CN104789691B - 一种基于一步pcr技术进行凡纳滨对虾遗传性别鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种通过一步PCR技术即可实现对虾性别鉴定的方法，包括对虾DNA的提取、一步PCR性别鉴定引物设计、一步PCR性别鉴定PCR扩增体系建立、PCR产物检测及遗传性别的鉴定。本实验确立了用于性别鉴定的PCR引物和最佳条件，一步PCR性别鉴定引物在雌性个体会有扩增产物，而雄性个体无扩增产物，因此可以直接通过脂糖凝胶电泳即可对雌雄个体进行鉴定。本发明方法是一种快速、简便、低成本的性别鉴定方法，鉴定中不需要昂贵的基因分型仪器，仅需要PCR仪和电泳仪，并且分析的时间快、成本低，适合大规模推广。

Description

一种基于一步PCR技术进行凡纳滨对虾遗传性别鉴定的方法

技术领域

本发明属于水产生物技术中的对虾性别鉴定技术，具体地说，是一种时间快、成本低、方法简便的对虾性别遗传鉴别方法，适合在实验室和育种基地进行大规模推广。

背景技术

凡纳滨对虾原产于中南美洲，野生种群分布在从墨西哥到智利的太平洋沿岸海域，自1988年由中国科学院海洋研究所的张伟权研究员从美国夏威夷引进后，因其适应性好,生长快,抗病力强,养殖速度发展很快,已成为我国沿海和内陆包括淡水地区的主要养殖品种(李刚(2007).凡纳滨对虾选择育种效应与生长规律的研究硕士,西北农林科技大学；于洋(2014).凡纳滨对虾分子标记的开发及其在遗传育种中的应用博士,中国科学院研究生院(海洋研究所))。在对虾养殖过程中，主要影响对虾产量的是生长速度和抗病力，为了提高凡纳滨对虾的生长速度，科研人员进行了选择育种、多倍体育种、雌核发育、单性化群体培育等方面的研究，(Farafidy(安迪).凡纳滨对虾体重和体尺性状的遗传参数和选择育种效果研究硕士,西北农林科技大学,2011.；朱春华,冉维亮,邓思平，李广丽.环境因子对凡纳滨对虾性别分化的影响.水生生物学报2011,03:414-422；张彬,韦嫔媛,熊建华,谢达祥,赵永贞，陈晓汉.凡纳滨对虾胚胎发育进程及诱导染色体加倍时间确定.南方农业学报,2014,04:664-670.)，由于对虾雌雄性别的异质性，雌虾的生长速度显著快于雄虾，因此在生产中培育全雌的对虾群体能够显著提高对虾产量。

为了培育对虾全雌群体，需要首先明确对虾的遗传性别，并且需要在对虾处于幼虾阶段时就要进行性别的分析和鉴定，另外在全雌群体的培育试验中，需要进行大量的性别鉴定，因此需要建立一种快速、准确、成本低廉的对虾性别分子鉴定方法。

PCR技术是一种非常成熟的分子生物学技术，也是用于分子鉴定的常用技术，本发明利用雌雄对虾差异的DNA序列，合理设计引物，使得仅在雌性个体中能够扩增出条带，而在雄性个体中无条带，利用这种特点，可以直接通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测，不需要贵重的基因分型仪器，结果重复性好，鉴定快、成本低。

发明内容

本发明的目的是针对凡纳滨对虾批量性别分子鉴定的需要，通过设计特异性PCR引物，优化反应体系，通过琼脂糖凝胶电泳，即可实现凡纳滨对虾遗传性别的分子鉴定。

为实现以上目的，本发明采用的方案为：

提取对虾的基因组DNA，使用一步PCR进行性别鉴定的引物进行扩增，PCR产物进行电泳检测，最后根据电泳结果进行对虾性别鉴定。

所述的对虾基因组DNA提取方法采用天根植物基因组提取试剂盒中的说明书进行。

一步PCR进行性别鉴定的引物对序列为：

LvSDASF：AAGACAATGATTTTGAAG

LvSDASR：AAGAAACCGTGGGGGAAG。

所述的PCR扩增体系为：脱氧核苷酸混合物(10mmol/L)0.4μL，10×ExTaq DNA聚合酶缓冲液(TAKARA,日本)2.5μL，ExTaq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL,LvSDPF和LvSDPR(10μmol/L)各0.5μL，基因组DNA模板(50ng/μL)2μL，双蒸水补足20μL。

