CN111471756A

CN111471756A - 用于鲟鱼性别鉴定的特异性dna片段ssm1及应用

Info

Publication number: CN111471756A
Application number: CN201910066600.0A
Authority: CN
Inventors: 阮瑞; 李创举; 危起伟; 岳华梅; 叶欢; 杜浩; 刘志刚; 冯彤; 阮珏
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2039-01-24
Also published as: CN111471756B

Abstract

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及用于鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1及应用，本发明是通过高通量测序和比较基因组方法成功筛选到鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1，并设计引物该引物能够对9种鲟鱼准确快速鉴定其性别，且公开了其引物序列、PCR反应体系和条件。本发明所述鉴定方法操作简单、快捷、准确、且对鲟鱼伤害极小等特点，解决了鲟鱼性别鉴定的难题，将有助于鲟鱼养殖产业的快速发展。

Description

用于鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1及应用

技术领域

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及用于鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1及应用。

背景技术

鲟鱼亲本性成熟时间较长，且雌雄个体之间没有明显的第二性征，在其发育早期从形态上无法辨别雌雄，一般在鲟鱼3-5龄时通过腹腔外科手术等方法鉴定(陈细华等，2004)。由于不能对幼鱼的性别进行及时地判断，不能够依照雌雄性别分别进行集约化养殖或一定性别比例进行饲养或增殖放流，进而影响了鲟鱼人工繁育以及野生鲟鱼资源的保护。另外，经济型鲟鱼产出的鱼子酱富含人体必需氨基酸、多种不饱和脂肪酸、维生素等物质，营养价值极高，享有“黑色黄金”的美誉，因此在养殖上雌性个体比雄性个体具有更高的经济价值。研究人员通过雌核发育对高首鲟(Acipenser transmontanus)(Van et al.,1999)、短吻鲟(A.brevirostrum)(Flynn et al.,2006)和杂交鲟Bester

(Omoto et al.,2005)进行研究，结果表明了鲟科鱼类雌性个体为异形配子的性别决定遗传方式。另外，DNA分子标记已成为鉴别鱼类性别的重要分子工具。但是，通过ISSR、AFLP和RA PD等不同分子标记技术来检测了西伯利亚鲟(A.baerii)、俄罗斯鲟(A.gueldenstaedtii)、小体鲟(A.ruthenus)、意大利鲟(A.naccarii)、湖鲟(A.fulvescens)、波斯鲟(A.percicus)、欧洲鳇(Huso huso)、施氏鲟(A.schrenckii)和中华鲟(A.sinensis)等物种的雌雄个体基因组差异都没有检测到鲟鱼的性别特异性DNA分子标记(Wuertz et al.,2006；Keyvanshokooh et al.,2007；McCormick et al.,2008；Yarmohammadi et al.,2011；刘翠，2011；刘雪清等，2015)。这可能是因为雌雄鲟鱼的基因组本身差异微小；同时也可能因为鲟鱼与高等硬骨鱼类不同，在其进化过程中经历了多次基因组加倍过程(张四明等，1999；Ludwig et al.,2001)，其多倍体和数量较多的染色体的特点，加大了鉴定鲟鱼性别特异相关基因或标记的难度。因此需要能够提供更高标记密度、更准确的和更能代表样品基因组特征的检测技术来鉴定鲟鱼性别特异性标记。随着高通量测序技术的快速发展，以及鉴于鲟鱼基因组相对比较复杂，本发明是在利用低覆盖度全基因组测序和比较基因组学基础上发明了鲟科鱼类雌性性别特异性标记。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1，所述的DNA片段SSM1为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物。

本发明还有一个目的在于提供了SEQ ID NO.1所示序列或针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物的应用。所述的片段或引物可以用于多种鲟科鱼类性别鉴定，解决了鲟鱼早期性别鉴定的难题，促进鲟鱼养殖产业的发展。

本发明最后一个目的在于提供了一种鲟鱼性别鉴定的方法，方法简单，准确率达到100％。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1，所述的DNA片段SSM1的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。

针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物也为本发明的保护内容，所述的引物优选为：F:TCGGTATCTTAAACTGAACCAA和R:AGATGGAGAATTCATTGCCTA。

SEQ ID NO.1所示序列或针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物的应用，包括利用SEQ ID NO.1所示片段或针对其设计的引物用于鲟鱼性别鉴定，所述的鲟鱼包括：中华鲟、达氏鲟、施氏鲟、小体鲟、西杂(西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂)、欧洲鳇、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟、闪光鲟。

一种鲟鱼性别鉴定的方法，通过检测鲟鱼基因组中是否含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列来判定；所述的方法适用于中华鲟、达氏鲟、施氏鲟、小体鲟、西杂(西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂)、欧洲鳇、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟、闪光鲟的雄雌鉴定；

所述的检测的方法包括但不限于目前已有的基因组测序，PCR的方法。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明提供的性别特异性DNA分子片段，利用常规PCR扩增对多种鲟科鱼类(中华鲟、达氏鲟、施氏鲟、小体鲟、西杂(西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂)、欧洲鳇、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟、闪光鲟)的性别验证准确率达100％。与之前外科手术或超声波检测相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点，为鲟鱼养殖产业的发展提供帮助。

