CN113755566B

CN113755566B - 山瑞鳖性别快速鉴定pcr引物组、位点、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN113755566B
Application number: CN202111130955.5A
Authority: CN
Inventors: 许晓军; 关文志; 牛宝龙; 楼宝
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-09-26
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2041-09-26
Also published as: CN113755566A

Abstract

本发明公开山瑞鳖性别快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒。PCR引物组，包括SEQ ID No.1‑4。将待检测山瑞鳖提取基因组DNA；以上述基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1‑4所示引物序列进行PCR扩增；或以山瑞鳖全血作为样本，采用蛋白酶K进行样本裂解，得到样本裂解混合液；对样本裂解混合液进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现834bp和1589bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现834bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雄性。本发明中的山瑞鳖性别鉴定PCR引物组，该引物组可在山瑞鳖各发育生长时期鉴定其性别。

Description

山瑞鳖性别快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学鉴定技术领域，涉及一种可以快速鉴定山瑞鳖性别的PCR扩增引物组、位点、方法及试剂盒。

背景技术

山瑞鳖(Palea steindachneri)隶属于爬行纲龟鳖目鳖科山瑞鳖属，俗称山瑞、瑞鱼、甲鱼、团鱼等，外形与中华鳖十分相似，呈圆形，但体形稍大，而且较为肥厚。其原产地为中国和越南，国内分布于广西、广东、贵州、云南、海南、香港、台湾等省，其中以广西西部地区数量较多。

由于野生山瑞鳖资源长期破坏性捕捉，加之栖息区域变小，栖息环境退化，野生山瑞鳖资源衰减严重。山瑞鳖现被列入《中国国家重点保护野生动物名录》，保护级别为二级，列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录二。出于物种保护和利用目的，山瑞鳖已列入《人工繁育国家重点保护水生野生动物名录(第一批)》(2017年11月13日)。养殖业者已建立了较为成熟的人工繁养殖技术。在海南、广东、广西、福建、浙江等省区均有养殖场分布。山瑞鳖是我国重要的名贵水产品之一。其养殖生产性能存在显著的性别二态性，成体雄鳖规格较雌鳖大30％以上。因此，山瑞鳖性别早期鉴定技术具有重大实际应用意义。首先，山瑞鳖产业对单性养殖和性控育种有强烈需求，但早期分子鉴定技术尚存在空白。从形态特征鉴别性别需要养殖1年以上，平均规格250克以上才可实施，且准确度没有保障。其次，出于对野生山瑞鳖繁殖生态学的研究，掌握野生种群各年龄规格群体性别比例，性别分子鉴定对于开展山瑞鳖种质保护评价具有重要价值。

目前关于山瑞鳖的文献报道十分稀少，且仅限于人工繁育、养殖和病害防治方面。关于山瑞鳖的性别分子鉴定技术还未有涉及。目前鳖属动物中中华鳖有性别分子鉴定技术，其开发背景为中华鳖已明确性别决定机制为ZW基因决定，性染色体已经定位，且有基因组测序信息供比对筛选性别鉴定引物。而山瑞鳖尚无开展基因组测序，NCBI数据库仅有其线粒体基因组序列，且核基因信息为零，性别决定型未明确，开发一款山瑞鳖的性别分子鉴定技术尤为困难。

另外根据相关中华鳖性别分子鉴定位点信息，对中华鳖性别鉴定引物组进行直接扩增和多种简并修饰后扩增，并不能用于跨物种的山瑞鳖性别鉴定，故根据已报道中华鳖性别分子鉴定的位点和引物组，无法通过简单尝试解决山瑞鳖性别分子鉴定难题。

因此，通过各种技术尝试探索，开发出山瑞鳖性别鉴定技术，对山瑞鳖单性养殖技术和性控育种技术的实现，对山瑞鳖物种保护评估与开发利用具有重要推动作用。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术空白，提供一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR引物组。

本发明的第二个目的是提供一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，且该方法较常规PCR方法具有以下2个明显优点：一是该PCR方法无需上游基因组提取步骤，节省时间、试剂耗材成本；二是该PCR方法样本可以从初孵稚鳖至成鳖期采用无创或微创法获得。