PCR反应程序为95℃预变性10min，扩增35个循环(95℃30sec，53℃30sec，72℃30sec)最后72℃延伸10min。

所述的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，步骤如下：

首先制备1％琼脂糖凝胶，并在琼脂糖凝胶中加入DuRed(北京泛博生物化学有限公司)核酸染料。

在PCR产物中加入6X的上样缓冲液，之后将PCR产物加入到琼脂糖凝胶孔中，Marker选择DL2000(TAKARA，日本),100V电压电泳20分钟。

电泳后的胶块使用BioRed凝胶成像系统查看电泳结果，使用Quantity One(BioRed，美国)软件获得电泳结果(如附图2所示)。

所述的对虾性别鉴定方法如下：根据电泳结果，如果电泳显示个体在350bp处有一特异性条带，则该个体为雌性个体，如果电泳显示个体在350bp处无条带，则该个体为雄性个体。

该方法的优点：

该方法仅通过一步PCR后进行琼脂糖电泳即可实现对虾性别的鉴定，操作简单，成本低廉，基本的实验室及育种基地即配备鉴定所需要的仪器设备，利于该方法的广泛推广。另外该方法的重复性好，鉴定准确率高，是一种准确方便的鉴定方法。

附图说明

图1：一步PCR扩增进行性别鉴定结果，箭头所示的350bp处的条带为雌性个体特异性条带，其中个体2、3、4、9、10、11、12、18、19、20鉴定为雌性，其余个体鉴定为雄性。

图2：一种基于一步PCR技术进行对虾性别鉴定的方法。图中电泳结果中雌性个体均在350bp处有一条带，而在雄性个体中350bp处没有条带。

具体实施方式

实施例1：一种基于一步PCR技术进行对虾性别鉴定的方法

具体步骤如下：

1.对待分析的24个对虾样品进行取样，取附肢或者肌肉组织30mg，并对每个个体的组织进行标记。

2.使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的DNA并标记，操作方法参考说明书。提取的DNA使用Nanodrop1000(Thermol)测定DNA浓度。

3.将提取的DNA使用如下引物进行PCR扩增：

LvSDPF：AAGACAATGATTTTGAAG

LvSDPR：AAGAAACCGTGGGGGAAG。

其中的PCR扩增反应的总体积为25μL，扩增反应体系为：脱氧核苷酸混合物(10mmol/L)0.4μL，10×ExTaq DNA聚合酶缓冲液(TAKARA,日本)2.5μL，ExTaq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL,LvSDPF和LvSDPR(10μmol/L)各0.5μL，基因组DNA模板(50ng/μL)2μL，双蒸水补足20μL。PCR反应程序为95℃预变性10min，35个扩增循环(95℃30sec，53℃30sec，72℃30sec)最后72℃延伸10min。

4.对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，步骤如下：

首先制备1％琼脂糖凝胶，并在琼脂糖凝胶中加入DuRed(北京泛博生物化学有限公司)核酸染料。

在PCR产物中加入6X的上样缓冲液，之后将PCR产物加入到琼脂糖凝胶孔中，Marker选择DL2000(TAKARA),100V电压电泳20分钟。

电泳后的胶块使用BioRed凝胶成像系统查看电泳结果，使用Quantity One(BioRed，美国)软件获得电泳结果如附图1所示。

5.按照图中所示，仅有一条带的为雌性个体，没有条带的为雄性个体，因此图1中标示的个体2、3、4、9、10、11、12、18、19、20为雌性，其余个体为雄性。

Claims (3)

1.一种基于一步PCR技术进行凡纳滨对虾性别鉴定的方法，其特征是：提取对虾的基因组DNA，采用一对特异性引物进行一步PCR扩增，PCR产物进行电泳检测，最后根据电泳结果进行对虾性别鉴定，在雌性个体的DNA中有特异性扩增产物，而在雄性个体中无特异性扩增产物，即实现了对虾的性别鉴定；

所述的特异性引物为：

LvSDASF：AAGACAATGATTTTGAAG

LvSDASR：AAGAAACCGTGGGGGAAG。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征是：PCR扩增的扩增体系如下：

10mmol/L脱氧核苷酸混合物0.4μL，10×ExTaq DNA聚合酶缓冲液2.5μL，2.5U/μLExTaq DNA聚合酶0.5μL,LvSDPF和10μmol/L LvSDPR各0.5μL，50ng/μL基因组DNA模板2μL，双蒸水补足25μL；PCR反应程序为95℃预变性10min，扩增35个循环，循环参数为95℃30sec，53℃30sec，72℃30sec，最后72℃延伸10min。

3.按权利要求1所述的方法，其特征是：所述电泳检测是通过琼脂糖凝胶电泳分析；根据电泳结果实现对虾的性别鉴定方法为：如果待分析个体的扩增产物经电泳后在350bp处有一条特异带，则该个体为雌性个体，如果电泳后无特异条带，则该个体为雄性个体。