CN101974649A

CN101974649A - 一种鉴别建鲤的分子标记方法

Info

Publication number: CN101974649A
Application number: CN2010105624732A
Authority: CN
Inventors: 董在杰; 苏胜彦; 曲疆奇
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2010-11-29
Filing date: 2010-11-29
Publication date: 2011-02-16

Abstract

本发明涉及一种鉴别建鲤的分子标记方法，包括以下步骤：选择建鲤自交F1代、黄河鲤父本和建鲤母本的杂交F1代混合群体为研究对象，随机选择48尾，分别采样血液，采用DNA提取法分别提取DNA样本；采用IGF2a基因内含子2进行PCR扩增，模板为所提取的混合群体的DNA样本；扩增出的PCR产物经电泳检测为693bp后，进行测序，获得所扩增的核苷酸序列；获得核苷酸序列以后，根据给定对照的野生型碱基C和突变型碱基CA的结果进行序列比对，并判断比对结果。本发明的有益效果为：能从建鲤、黄河鲤和建鲤正交F1代混合群体中分离种质；可提供一种进行河流种质混杂治理的参考路径；提供繁育改良的避免种质混杂的方法。

Description

一种鉴别建鲤的分子标记方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别建鲤的分子标记方法。

背景技术

目前在鲤生产中种质混杂现象比较严重，如何从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。建鲤是我国养殖鲤中比较广泛的鱼类，但是其种质混杂现象比较严重，包括苗种场、养殖场等诸多环节。若要从现有情况中进行品种的鉴定和分离，将有助于解决种质混杂现象、混杂品种多、混杂品种退化等问题，因此，从较为简单的2品种混杂着手，寻找种质鉴别、分离的方法称为解决种质混杂问题的一条有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别建鲤的分子标记方法，有助于解决鲤种质混杂现象、混杂品种多、混杂品种退化等问题，可从混杂的鲤种质中鉴别、分离种质；操作简单，易于掌握，准确性高。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种鉴别建鲤的分子标记方法，包括以下步骤：

1）选择建鲤自交F1代、黄河鲤父本和建鲤母本的杂交F1代混合群体为研究对象，随机选择48尾，分别采样血液，采用DNA提取法分别提取DNA样本；

2）采用IGF2a基因内含子2进行PCR扩增，模板为通过步骤1）所提取的混合群体的DNA样本；

在进行PCR扩增时，PCR 反应体系为 25uL，包括 10×buffer 15uL，Mg2+（25m mol/L）1uL，dNTPs（各 2mmol/L）1uL，上下游引物（10mmol/L）各1uL模板DNA 1uL，TaqDNA聚合酶（Promega）1U，dd H₂O扩增反应均在PCR仪上完成；

PCR 反应条件如下：

（1）94℃预变性3 min；

（2）94℃变性20s；

（3）退火温度56度20s；

（4）72℃延伸30s；

（5）步骤（2）-（4）重复33次；

（6）72 ℃延伸10min；

（7）将经过步骤（6）反应后的 PCR 产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合goldview显色进行检测；

3）通过步骤2）扩增出的PCR产物经电泳检测为693bp后，进行测序，获得所扩增的核苷酸序列；

4）通过步骤3）获得核苷酸序列以后，根据给定对照的野生型碱基C和突变型碱基CA的结果进行序列比对，并判断比对结果：

（a）获得的核苷酸序列为野生型碱基C，则获得的核苷酸为来自建鲤的概率为67.6%；

（b）获得的核苷酸序列为突变型碱基CA，则获得的核苷酸为来自正交个体的概率为100%。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供一种能从建鲤、黄河鲤和建鲤正交F1代混合群体中分离种质的方法；从测序结果中，与对照组比较，如果是野生型，为建鲤的概率为67.6%，如果是突变型是黄河鲤和建鲤正交后代的概率为100%。

2、本发明可提供一种进行河流种质混杂治理的参考路径；按照鲤的自然寿命计算为8～10年，那就是说如果一条河流养殖以建鲤养殖为主，而后放入黄河鲤父本作为获取较大杂种优势的途径，那么要区分出建鲤，只需要检测野生型即可；要区分杂种一代，那么检测出的突变型全部为杂种鲤。