本发明的第三个目的是提供一种快速鉴定山瑞鳖性别的试剂盒。

本发明的上述第四个目的是提供一种用于鉴定山瑞鳖雌性特异的核酸序列位点。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案实现：一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR引物组，该引物组序列如下：

雌性特异正向引物：5’-CCAAGAGTCATCAGGAACGCAC-3’，见SEQ ID No.1；

雌性特异反向引物：5’-CATCTTCCTCCTCGGGTTCCTC-3’，见SEQ ID No.2；

内参正向引物：5’-TTGGATCCCTATTAGGTGCTTGCCT-3’，见SEQ ID No.3；

内参反向引物：5’-TGATGTGTGTAGTAGGGGTAGGATG-3’，见SEQ ID No.4。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案实现：

方案一：将待检测山瑞鳖提取基因组DNA；以上述基因组DNA为模板，用SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示引物序列进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现834bp和1589bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现834bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雄性。

上述提及的PCR扩增反应体系为：

PCR扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸100s，变性到延伸过程30个循环，最后72℃延伸5min。

方案二：以山瑞鳖全血作为样本，采用PicoPure^TM DNAExtraction Kit的蛋白酶K进行样本裂解，得到样本裂解混合液；对样本裂解混合液进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现834bp和1589bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现834bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雄性。

上述样本裂解体系包括山瑞鳖全血0.1-0.5μL，蛋白酶k溶液(1ug/μL)10.5-10.9μL，总体积共11μL。

上述样本裂解条件为65℃裂解30min，95℃灭活10min；

所述山瑞鳖全血为初孵稚鳖未脱落卵黄囊内存留的血液，或稚鳖、成鳖后肢皮肤针刺采集的血液。

上述PCR扩增体系包括

作为优选，所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：一种山瑞鳖性别快速鉴定试剂盒，包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示引物。

本发明的上述第四个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于鉴定山瑞鳖性别的位点，包括雌性特异连锁片段1589bp，序列见SEQ ID No.5；检验PCR成功的山瑞鳖线粒体cytB内参基因片段834bp，序列见SEQ ID No.6。

本发明的有益效果是：

(1)本发明中的山瑞鳖性别鉴定PCR引物组，该引物组可在山瑞鳖各发育生长时期鉴定其性别；

(2)本发明中的山瑞鳖性别快速PCR鉴定方法，该方法不受山瑞鳖发育时期限制，操作简便，结果准确直观，采用微量血液样本直接检测的技术路线，避免了常规PCR检测取样需要牺牲待检样本，或采样损伤严重影响养殖存活和商品性状的弊端。该方法为山瑞鳖单性养殖技术建立和性控育种相关工作开展提供重要技术支持，对山瑞鳖保护评估与开发利用具有重要推动作用。

附图说明

图1是实施例2中16只山瑞鳖个体肌肉样本提取基因组DNA后进行性别PCR鉴定的电泳结果；其中M：DL2000marker；1、3、5、7、9、11、13、15号样本为山瑞鳖雌鳖扩增产物；2、4、6、8、10、12、14、16号样本为山瑞鳖雄鳖扩增产物。

图2是实施例3中10只山瑞鳖稚鳖个体血液样本进行性别PCR鉴定的电泳结果；其中M：DL2000marker；1-10号样本为山瑞鳖稚鳖后肢微量取血扩增产物。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明做进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。

