CN102876777B - 鮸鱼est微卫星标记的特异引物及筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是申请号为201110192093.9的分案申请。属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及鮸鱼EST微卫星标记的特异引物及筛选方法。所述微卫星标记的特异引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.20所示。本发明建立了一种筛选方式，可方便快捷的用于做鮸鱼种质资源和遗传多样性的分析，分子种群遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱构建和功能基因的研究，进一步用于鮸鱼的分子设计育种和资源调查。
Description
本申请是申请号为201110192093.9、申请日2011年07月11日、发明名称为“鮸鱼EST微卫星标记的特异引物及筛选方法”的分案申请。
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济鱼类鮸鱼（Miichthys miiuy）EST（Express Sequence Tag，表达序列标签）微卫星标记的特异引物及鮸鱼EST微卫星标记的筛选方法。
背景技术
鮸鱼(Miichthys miiuy)，属脊索动物门(Phylum Chordata)、硬骨鱼纲 (Osteichyes)、鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae )、鮸鱼属(Miichthys)，俗称米鱼、黑鮸，主要分布于西太平洋西部，包括中国的黄海及东海，朝鲜和日本南部，为近海暖温水性中下层鱼类。鮸鱼肉鲜嫩似黄鱼，无腥味，肉质可和野生大黄鱼相媲美，是海产经济鱼类之一，也是经济价值较高的鱼类，又具有个体大、生长快、食性广等诸多优点，是近海网箱养鱼优良品种。遗传改良或品种培育是鮸鱼养殖发展的动力，研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力与生产性状密切相关，因此，开发鮸鱼的分子遗传标记，检测鮸鱼遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子辅助育种，对于鮸鱼的育种和养殖都具有十分重要的意义。
EST是通过对 cDNA 文库的克隆子随机测序得到的 DNA 序列，能反映 mRNA 的信息，是功能基因的一部分。与gSSR标记相比，从EST序列中筛选微卫星序列（EST-SSR）更经济、更有特点：一方面具有了基因组微卫星标记的优点，同时又因EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星标记具备直接标记功能基因的优势，并可能同一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱构建以及标记辅助育种都有很高的应用价值。
利用EST-SSR，可能把鮸鱼重要经济性状与之关联，达到分子辅助育种的目的，并可进一步进行鮸鱼功能基因的研究。目前还未见鮸鱼EST微卫星标记的研究报道。
发明内容
本发明旨在提供鮸鱼EST微卫星标记的特异引物，以及利用该特异引物进行鮸鱼EST微卫星标记筛选的方法。
为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：
发明人首先提供了鮸鱼EST微卫星标记的特异引物，分别为：
Mimi-5-B04：
F:CTACCGCTGCTCTTCG（SEQ ID NO.1），R:GATGGCTGGTCTACTTCG（SEQ ID NO.2）；
Mimi-13-G10：
F:GCGACAACGCAGACAGGA（SEQ ID NO.3），R:CTTGGGCGGATGGTAGGA（SEQ ID NO.4）；
Mimi-16-E10：
F:GTTCTTTCACTGGCATCT（SEQ ID NO.5），R:GCTGTTTCCACCTGTTTT（SEQ ID NO.6）；
Mimi-33-G06：
F:GGTAGGAGACTGGGTGGT（SEQ ID NO.7），R:CAATGTTTCAGGCAAATGTA（SEQ ID NO.8）；
Mimi-43-H04:
F:GCTTCCTGTCCCGTTTAT（SEQ ID NO.9），R:TTTGCTCCCGTGGGTTAT（SEQ ID NO.10）；
Mimi-40-H12：
F:TCATCAGCACCAGCCTCT（SEQ ID NO.11），R:CACATCCTCTTACCTCCTATCT（SEQ ID NO.12）；
Mimi-41-E11:
F:CCTCCTTCACCTCACCTT（SEQ ID NO.13），R:ACATCTGTCCAGCCTCT（SEQ ID NO.14）；
Mimi-42-G06:
F:TTGTTGTCTCGGTGATGG（SEQ ID NO.15），R:GACTCCTGCTGTTGCTCC（SEQ ID NO.16）；
Mimi-54-A11：
F:AACCAAAGGGACCAAACG（SEQ ID NO.17），R:GGAGCAGGCAGGTAAACG（SEQ ID NO.18）；
Mimi-56-G05：
F:AGACACCCGACCAGAACC（SEQ ID NO.19），R:ACAGCCTCCATCCACAAA（SEQ ID NO.20）。
从鮸鱼ESTs序列进行微卫星分析的步骤是从发明人实验室测序获得的EST序列中，利用Tandem Repeat Finder (TRF)软件，参数设计如下：按A、T、G、C排列组合的重复单元为2-6个核苷酸，且其最低重复次数分别为7、5、4、3、3，微卫星核心序列的最小长度为14bp，以此标准查找分析所得的序列，获得含有微卫星重复的EST序列；利用引物设计软件Primer Premier5.0在微卫星两端的侧翼序列设计特异引物。
对于鮸鱼的ESTs设计引物，其引物设计参数为: ⑴ 引物长度为18-25bp; ⑵GC含量大于40%；⑶ 退火温度大于40°C，且正反引物退火温度相差不超过5°C；⑷ 预期的PCR产物长度为100-300bp；⑸尽量避免二级结构。
