CN108588237A - 中华鳖性别鉴定引物组、位点及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组中华鳖性别鉴定的特异性引物及鉴别方法。本发明性别鉴定引物体系中的两对引物分别为一对雌性特异引物及一对利用雌雄基因组DNA均可扩增出的阳性参考引物。其中，雌性特异引物仅可在雌性基因组DNA中稳定扩增出一条196bp的条带，在雄性基因组DNA中无法扩增出条带；而阳性参考引物在雌雄基因组DNA中均可扩增出一条482bp条带。由此，在该PCR反应体系中，雌性基因组DNA能够扩增出196bp及482bp两条条带，而雄性仅可扩增出482bp一条条带。利用本发明的引物有利于正确进行中华鳖的性别鉴定，尤其是肉眼难以区分性别的胚胎期中华鳖的性别鉴定。为中华鳖的研究奠定了基础，也为中华鳖的养殖与人工选育提供了重要工具。

Description

中华鳖性别鉴定引物组、位点及方法

技术领域

本发明涉及用于扩增中华鳖W染色体连锁基因SBNO1特异性序列的特异性引物及雌雄中华鳖基因组DNA均能够扩增出482bp序列的阳性参考引物，尤其涉及中华鳖性别鉴定的引物组及鉴定方法。

背景技术

中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属于爬行纲龟鳖目(Testudinata)鳖科(Trionychidae)鳖属，别名甲鱼、团鱼、水鱼等，是一种重要的水生爬行动物。世界自然保护联盟IUCN将其列为濒危物种红色名录的易危(VU)物种。其广泛分布于我国除新疆、西藏和青海外的其他各省，在越南、日本、朝鲜、帝汶岛和夏威夷群岛也有引入。

中华鳖作为中国主要的名贵水产养殖品种之一，由于雄鳖较雌鳖生长快，裙边厚，为国内消费者所偏爱，拥有更高的商品价值。目前并没有有效的分子鉴定中华鳖性别的方法，而通过其它技术手段，例如核型分析或分析比较基因组杂交(CGH)图鉴别中华鳖胚胎及稚鳖的性别难度大，花费时间长，且存在一定的错误率。因此，建立鉴定中华鳖性别的简单有效的分子方法不仅利于中华鳖的水产养殖选种和良种培育，也对中华鳖乃至整个爬行动物大类的研究具有重要意义。

发明内容

本发明提供了扩增中华鳖W染色体上连锁的SBNO1基因的特异性引物和雌雄均可扩增出相同条带的阳性对照引物，以及在此基础上的中华鳖性别鉴定方法，使用本发明提供的引物能够有效扩增中华鳖W染色体上SBNO1基因特异序列，并以此PCR产物为基础鉴别中华鳖个体性别。本发明的目的是提供中华鳖的性别鉴定引物组及鉴定方法，它能满足现有技术的上述需求。

用于扩增中华鳖W染色体连锁基因SBNO1上的雌性特异序列SB1-W的特异性引物序列如下所述，(其中，上游引物核苷酸序列在序列表中为SEQ ID NO.1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.2)

另外，为了避免中华鳖雌性个体基因组DNA未扩增所造成的误读，特在PCR扩增时增加一对雌雄个体基因组DNA均可扩增出482bp长度片段的阳性参考引物CK1-482。由此，利用该引物组进行PCR扩增后，将扩增产物通过琼脂糖电泳凝胶跑胶成像，可通过电泳条带区分样本性别。其中，雌性能够扩增出196bp及482bp两条条带，而雄性仅可扩增出482bp一条条带。该阳性对照引物的核苷酸序列如下所示(其中，上游引物核苷酸序列在序列表中为SEQ ID NO.3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.4)

中华鳖性别鉴定的分子方法是采用所述的SB1-6’-196与CK1-482引物组，使用25μL体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段的PCR扩增。