实施例1

本实施例提供的快速鉴定山瑞鳖性别的引物组，包括1对雌性特异引物组和1对内参引物组，具体为：

雌性特异正向引物：5’-CCAAGAGTCATCAGGAACGCAC-3’，见SEQ ID No.1；

雌性特异反向引物：5’-CATCTTCCTCCTCGGGTTCCTC-3’，见SEQ ID No.2；

内参正向引物：5’-TTGGATCCCTATTAGGTGCTTGCCT-3’，见SEQ ID No.3；

内参反向引物：5’-TGATGTGTGTAGTAGGGGTAGGATG-3’，见SEQ ID No.4。

山瑞鳖缺乏核基因组信息，本发明首先借助同属近缘物种中华鳖基因组信息启动开发工作。根据大量筛查中华鳖ZW性染色体连锁的基因，筛选可能存在ZW染色体基因序列差异的区段，并分析序列信息设计引物尝试山瑞鳖中扩增。对少部分可以扩增的山瑞鳖各扩增子转化测序。根据扩增子测序结果再筛选雌雄差异序列，并设计引物筛选验证，最终获得1对山瑞鳖雌性特异引物组。为保证鉴别在1管PCR反应中完成，根据山瑞鳖线粒体基因组设计了数对内参基因引物组。为保证雌性特异单拷贝基因和内参多拷贝线粒体基因可以在同一管PCR反应中扩增效率相对接近，进行了大量多重PCR条件试验，最终确定了PCR体系配置和扩增条件。

实施例2

本实施例提供的快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，包括以下步骤：

(1)待检山瑞鳖组织取样

随机选取通过外观判别的雌雄山瑞鳖亚成体各8个，经解剖性腺验证生理性别后，剪取后肢肌肉组织样本，于液氮闪冻后保存于-80℃，待用；

(2)基因组DNA提取

a)采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根DP304)。取30mg肌肉组织，加入200μLGA溶液，用眼科剪刀将肌肉组织剪碎，后加入20μL蛋白酶K裂解液(天根RT403)、4μLRNaseA溶液(天根RT405-12)震荡混匀，55℃裂解2小时。

b)加入200μLGB缓冲液，充分混匀颠倒，70℃放置10min，简短离心。

c)加入200μL无水乙醇，充分混匀震荡15s，简短离心。

d)将上述混合液加入吸附柱CB3中并置于收集管内，12000rpm离心30s，弃滤液。

e)加入500μLGD缓冲液，12000rpm离心30s，弃滤液。

f)加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃滤液。

g)重复步骤f。

h)将吸附柱CB3和收集管于12000rpm离心2min。

i)将吸附柱CB3置于干净的离心管中，开盖放置5min。

j)在吸附柱CB3膜上加TE洗脱液60μL，静置5min，12000rpm离心2min，收集滤液即为基因组DNA。

(3)PCR扩增

性别鉴定PCR扩增反应体系如下：

(4)电泳检测

PCR产物使用TAE缓冲液配制的1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测，采用DL2000分子量MARKER，样品上样量2μL，电压设置5V/cm，电泳至10X loading buffer指示剂泳动至胶板三分之二处停止电泳，凝胶成像拍照。

(5)结果判定

电泳结果如图1所示，1、3、5、7、9、11、13、15号样品扩增产物出现834bp和1589bp大小的2条条带，判定山瑞鳖雌性；2、4、6、8、10、12、14、16号样品扩增产物出现834bp大小的1条条带，判定山瑞鳖雄性。结合解剖学性别鉴定记录，判别正确率100％。

实施例3

本实施例提供的快速微创鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，包括以下步骤：

(1)初孵稚鳖血样采集

随机选取刚出壳山瑞鳖稚鳖10只，对其中1-10号稚鳖采取注射器针刺破后肢皮肤，用10μL移液器采集末梢血约1μL，转移至PCR管内。采血后每个稚鳖单独水盆放置，用10ppm高锰酸钾处理5min，暂养观察五日，无伤口感染溃烂和死亡现象，解剖鉴定稚鳖性别并记录。

(2)PCR扩增

步骤1：

样本裂解体系配置为

山瑞鳖全血0.1-0.5μL

PicoPure^TM DNAExtraction Kit

蛋白酶k溶液(1μg/μL)10.5-10.9μL

裂解体系总体积11μL

裂解条件为65℃裂解30min，95℃灭活10min；

步骤2：

雌性特异PCR扩增体系配置为

(3)电泳检测

PCR产物使用TAE缓冲液配制的1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，采用DL2000分子量MARKER，样品上样量5μL，电压设置5V/cm，电泳至10X loading buffer指示剂泳动至胶板三分之二处停止电泳，凝胶成像拍照。