本发明还提供了一种鮸鱼EST微卫星标记的筛选方法，首先利用从鮸鱼cDNA文库中测序获得的EST序列，利用微卫星检索软件Tandem Repeat Finder (TRF)进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数依次大于7，5，4，3，3次的微卫星片段进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计特异引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到EST微卫星标记，其中，所述的筛选到的EST微卫星标记的特异引物分别为：
Mimi-5-B04：
F:CTACCGCTGCTCTTCG（SEQ ID NO.1），R:GATGGCTGGTCTACTTCG（SEQ ID NO.2）；
Mimi-13-G10：
F:GCGACAACGCAGACAGGA（SEQ ID NO.3），R:CTTGGGCGGATGGTAGGA（SEQ ID NO.4）；
Mimi-16-E10：
F:GTTCTTTCACTGGCATCT（SEQ ID NO.5），R:GCTGTTTCCACCTGTTTT（SEQ ID NO.6）；
Mimi-33-G06：
F:GGTAGGAGACTGGGTGGT（SEQ ID NO.7），R:CAATGTTTCAGGCAAATGTA（SEQ ID NO.8）；
Mimi-43-H04:
F:GCTTCCTGTCCCGTTTAT（SEQ ID NO.9），R:TTTGCTCCCGTGGGTTAT（SEQ ID NO.10）；
Mimi-40-H12：
F:TCATCAGCACCAGCCTCT（SEQ ID NO.11），R:CACATCCTCTTACCTCCTATCT（SEQ ID NO.12）；
Mimi-41-E11:
F:CCTCCTTCACCTCACCTT（SEQ ID NO.13），R:ACATCTGTCCAGCCTCT（SEQ ID NO.14）；
Mimi-42-G06:
F:TTGTTGTCTCGGTGATGG（SEQ ID NO.15），R:GACTCCTGCTGTTGCTCC（SEQ ID NO.16）；
Mimi-54-A11：
F:AACCAAAGGGACCAAACG（SEQ ID NO.17），R:GGAGCAGGCAGGTAAACG（SEQ ID NO.18）；
Mimi-56-G05：
F:AGACACCCGACCAGAACC（SEQ ID NO.19），R:ACAGCCTCCATCCACAAA（SEQ ID NO.20）。
作为优选方案，根据本发明所述的一种鮸鱼EST微卫星标记的筛选方法，其中，所述的特异引物对鮸鱼进行PCR扩增，其中：扩增体系为：总体积20μl，其中含有内含1.5mMMg2+的1×PCR buffer，0.2μM dNTP，1U Taq聚合酶，模板量为50-100ng；PCR反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟，各个引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10°C之间进行优化，直至预期产物清晰单一。
作为优选方案，根据本发明所述的一种鮸鱼EST微卫星标记的筛选方法，其中，所述的特异引物对鮸鱼进行PCR扩增，PCR产物的检测方法如下：扩增得到的产物在用1.5%的琼脂糖凝胶电泳(电压5-10V/cm，15-20分钟)检测扩增特异性后，再用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，然后再用硝酸银染色系统进行检测，分析确定多态性。作为更优选，所述的变性聚丙烯凝胶电泳主要工艺参数为：恒压1000-1500V、功率200W，电泳1-2个小时。
作为优选方案，根据本发明所述的一种鮸鱼EST微卫星标记的筛选方法，其中，筛选获得重复性好，稳定的多态丰富的微卫星标记，其步骤是根据上述筛选方法中要求的利用至少两个体分析得到的多态引物，继续用大量个体检测其重复性和稳定性，同时得到其多态特征。
本发明的优点是：
本发明可方便快捷的用于做鮸鱼种质资源和遗传多样性的分析，分子种群遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱构建和功能基因的研究，进一步用于鮸鱼的分子设计育种和资源调查。
附图说明
图1 是Mimi-40-H12 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图2 是Mimi-43-H04 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图3 是Mimi-33-G06 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图4 是Mimi-5-B04 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图5 是Mimi-16-E10 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图6 是Mimi-42-G06 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图7 是Mimi-13-G10 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图8 是Mimi-54-A11 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图9 是Mimi-56-G05 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图10是Mimi-41-E11 EST-SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
主要材料、试剂和仪器设备：眼科剪，镊子，1.5ml离心管，微量移液器、微量移液器枪头。脱氧核糖核苷酸dNTP，热聚合Taq酶，小型离心机（QspinTM，BAYGENE），涡旋振荡器（QL-866型，QILINEBEIER），pH计(Mettler Toledo 320PH Meter)、高压蒸气灭菌锅（SANYO）、电泳仪（DYY-6C型，北京六一）、电泳仪（DYY-12C型，北京六一）、DNA序列分析电泳仪（DYCZ-20C型，北京六一）、调速多用振荡器（HY-2型，上海国华）、水浴锅（上海精宏）、凝胶成像系统(Bio-Rad GD2000)、PCR仪(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)。
实验样本鮸鱼采集于浙江省海洋水产研究所。
