CN109694906A - 一种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记 - Google Patents

一种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记，其核苷酸片段序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4；本发明再一个方面提供一种鉴定中华绒螯蟹性别的方法，是通过检测上述的特异性分子标记来实现的。本发明所使用的引物对只在中华绒螯蟹雌性个体中进行特异性扩增，琼脂糖凝胶电泳图中可直接看出雌雄差异。本性别分子标记应用简单，结果稳定，对中华绒螯蟹性别鉴定和性别调控的研究具有重要的意义。

Description

一种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记
技术领域
本发明属于水产养殖性别鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定中华绒螯蟹性别特异性的分子标记。
背景技术
中华绒螯蟹是我国一种极具经济价值同时具有较高产量的水产养殖经济类甲壳动物。尽管中华绒螯蟹已经具有较为成熟的苗种繁育技术，但是仍然无法对中华绒螯蟹进行早期性别鉴定及性别控制。性别二态性在动物的形态和行为中普遍存在，并且在养殖经济动物中作为一种经济性状，影响动物的生长速度和产品品质。现今，许多水产养殖动物可通过性别调控技术实现单性化养殖从而提高产量，改善品质。中华绒螯蟹在生长过程中具有明显的性别二态性，雄蟹个体体积更大，生长速度更快，而雌蟹营养价值更高。因此，开展中华绒螯蟹性别调控的研究对水产养殖业将产生非常高的经济价值。
不同于其他物种，中华绒螯蟹至今仍然没有明确的性别决定机制报道，甚至尚未确定是否有性别染色体的存在。仅通过三倍体诱导和构建高密度遗传连锁图谱推测中华绒螯蟹具有ZW-ZZ型性别染色体，并筛选出一个位于性别连锁群的分子标记ankyrin-2，但未见后续报道(Cui et al，2015)。此外，中华绒螯蟹性别调控机制研究的难点在于在幼体阶段无法通过形态鉴定性别。很多性别相关基因如Fem-1，fruitless，tra-2等仅在成蟹中性别特异性表达，但是无法确定其在幼体阶段的表达是否存在性别差异。所以，为了研究性别特异性基因的功能，现在急需一种在基因组层面上的性别特异性标记，对中华绒螯蟹早期个体进行性别鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记，用来快速鉴定中华绒螯蟹的遗传性别，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记，其核苷酸片段序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4；
本发明再一个方面提供一种鉴定中华绒螯蟹性别的方法，是通过检测上述的特异性分子标记来实现的；
所述的检测上述的特异性分子标记，是通过引物对待检测样品进行PCR扩增来完成的；
所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3；所述的引物对用于检测核苷酸片段序列为SEQ ID NO:1的分子标记；
另一个引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:5，下游引物的序列为SEQ ID NO:6；所述的引物对用于检测核苷酸片段序列为SEQ ID NO:2的分子标记。
本发明所使用的引物对只在中华绒螯蟹雌性个体中进行特异性扩增，琼脂糖凝胶电泳图中可直接看出雌雄差异。本性别分子标记应用简单，结果稳定，对中华绒螯蟹性别鉴定和性别调控的研究具有重要的意义。
附图说明
图1：本发明1％琼脂糖浓度电泳结果图，引物为8227-F1&8227-R1,其中1-12泳道均为雌性基因组为模板扩增，13泳道为Marker，14-25泳道为雄性基因组为模板扩增的条带；
图2：本发明1％琼脂糖凝胶电泳图，引物为8227-F23&8227-R23,其中1-12泳道均为雌性基因组扩增，13泳道为Marker，14-25泳道为雄性基因组为模板扩增的条带。
具体实施方式
申请人对中华绒螯蟹的雌性基因组和中华绒螯蟹的雄性基因组重测序数据进行比对，筛选获得了雌性中华绒螯蟹的特异性基因组片段，并设计引物进行PCR扩增，经过筛选得到两对引物8227-F1&R1和8227-F23&R23只在雌性中得到特异性条带。
下面结合实例对本发明进行详细的描述。
实施例1：雌性中华绒螯蟹的特异性基因组片段
申请人对中华绒螯蟹的雌性基因组和中华绒螯蟹的雄性基因组重测序数据进行比对，筛选获得了雌性中华绒螯蟹的特异性基因组片段2个
ATGTATTACAGAAATGCACCAGAAATATGATAACTTACAAATACCAAAAGATGTAAAGTATAAACATGAACATAGAAAGATGGAAGATAAGAAAGGAGGACTACTAATATTACACAAAAACAAAACCTTAACATTAACTAAGCAAGACACTACTCATGATGATGTACTAACTGTATTGATAACTAACAAAAATTACAAATTTAAGATTATACTGACATACATGACAAAAACAGAAACCAGAGAATCGAAAAATGTATAGAAGACAACCTAGCTAAGGAGACCGAAATTCCCACAATACTACTTGGAGACTTTAATGGCCACCTAGGGTTTATCGGTGAACA(SEQ ID NO:1)，共341bp。
在差异序列区域设计引物。引物对的序列信息如下：
8227-F1:ATGTATTACAGAAATGCACCAG(SEQ ID NO:2)
8227-R1:TGTTCACCGATAAACCCTA(SEQ ID NO:3)
另一个差异片段，其核苷酸序列如下：
CTATGCTTAATACATCGACTCAGCTTGATGGCGTTGATGACACTGCCACCTTGGCCGAGGTCTGTCGGGGTTGGTTGGTTGGGCGGTCTTTACGGAAAATTATCATACTAAAGGGGGAAGGGAAAAGCTCACTACTGTCAATGTCAGGAGTCAACCAAGTCTCAGTCCCTTCTATTATGTCTGGGTTATGTGTGGTGACTAGAAGTACATAGTCTGCAGACATTCAGCTTGAATTCTGGCAACAGTCAAGCAAACATATACATTGGATGGGGCGTGTATTCTGGCCACCCATCATAATGGAAAGTTCAAAGAATTGGATACAAACACATACTATTTAC(SEQ ID NO:4)，共338bp