附图说明

图1为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在施氏鲟遗传性别鉴定的结果示意图；

图中泳道1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图2为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在中华鲟遗传性别鉴定的结果示意图。

图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图3为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在达氏鲟遗传性别鉴定的结果示意图。

图4为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在俄罗斯鲟遗传性别鉴定的结果示意图。

图5为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在闪光鲟遗传性别鉴定的结果示意图；

图6为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在西伯利亚鲟遗传性别鉴定的结果示意图；

图7为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在西杂(西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂)遗传性别鉴定的结果示意图；

图8为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在小体鲟遗传性别鉴定的结果示意图；

图9为鲟鱼雌性性别特异性DNA片段SSM1在欧洲鳇遗传性别鉴定的结果示意图；

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1的获得：

利用性腺组织石蜡切片鉴定雌雄各20尾施氏鲟，提取其全基因组DNA，构建测序文库，Illumina测序平台上机测序，获得施氏鲟雌雄个体全基因组测序数据，通过比较基因组学方法进行分析获得雌性性别特异性DNA片段，并设计相应的引物进行群体验证其有效性，最终获得了雌性特异性DNA片段SSM1(SEQ ID NO.1)，通过GenBank数据库比对未发现同源序列。

实施例2：

鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1的使用方法：

1)针对SEQ ID NO.1所示序列设计引物为：

F:TCGGTATCTTAAACTGAACCAA和R:AGATGGAGAATTCATTGCCTA。

2)PCR扩增：

反应体系为模板DNA约50ng；Taq聚合酶1.5U；10×扩增缓冲液2.5μl；4种dNTP浓度分别为200μM；上下游引物终浓度分别为0.2μM；补充ddH2O至25μl。

SSM1引物对应的PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，35个循环；72℃最后延伸7min；4℃保存。Sturgeon-SSM2引物对应的PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸25s，35个循环；72℃最后延伸7min；4℃保存。

PCR扩增结束后，配制2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增出特异性条带为雌性个体，扩增不出特异性条带为雄性个体。

实施例3：

特异性DNA片段SSM1在鲟鱼性别鉴定中的应用：

1)已知雌雄个体各12尾鲟鱼鳍条组织样本保存于无水乙醇，利用高盐法提取其基因组DNA，稀释至50ng/μL保存于-20℃备用；所述的鲟鱼为：中华鲟、达氏鲟、施氏鲟、小体鲟、西杂(西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂)、欧洲鳇、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟、闪光鲟。

2)利用实施例2的方法对上述鲟鱼DNA样本进行PCR扩增；

3)扩增结果如下：

图1显示施氏鲟的扩增结果：图中泳道1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图2显示中华鲟的扩增结果：图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图3显示达氏鲟的扩增结果：图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图4显示俄罗斯鲟扩增结果：图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图5显示闪光鲟扩增结果：图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图6显示西伯利亚鲟扩增结果：图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图7显示西杂(西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂)扩增结果：图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNAmarker。

图8显示小体鲟扩增结果：图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

图9显示欧洲鳇扩增结果；图中1-12为雄性个体都扩增不出条带，13-24为雌性个体都能扩增出415bp特异条带，C表示阴性对照，M表示DL2000DNA marker。

序列表

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 用于鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcggtatctt aaactgaacc aaatctctta tccacaaata gtccattgta aaacagaatg 60

gagtcatgta tgtgtaagga ggtggagtaa ttggagtaga gtgaagggag tgcagtggtg 120

cagggaaggg cagtaatgca ttgctgtatc atgtcatcag actgttgtgg ttcagcaagt 180

gaaagaggat cctgtggttg cagtggagca gtaggataaa ggcagtcagg ggacgtgtac 240

ggtgttccgg ttaatgcagc ttccttagct aatgtgtcta ccttaatatt gccatcagct 300

tctttggatg agcctggctt ttgatgtgcc ttgattttaa ttagtgtcac tgttctacct 360

tctgccaatt tgcatatgtt gcaatgtgga tgcataggca atgaattctc catct 415

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcggtatctt aaactgaacc aa 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatggagaa ttcattgcct a 21

Claims

1.鲟鱼性别鉴定的特异性DNA片段SSM1，所述的DNA片段SSM1为SEQ ID NO.1所示。

2.用于检测SEQ ID NO.1所示核苷酸的引物。

3.根据权利要求2所述的引物，所述的引物为： F:TCGGTATCTTAAACTGAACCAA和R:AGATGGAGAATTCATTGCCTA。

4.权利要求1所述DNA片段SSM1或权利要求2所述的引物在鲟鱼性别鉴定中的应用，所述的鲟鱼包括：中华鲟、达氏鲟、施氏鲟、小体鲟、西杂（西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂）、欧洲鳇、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟或闪光鲟。

5.一种鲟鱼性别鉴定的方法，通过检测鲟鱼基因组中是否含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列来判定；所述的方法适用于中华鲟、达氏鲟、施氏鲟、小体鲟、西杂（西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂）、欧洲鳇、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟、闪光鲟的雄雌鉴定。