本发明实施例所用的常规药品苯酚氯仿抽提液（25:24:1），甲醛，氢氧化钠（分析纯），硝酸银，氯化钠（分析纯），尿素，丙烯酰胺，甲叉，Tris-碱，硼酸，乙二胺四乙酸（EDTA），过硫酸铵，十二烷基硫酸钠（SDS），无水乙醇购自国药集团琼脂糖，溴化乙锭，去离子甲酰胺，TEMED，蛋白酶K等购自Takara公司，脱氧核糖核苷酸dNTP，热聚合Taq酶购自TIANGEN公司，质粒文库测序由华大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本发明实施例所用主要仪器包括：小型离心机（QspinTM，BAYGENE），涡旋振荡器（QL-866型，QILINEBEIER），pH计(Mettler Toledo 320PH Meter)、高压蒸气灭菌锅（SANYO）、电泳仪（DYY-6C型，北京六一）、电泳仪（DYY-12C型，北京六一）、DNA序列分析电泳仪（DYCZ-20C型，北京六一）、调速多用振荡器（HY-2型，上海国华）、水浴锅（上海精宏）、凝胶成像系统(Bio-Rad GD2000)、PCR仪(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)。
实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
1、微卫星位点的来源和微卫星序列的筛选
从发明人实验室测序获得的EST序列，利用微卫星检测软件Tandem Repeat Finder (TRF)进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数依次大于7，5，4，3，3次的微卫星片段进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列。利用引物设计软件Primer Premier5.0在微卫星两端的侧翼序列设计特异引物。
2、微卫星标记引物的设计
在微卫星重复区的侧翼序列利用软件Primer Premier5.0设计引物，引物要求满足以下条件：⑴ 引物长度为18-25bp; ⑵GC含量大于40%；⑶ 退火温度大于40°C，且正反引物退火温度相差不超过5°C；⑷ 预期的PCR产物长度为100-300bp；⑸尽量避免二级结构。
3、引物的优化
各引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10°C之间进行优化，直至预期目的产物能被清晰稳定的扩增。PCR扩增的反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟。反应体系为：总体积20μl，其中含有1×PCR buffer（内含1.5mMMg2+），0.2μM dNTP，1U Taq聚合酶，模板量为50-100ng。模板是随机的两个鮸鱼个体的DNA混合池。扩增得到的产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选择单一或杂带少、特异性产物较高的温度作为最佳退火温度。
4、微卫星位点的确定
根据步骤3中优化的退火温度选取30个个体检测这些微卫星标记的多态性。PCR反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟。反应体系为：总体积20μl，其中含有1×PCR buffer（内含1.5mMMg2+），0.2μM dNTP，1UTaq聚合酶，模板量为50-100ng。PCR扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒压1000-1500V，功率200W，电泳1-2个小时，硝酸银染色系统进行检测，干燥后分析确定多态性，最后筛选出10个鮸鱼微卫星标记，这些标记的具体信息如表1。
表1. 开发获得的10个鮸鱼（Miichthys miiuy）的EST-SSR标记
实施例2
1、提取鮸鱼的DNA
具体步骤如下：⑴剪取少量鮸鱼鳍条组织30-100mg，加入300μl裂解液（含0.2M NaCl，0.02M Tris-HCl(pH8.0)，1%SDS和0.05M EDTA），剪刀剪碎后加入终浓度20mg/ml的蛋白酶K，55°C水浴裂解数小时至溶液清澈；⑵完全裂解后加300μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）反复颠倒抽提10-15分钟，10000-12000转/分钟离心10分钟，吸取上清；⑶重复步骤⑵3-4次至上清澄清；⑷加两倍体积冰乙醇沉淀DNA，10000-12000转/分钟离心10分钟，弃上清；⑸75%乙醇洗涤沉淀1-2次，晾干，使乙醇完全挥发，用50-100μl TE或灭菌的去离子水溶解DNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测后于-20°C保存备用。
2、PCR扩增
各EST-SSR标记引物的最佳退火温度如表1所示，PCR反应体系为：总体积20μl，其中含有1×PCR buffer（内含1.5mMMg2+），0.2μM dNTP，1U Taq聚合酶，模板量为50-100ng。反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终延伸5分钟。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳-EB染色系统进行检测特异性。
3、电泳检测
经琼脂糖凝胶电泳检测(电压5-10V/cm，15-20分钟)，特异扩增的PCR产物加入等体积变性剂（含98%去离子甲酰胺，10mM EDTA，0.25%溴酚蓝和0.25%二甲苯青），95°C变性8分钟后快速冷却，用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒压1000-1500V，功率200W，电泳1-2个小时后进行染色和显色，首先用70%的乙醇固定10分钟，水洗10分钟，硝酸银溶液染色30分钟，水洗10秒，20%的NaOH显色液显色10分钟，水洗10分钟。
干燥后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图1至图10所示。
尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋学院
<120> 鮸鱼EST微卫星标记的特异引物及筛选方法
<130> Z110593
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctaccgctgc tcttcg 16