(4)结果判定

电泳结果如图2所示，1、2、5、7号样品扩增产物出现834bp和1589bp大小的2条条带，判定雌性山瑞鳖；3、4、6、8、9、10号样品扩增产物出现834bp大小的1条条带，判定雄性山瑞鳖。结合解剖学性别鉴定记录，判别正确率100％。

因此，本发明中的快速微创鉴定山瑞鳖性别的PCR引物组和方法可以进一步开发为试剂盒，用于各生长发育期山瑞鳖性别鉴定。

从本发明的上述试验可以发现，本发明可以快速鉴定山瑞鳖性别，且具有以下优点：

(1)不受山瑞鳖生长发育时期限制，初孵稚鳖也可以进行鉴定；

(2)检测根据扩增产物片段大小和条带多少进行判别，一次PCR反应即可完成；

(3)检测采用血液直接检测，避免了常规分子检测基因组DNA提取步骤，节省时间和试剂成本；

(4)检测采用了微创取样，对检样损伤小，本方法检测对稚鳖生长和商品性能无不良影响。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细的说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 山瑞鳖性别快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

ccaagagtca tcaggaacgc ac 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

catcttcctc ctcgggttcc tc 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

ttggatccct attaggtgct tgcct 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

tgatgtgtgt agtaggggta ggatg 25

<210> 5

<211> 1589

<212> DNA

<213> 山瑞鳖（Palea steindachneri）

<400> 5

ccaagagtca tcaggaacgc acgtaatcaa gagtcctgag ccaacaataa catctgccca 60

agtcaatgac cttcgagaat gctgtgttgg gactgtgaga aagcacagtt tgtgaaaagc 120

aggatgtggc cttttgggaa gttgagaggg tataaagata gttgtaatct tgcaataaaa 180

caatttcatg cttgcaccgg ccggagtccg tgccttcata caccacactt tatcttcaga 240

gcagttttcc tatgagtttg ggtaggagtc attttaaggt ctggtacctt tcacaagaac 300

ccattgtgtg tgctgaaggg tgtcctacct gaccaaagct gatgtgtagt tttttcactt 360

ggctgtagaa aatgtccccc ctcaaaattt ccctgtcatg caacccgatg cacaactcca 420

tagtttgagg ctgctaatat ttctgcagca aattggacca gccatcagtt gtatgacaac 480

gtaaacagtt tctttgctca ttgatatgct gggtgtttag tgaataacta acactaatac 540

tattgaatcg ggcacttaaa tctatttcaa tgagaactag attcaaatga gtttcatgca 600

tgatcttggg tatggcacct agaagctgtc tagatctttg atgctggagg gttttatctt 660

taaggcatgg agaacatttt tctaatttaa aaaaatactg caggcatgtg ttgtagagta 720

gcctgggcca caggaaaaca ataggttttg tcatctcttt gagttatatt ggataccaca 780

gttgtgggtg aattacatat gcatactttc caatacttag aagtcacttg actcttcaac 840

caatgaaaat ctgcaacaga tttcatagaa atatttacgt aaaggccctc ttctttccaa 900

attatttgac aggtatacat gctgaggtac actctcaaat gttcatctgt gaacctacat 960

ttaatgcatg gcgtgctgac tgcagtaaaa tagaatcata ctctttctag caccccttta 1020

tctgaataag agttatgtcc atggttatgt actgcacact tacaccctaa ggttttgaat 1080

tcatgacaag gcaaacatcg aaatgtagtg aaccaatggg aagctaattg aagttaaaat 1140

aaaactaatg ctaactggaa cattaaataa actttaaaat tgcatattgt ggagtaaaag 1200

ctttataaaa gtgttggtct acttgcttag ttgcagtgct ccacgctgct ttgcaggttt 1260

ttatttttgg ctcacatgtc ctatgctagt atggttttaa ctctttccat tggaatgcca 1320

tggtcctcaa agtgtgcatc ccttcgaaaa gagtatggct gctgagccct tccaaaacct 1380

tgtaaatgaa gcttttatta ttctctggtt caggtagtac attgttatgg aaacagaact 1440

aaaatcggtg tctgtacttt agcttccgct ccacatgcct gtacgcttct gggctgttga 1500

gcatcagcaa tgtatcattt gactaatgca ggtatatttt tgttgtagaa agttccagaa 1560