所述的25μL PCR体系是：

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，变性到延伸过程35个重复，72℃末期延伸5min。

待扩增完成后，将扩增产物通过琼脂糖电泳凝胶电泳成像，通过电泳条带的条数区分样本性别。

琼脂糖凝胶电泳成像的方法是：TAE缓冲液配制1％的琼脂糖电泳凝胶，并加入每100mL胶液4μL DNA Green核酸染料(如使用其它核酸染料，则按日常使用比例添加)；待胶凝固，取PCR产物5μL点入胶孔(自配制反应体系需混入Loading Buffer)，加入1X TAE缓冲液进行180V，400mA电泳12min；电泳完成后，用凝胶成像仪进行拍照，读取电泳条带以确认性别。其中，雌性个体DNA能够扩增出196bp及482bp两条条带，而雄性仅可扩增出482bp一条条带。

SBNO1基因在中华鳖中有两个同源拷贝。本实验中将该基因的两个拷贝称为SBNO1-Z和SBNO1-W，其中SBNO1-Z为Z染色体连锁，SBNO1-W为W染色体连锁。本发明根据SBNO1-W和SBNO1-Z差异区段设计了雌性特异引物，并根据另一基因SF3A1设计了阳性参考引物。

本发明所述的中华鳖W染色体上SBNO1基因特异序列(SEQ ID NO.5)如下：

CCAAATGGAGACAGAGCTGGATTCTTGATAGGTGATGGTGCTGGTGTAGGAAAAGGAAGGACCATAGCTGGAATAATCTATGAAAATTACTTGTTGGGAAGAAAAAGGGCTGTATGGTAGGTTAACTATTTGTGATAGTATTTAAAGTTTTTAAGCTTTTTTTTGGGCAAGTCTTGAATTGTGGTGCATTTGTAAATGACAGCAAAAGACCAATTTTGTATGTTTCTTTTGTTTTGTATCCAGGTTTAGTGTGTCAAATGATCTGAAATATGATGCGGAAAGAGACTTGAGGGACATTGGAGCAAA。

本发明较过去的传统核型分析等鉴定中华鳖性别的方法更为准确高效，利用本发明的引物组及性别鉴定方法，有利于正确进行中华鳖的性别鉴定，这对中华鳖与性别相关，尤其与中华鳖胚胎相关的研究的展开至关重要。

附图说明

图1A是利用本发明中华鳖性别鉴定引物组对已知性别的雌雄各10个个体日本品系成年中华鳖基因组DNA的扩增效果图。图中250bp-I DNA ladder从小到大(由下往上)条带分别对应100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。

图1B是利用本发明中华鳖性别鉴定引物组对已知性别的成年黄河品系中华鳖(黄河流域，又称黄河鳖)以及成年太湖品系中华鳖(又称江南花鳖，太湖鳖)基因组DNA的扩增效果图。其中YR对应黄河品系中华鳖，TL对应太湖品系中华鳖，NC代表阴性对照。图中250bp-I DNA ladder从小到大(由下往上)条带分别对应100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。

具体实施方式

本发明的中华鳖性别鉴定引物组设计及分型共三个步骤：1.以前期实验发现的中华鳖性染色体连锁基因的差异区段设计了雌性特异引物；2.设计雌雄中华鳖基因组DNA均可有效扩增，且不会与雌性特异引物对产生非特异性扩增的阳性参考引物；3.将合成的引物组对成年中华鳖基因组DNA进行扩增，检验其扩增准确性和效率，并对引物组的比例、退火温度等进行调整；4.采用步骤3的扩增产物，用凝胶成像仪进行拍照，读取电泳条带以确认性别。

下面结合实例对发明作进一步说明：

样品准备：采集中华鳖样品个体肝脏组织用以提取DNA。中华鳖样品为成体中华鳖共24只，包含雌雄成年日本品系中华鳖各10只，雌雄成年太湖品系中华鳖各1只以及雌雄成年黄河品系中华鳖各1只。

DNA提取：GENERAY细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取DNA，按照试剂盒说明方法提取。

引物合成：根据已经测得的中华鳖SBNO1-Z和SBNO1-W序列的差异位置，设计雌性特异引物进行扩增。另外，根据基因SF3A1高度保守区段设计阳性参考引物，使其在性别鉴定引物体系中能够无差别扩增雌雄鳖基因组DNA，得到482bp序列作为阳性参考。具体引物序列见序列表。

引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的样品。设置PCR热循环退火温度为61℃。

扩增结果检测：扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示该引物可有效扩增并区分中华鳖个体性别(如图1A和B所示)。扩增产物长度分别为196bp及482bp，条带清晰可辨，可用于中华鳖性别的鉴定。