在差异序列区域设计引物。引物对的序列信息如下：
8227-F23:CTATGCTTAATACATCGACTCAGCTTG(SEQ ID NO:5)
8227-R23:GTAAATAGTATGTGTTTGTATCCAATTCTTT(SEQ ID NO:6)
以多个已知性别的中华绒螯蟹雌雄肌肉组织DNA为模板进行PCR验证。
25μLPCR反应体系如下：
双蒸水：18.3μL；
dNTP：2μL；
10×Buffer：2.5μL；
rTap酶：0.2μL；
上下游引物：0.5μL；
模板DNA：1μL。
涡旋、离心使其充分混匀，进行PCR扩增，扩增程序为95℃3分钟，随后进行变性(95℃30秒)、复性(55℃30秒)、延伸(72℃20秒)40个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。扩增产物进行1％琼脂糖电泳检测。结果表明两对引物均在雌性12个个体中存在特异性扩增，1-12泳道均有300bp左右的条带。14-25泳道均没有特异性扩增条带，说明在雄性中不存在该序列(图1和图2)。
基于上述性别标记的发现，对早期幼体样品进行性别鉴定。利用DNA提取试剂盒提取幼体单个个体的基因组，利用8227-F1&R1或8227-F23&R23为引物，以单个个体基因组为模板，进行PCR扩增，参照上述体系和程序，结果经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，可分辨雌雄，雌性有特异的300bp左右的条带，雄性没有条带。
本发明中性别标记应用简单，结果稳定，攻破了中华绒螯蟹早期性别调控的一大难点，为之后性别基因在中华绒螯蟹早期发育阶段的研究坚定基础。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtattaca gaaatgcacc agaaatatga taacttacaa ataccaaaag atgtaaagta 60
taaacatgaa catagaaaga tggaagataa gaaaggagga ctactaatat tacacaaaaa 120
caaaacctta acattaacta agcaagacac tactcatgat gatgtactaa ctgtattgat 180
aactaacaaa aattacaaat ttaagattat actgacatac atgacaaaaa cagaaaccag 240
agaatcgaaa aatgtataga agacaaccta gctaaggaga ccgaaattcc cacaatacta 300
cttggagact ttaatggcca cctagggttt atcggtgaac a 341
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtattaca gaaatgcacc ag 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgttcaccga taaacccta 19
<210> 4
<211> 338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctatgcttaa tacatcgact cagcttgatg gcgttgatga cactgccacc ttggccgagg 60
tctgtcgggg ttggttggtt gggcggtctt tacggaaaat tatcatacta aagggggaag 120
ggaaaagctc actactgtca atgtcaggag tcaaccaagt ctcagtccct tctattatgt 180
ctgggttatg tgtggtgact agaagtacat agtctgcaga cattcagctt gaattctggc 240
aacagtcaag caaacatata cattggatgg ggcgtgtatt ctggccaccc atcataatgg 300
aaagttcaaa gaattggata caaacacata ctatttac 338
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctatgcttaa tacatcgact cagcttg 27
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtaaatagta tgtgtttgta tccaattctt t 31

Claims (9)

1.一种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记，其特征在于，所述的分子标记，其核苷酸片段序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4。
2.一种鉴定中华绒螯蟹性别的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测权利要求1所述的分子标记来实现的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的检测权利要求1所述的分子标记，是通过引物对待检测样品进行PCR扩增来完成的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的引物，其上游引物的序列为SEQ IDNO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3；所述的引物对用于检测核苷酸片段序列为SEQ IDNO:1的分子标记。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的引物，其上游引物的序列为SEQ IDNO:5，下游引物的序列为SEQ ID NO:6；所述的引物对用于检测核苷酸片段序列为SEQ IDNO:2的分子标记。
6.一种用于检测权利要求1所述的分子标记的引物对。
7.如权利要求6所述的引物对，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
8.如权利要求6所述的引物对，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQID NO:5，下游引物的序列为SEQ ID NO:6。
9.一种鉴定中华绒螯蟹性别的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求6所述的引物对。
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