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatggctggt ctacttcg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgacaacgc agacagga 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttgggcgga tggtagga 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttctttcac tggcatct 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctgtttcca cctgtttt 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggtaggagac tgggtggt 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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caatgtttca ggcaaatgta 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcttcctgtc ccgtttat 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tttgctcccg tgggttat 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcatcagcac cagcctct 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacatcctct tacctcctat ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctccttcac ctcacctt 18
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<212> DNA
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acatctgtcc agcctct 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ttgttgtctc ggtgatgg 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gactcctgct gttgctcc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaccaaaggg accaaacg 18
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ggagcaggca ggtaaacg 18
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<212> DNA
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agacacccga ccagaacc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acagcctcca tccacaaa 18
Claims (1)
1.一种鮸鱼EST微卫星标记的筛选方法，其特征是首先利用从鮸鱼cDNA文库中测序获得的EST序列，利用微卫星检索软件Tandem Repeat Finder进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数依次大于7，5，4，3次的微卫星片段进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计特异引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到EST微卫星标记，其中，所述的筛选到的EST微卫星标记的特异引物为：
Mimi-13-G10：F:GCGACAACGCAGACAGGA，R:CTTGGGCGGATGGTAGGA，
所述的然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计特异引物，具体操作为：在微卫星重复区的侧翼序列利用软件Primer Premier 5.0设计引物，引物要求满足以下条件：⑴ 引物长度为18-25bp; ⑵GC含量大于40%；⑶ 退火温度大于40°C，且正反引物退火温度相差不超过5°C；⑷ 预期的PCR产物长度为100-300bp；⑸尽量避免二级结构，
所述的并进一步检测优化引物成为微卫星标记，具体操作为：（A）引物的优化：各引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10°C之间进行优化，直至预期目的产物能被清晰稳定的扩增，PCR扩增的反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟；反应体系为：总体积20μl，其中含有内含1.5mM Mg2+ 的1×PCR buffer，0.2μM dNTP，1U Taq聚合酶，模板量为50-100ng；模板是随机的两个鮸鱼个体的DNA混合池；扩增得到的产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选择单一或杂带少、特异性产物较高的温度作为最佳退火温度，（B）微卫星位点的确定：根据步骤（A）中优化的退火温度选取30个个体检测这些微卫星标记的多态性，PCR反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟；反应体系为：总体积20μl，其中含有内含1.5mM Mg2+的1×PCR buffer，0.2μM dNTP，1UTaq聚合酶，模板量为50-100ng；PCR扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒压1000-1500V，功率200W，电泳1-2个小时，硝酸银染色系统进行检测，干燥后分析确定多态性，最后筛选出鮸鱼微卫星标记。
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