例四中描述的判定标准对该45例样本进行结果分析，得到表6。由下表6可以看出，本发明所提供的方法可以有效的实现待检样本的β-酪蛋白基因分型，检出率为100％。其中，A1型纯合奶牛6例，A2型纯合奶牛17例，A1/A2杂合奶牛22例。
对照实施例三：联合A2(AC61)位点的多重核酸质谱检测
一.根据中国发明专利申请03817455.3，名称“动物基因分型方法”中报道的位于CSN1S2基因的AC61位点进行核酸质谱检测。将该位点与CSN2(8101)位点同时设计入一个体系中进行多重SNP检测，其中所述引物见表1。
二.样本来源
为考察AC61位点判定分型结果的准确性，本实验中采用与实施例五中同样的样本进行检测，即编号N1至N45的45例样本。
三.实验结果
根据本发明的方法，依照实施例一、二中所描述的操作步骤，根据实施例四中描述的判定标准对该45例样本进行结果分析，得到表7。
从上表可以看出，用AC61位点进行A1/A2分型时，45例样本中检出11例与CSN2基因判定结果不一致的样本(参见附图37-47)，该AC61位点筛选准确率仅为75％，因此，该位点仅可用于辅助判断。

Claims (14)

1.一种用于核酸质谱检测奶牛β-酪蛋白A2/A1基因的引物组，其序列如下：
。
2.一种用于核酸质谱检测奶牛β-酪蛋白A2/A1基因的引物组，其序列如下：
。
3.权利要求1-2所述的引物组，其中，延伸引物及延伸产物的分子量如下：
。
4.权利要求1-2所述的引物组，其中，上述PCR扩增引物序列为核心序列，其在5’端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基，更优选10bp的tag：ACGTTGGATG。
5.权利要求1-4所述的引物组，其中，上述延伸引物的5’端也可以增加作为接头的碱基序列。
6.权利要求1-5所述的引物组所制备的用于确定奶牛中是否存在β-酪蛋白A2/A1基因的核酸质谱检测产品。
7.权利要求6的检测产品，其中，该检测产品为检测试剂盒，包括：
(1)用于PCR的反应试剂，包括：权利要求1-5所述的PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；
(2)用于PCR产物纯化的试剂；
(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：权利要求1-5所述的延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。
8.利用权利要求1-7所述的引物组、检测产品或试剂盒，用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1基因的方法，步骤包括：
(1)PCR反应：使用所述PCR引物，在一个反应体系内，得到含扩增目标区域的PCR产物；
(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸：使用所述延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行单碱基延伸；
(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测，得到不同SNP位点延伸产物的核酸谱图；
(6)将得到的不同SNP位点延伸产物的核酸谱图，经过质谱仪配套软件分析后，确认SNP位点的碱基，从而判定该样本的基因型；
其中，用于奶牛β-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为：CSN2(8101)：[C/A]，C碱基代表A2型，A碱基代表A1型；和/或
A2(AC61)：[G/A]，A碱基代表A2型，G碱基代表A1型。
9.权利要求8的方法，其中用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为：CSN2(8101)：[C/A]，C碱基代表A2型，A碱基代表A1型。
10.一种生产β-酪蛋白A2牛奶的方法，步骤包括：
(1)根据权利要求1-5的引物组，或权利要求6-7的检测产品，或权利要求8-9的鉴定方法，确定奶牛的β-酪蛋白A2/A1基因分型；
(2)选择只具有编码β-酪蛋白A2基因的奶牛；
(3)对筛选的奶牛进行挤奶。
11.权利要求10的方法，其中步骤(1)可以是针对奶牛胚胎、幼体或成体；和/或，
在步骤(3)之前包括对奶牛进行繁育直至生产或/及形成所需要的生产种群的步骤；和/或，
在步骤(3)之后包括对奶进行加工制成奶制品的步骤(4)。
12.一种通过权利要求1-5的引物组，或权利要求6-7的检测产品，用于制备奶牛筛选、繁育中进行联合检测的产品。
13.权利要求1-12所述的引物组、检测产品和方法，其中所述奶牛为中国荷斯坦奶牛。
14.权利要求1-12所述的引物组、检测产品和方法，其中所述奶牛的DNA可以从含有有核细胞的任何组织中得到，该组织优选为该奶牛的血液、精液、毛发或奶。
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