引物扩增体系：PCR反应总体积为25μL，以样本中华鳖基因组DNA为模板，加入2XTaq Master Mix 12.5μL、引物2μL(SB1-6’-196正、反向引物各0.75μL和CK1-482正、反向引物各0.25μL，引物浓度10μmol/μl)、基因组DNA 1μL及ddH2O 9.5μL。

引物扩增条件：

区分性别的方法：TAE缓冲液配制1％的琼脂糖电泳凝胶，并加入每100mL胶液4μLDNA Green核酸染料；待胶凝固，将电泳凝胶放入电泳槽对应位置，加入1X TAE缓冲液使其浸没凝胶；取PCR产物5μL点入胶孔，进行180V，400mA电泳12分钟；电泳完成后，读取电泳条带以确认性别。其中，雌性能够扩增出196bp及482bp两条条带，而雄性仅可扩增出482bp一条条带。在验证实验中，我们利用共24只来自三个不同地区的、雌雄各12只中华鳖的基因组DNA进行PCR扩增，并读取凝胶电泳结果，发现在这24只中华鳖中，雌性均能够扩增出196bp及482bp两条条带，而雄性均仅可扩增出482bp一条条带，表明该方法的准确率达到100％，能够准确鉴定出中华鳖个体的性别(如图1B)。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 中华鳖性别鉴定引物组、位点及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtaggaaaag gaaggaccat agctgg 26

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatacaaaa caaaagaaac atacaaaatt gg 32

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgtatgcaa ctcttccctc tcctattc 28

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcttccatt cggtcttgtc ctg 23

<210> 5

<211> 306

<212> DNA

<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensis)

<400> 5

ccaaatggag acagagctgg attcttgata ggtgatggtg ctggtgtagg aaaaggaagg 60

accatagctg gaataatcta tgaaaattac ttgttgggaa gaaaaagggc tgtatggtag 120

gttaactatt tgtgatagta tttaaagttt ttaagctttt ttttgggcaa gtcttgaatt 180

gtggtgcatt tgtaaatgac agcaaaagac caattttgta tgtttctttt gttttgtatc 240

caggtttagt gtgtcaaatg atctgaaata tgatgcggaa agagacttga gggacattgg 300

agcaaa 306

Claims (7)

1.一种中华鳖性别鉴定引物组，其特征在于包括一对特异引物SB1-6’-196，以及阳性参考引物CK1-482，

所述引物的核苷酸序列如下所示：

2.一种用于中华鳖性别鉴定的分子方法，其特征在于采用权利要求1所述的两对引物，同体系内用25μL PCR体系，对样本基因组DNA进行PCR扩增，然后将扩增产物通过琼脂糖电泳凝胶跑胶成像，通过特异PCR产物条带区分样本性别。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的25μL PCR体系是：

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增条件是：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，变性到延伸过程35个重复，72℃末期延伸5min。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的特异PCR产物条带为：雌性基因组DNA能够扩增出196bp及482bp两条条带，而雄性仅可扩增出482bp一条条带。

6.一种用于鉴定中华鳖性别的位点：其特征在于所述的位点为位于中华鳖W染色体上SBNO1基因雌性特异序列；所述的特异序列如下：

CCAAATGGAGACAGAGCTGGATTCTTGATAGGTGATGGTGCTGGTGTAGGAAAAGGAAGGACCATAGCTGGAATAATCTATGAAAATTACTTGTTGGGAAGAAAAAGGGCTGTATGGTAGGTTAACTATTTGTGATAGTATTTAAAGTTTTTAAGCTTTTTTTTGGGCAAGTCTTGAATTGTGGTGCATTTGTAAATGACAGCAAAAGACCAATTTTGTATGTTTCTTTTGTTTTGTATCCAGGTTTAGTGTGTCAAATGATCTGAAATATGATGCGGAAAGAGACTTGAGGGACATTGGAGCAAA。

7.一种中华鳖性别鉴定的方法，其特征在于：利用在中华鳖性染色体Z和W上连锁的SBNO1基因本身，使用该基因在这两条染色体上存在的序列差异设计引物，进行中华鳖性别的鉴定。