ataaaaggag gaacccgagg aggaagatg 1589

<210> 6

<211> 834

<212> DNA

<213> 山瑞鳖（Palea steindachneri）

<400> 6

tttggatccc tattaggtgc ttgcctaatc ctacaaatca ttacaggact attcttagcc 60

atacattatt caccaaacat ctcaacagca ttctcatcaa tcgcccatat cacccgagac 120

gtacaatacg gttgactaat ccgcaataca catgccaacg gagcctcaat attctttttc 180

tgcatttacc tacatatcgg acgaggatta tattacggct cataccttta caaacaaacc 240

tgaaacacag gcgtaatcct cctattatta accatagcca ctgcattcat aggctacgtc 300

ctaccatgag gacaaatatc cttttgaggc gctacagtca ttacaaactt actctcagct 360

atcccctaca tcggcaccac aatagtacaa tgagtttgag ggggcttctc tgtagacaac 420

gccaccctaa cacgattctt caccctacat ttcctacttc catttataat cctaggcttc 480

gccataattc acttacttct actacacgaa acaggctcaa acaacccaac agggttaaac 540

tcaaacaccg acaaaatccc attccatcca tatttttcat acaaagacct cctaggtttt 600

ataataatac taaccctact cctattaatt accatattct tcccaaactt actaggcgac 660

ccagacaact tcactccagc caacccacta tctaccccac cccacatcaa accagaatga 720

tactttctat ttgcctacgc aatcctacga tctatcccca ataaactagg aggcgtacta 780

gctctactac tttctatcct agtactattc atcctacccc tactacacac atca 834

Claims

1.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR引物组，其特征在于该引物组序列如下：

雌性特异正向引物如 SEQ ID No.1所示；

雌性特异反向引物如SEQ ID No.2所示；

内参正向引物如SEQ ID No.3所示；

内参反向引物如SEQ ID No.4所示。

2.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于该方法是：

将待检测山瑞鳖提取基因组DNA；以上述基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示引物进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现1589bp大小的条带且存在内参引物的扩增条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现内参引物的扩增条带时，山瑞鳖性别为雄性。

3.根据权利要求2所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于PCR扩增反应体系为：

50ng/μL山瑞鳖DNA模板 1μL

10μM雌性特异正向引物 2.5μL

10μM雌性特异反向引物 2.5μL

10μM内参正向引物 0.2μL

10μM内参反向引物 0.2μL

TaqMix 25μL

双蒸水 18.6μL；

4.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于该方法是：

以山瑞鳖全血作为样本，采用PicoPure DNA Extraction Kit的蛋白酶K进行样本裂解，得到样本裂解混合液；对样本裂解混合液采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所示引物进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出1589bp大小的条带且存在内参引物的扩增条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现内参引物的扩增条带时，山瑞鳖性别为雄性。

5.根据权利要求4所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于样本裂解体系包括山瑞鳖全血0.1-0.5μL，1ug/μL蛋白酶k溶液10.5-10.9μL；总体积共11μL。

6.根据权利要求4所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于样本裂解条件为65℃裂解30min，95℃灭活10min。

7.根据权利要求4所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于所述山瑞鳖全血为初孵稚鳖未脱落卵黄囊内存留的血液，或稚鳖、成鳖后肢皮肤针刺采集的血液。

8.根据权利要求4所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于PCR扩增体系为：

样本裂解混合液 11μL

10μM雌性特异正向引物 2.5μL

10μM雌性特异反向引物 2.5μL

10μM内参正向引物 0.2μL

10μM内参反向引物 0.2μL

TaqMix 25μL

双蒸水 8.6μL；

9.一种山瑞鳖性别快速鉴定试剂盒，其特征在于包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4所示引物。