3、本发明提供繁育改良的避免种质混杂的一种方法；实际生产中，通过杂交改良获取杂种优势时，只需要提供改良品种的父本或母本即可，这样避免了被引入品种造成的种质混杂现象，对于引入品种需在苗种场保种即可。

具体实施方式

本发明所述的一种鉴别建鲤的分子标记方法，包括以下步骤：

在进行PCR扩增时，PCR 反应体系为25uL，包括10×buffer 15uL，Mg2+（25m mol/L）1uL，dNTPs（各 2mmol/L）1uL，上下游引物（10 mmol/L）各1uL模板DNA 1uL，TaqDNA聚合酶（Promega）1U，dd H₂O扩增反应均在PCR仪上完成；

PCR 反应条件如下：

（1）94℃预变性3 min；

（2）94℃变性20s；

（3）退火温度56度20s；

（4）72℃延伸30s；

（5）步骤（2）-（4）重复33次；

（6）72℃ 延伸10min ；

（7）将经过步骤（6）反应后的 PCR 产物用8%（质量）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合goldview显色进行检测；

实例

获取建鲤、黄河鲤和建鲤的正交F1代群体的血液，通过TAKARA公司的DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用凝胶检测提取DNA的质量；用提供的对照和采集的样本进行PCR扩增，对比扩增条带。将扩增好的条带送往上海英俊公司测序后，获取的序列，通过测序图，分析突变型和野生型。通过与对照比较，分析确定所要分离的种质资源。

基于建鲤、黄河鲤和建鲤正交F1代混合群体的种质分离

1、建鲤的种质分离

从池塘中，随机选取建鲤、黄河鲤和建鲤的正交F1代混合群体（48尾），进行PIT标记扫描，确定鱼的个体标记，提取血液DNA并进行检测，最终获得测序结果的有44尾鱼，检测到野生型34尾。这个结果与PIT标记对应后，寻找原始记录资料进行鱼品种对比，发现检测出建鲤的概率为67.6%。

2、正交F1代的种质分离

同样的，最终获得测序结果的有44尾鱼中检测到突变型10尾。这个结果与PIT标记对应后，寻找原始记录资料进行鱼品种对比，发现检测出正交F1代的概率为100%。

本发明提供一种能从建鲤、黄河鲤和建鲤正交F1代混合群体中分离种质的方法；从测序结果中，与对照组比较，如果是野生型，为建鲤的概率为67.6%，如果是突变型是黄河鲤和建鲤正交后代的概率为100%。

可提供一种进行河流种质混杂治理的参考路径；按照鲤的自然寿命计算为8～10年，那就是说如果一条河流养殖以建鲤养殖为主，而后放入黄河鲤父本作为获取较大杂种优势的途径，那么要区分出建鲤，只需要检测野生型即可；要区分杂种一代，那么检测出的突变型全部为杂种鲤；实际生产中，通过杂交改良获取杂种优势时，只需要提供改良品种的父本或母本即可，这样避免了被引入品种造成的种质混杂现象，对于引入品种需在苗种场保种即可。

Claims

1.一种鉴别建鲤的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的鉴别建鲤的分子标记方法，其特征在于，在步骤2）中：在进行PCR扩增时，PCR反应体系为25uL，包括10×buffer 15uL，Mg2+（25m mol/L） 1uL，dNTPs （各 2mmol/L）1uL，上下游引物（10 mmol/L）各1uL模板DNA 1uL，TaqDNA聚合酶（Promega）1U，dd H₂O扩增反应均在PCR仪上完成。

3.根据权利要求1所述的鉴别建鲤的分子标记方法，其特征在于，在步骤2）中，PCR 反应条件如下：

（1）94℃预变性3 min；

（2）94℃变性20s；

（3）退火温度56度20s；

（4）72℃延伸30s；

（5）步骤（2）-（4）重复33次；

（6）72 ℃延伸10min ；

（7）将经过步骤（6）反应后的 PCR 产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合goldview显色进行检测。