CN103290107A

CN103290107A - 一种适于水稻杂交种真实性鉴定的ssr指纹图谱构建方法

Info

Publication number: CN103290107A
Application number: CN201310070930XA
Authority: CN
Inventors: 胡晋; 朱岩芳; 关亚静; 王建成; 胡伟民; 祝水金
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明提供一种适于水稻杂交种真实性鉴定的SSR指纹图谱构建方法，该方法的步骤依次包括水稻杂交种及其亲本种子基因组DNA提取、对所述基因组DNA进行SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析、针对前述SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析结果利用GeneScan软件进行SSR指纹图谱构建。本发明的优点在于利用SSR分子标记技术来构建水稻杂交种及其亲本的指纹图谱与常规的种植检验和生化检验相比，不受作物生长环境和季节的影响，结果更稳定可靠，省时省力；与常规的凝胶电泳和毛细管电泳检测相比，更加安全、低廉，快速且直观。

Description

一种适于水稻杂交种真实性鉴定的SSR指纹图谱构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术中的杂交种真实性鉴定技术，具体涉及一种适于水稻杂交种真实性快速准确鉴定的SSR指纹图谱构建方法。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，我国是世界上最大的杂交水稻种子生产国和消费国，具有庞大的杂交水稻种子市场。水稻杂交种的真实性和纯度是衡量种子质量的重要指标，直接影响农作物的产量、品质和农民的利益。快速、准确、简便、经济地鉴定杂交水稻种子真实性对育种和农业生产都具有重要意义。传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高、受季节限制。同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，且同工酶有组织和器官特异性、稳定性差。

DNA分子标记技术具有多态性好、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已开始广泛应用于作物杂交种真实性与纯度检测中。目前，应用较多的是SSR分子标记，常规SSR扩增产物分离检测技术主要有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管电泳技术。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中必然接触有毒的物质，如琼脂糖凝胶中的染色剂，聚丙烯酰胺凝胶中的变性剂等，毛细管电泳虽检测方便，但需要标记引物，增加了检测成本。相比之下，高分辨率熔解曲线分析具有明显优势：（1）PCR中只增加荧光染料的成本，不需设计探针，不需进行引物标记；（2）高通量，可在15min内检测一块96或者384孔板的样品；（3）操作简便，PCR结束后不需电泳和其他片段分离操作，扩增产物直接进行熔解分析；（4）检测结果准确性和稳定性较好；（5）样品可继续用于下游测序和其他检测工作。因此，高分辨率熔解曲线分析是一种高通量、快速、高灵敏度、低成本、闭管的突变与基因型检测方法（Croxford等，2008；Studer等，2009），大大减少了测序的工作量和成本，提高了核苷酸序列分析的效益。研究表明，高分辨率熔解曲线分析可以有效检测DNA水平的SNP、SSR和Indel等多种变异，技术上比其它方法更具优势。

高分辨率熔解曲线分析（High Resolution Melting Curve Analysis，HRM）是Gundry等于2003年提出的最初应用于单核苷酸多态（Single NucleotidePolymorphism，SNP）检测分析的一项新技术（Gundry等，2003）。该技术是根据碱基序列组成不同的核苷酸片段熔解温度不同这一物理性质，在聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）结束后于同一容器中直接进行高分辨率熔解，并利用饱和染料监控核苷酸片段的熔解过程，得到特征性熔解曲线，再根据熔解曲线的形态变化来判断核苷酸片段性质（片段长度、碱基序列和CG含量）的差异（Silvar等，2011）。饱和染料在DNA双链中会发出荧光，在升温过程中DNA双链解链熔解、荧光减弱，在变为单链时尤为急剧，从而形成熔解曲线，熔解曲线的形状与DNA片段长度、GC含量和碱基序列有关（Ririe等，1997）。其中，DNA熔解温度（Tm）为荧光降低50%的温度，其差别直观反映了目标DNA序列的变异（Wilhelm和Pingoud，2003）；Tm值的精确计算需要去除背景荧光（低温的线性下降和高温的指数下降），专用软件则可去除背景、产生正态化的熔解曲线。在利用高分辨率熔解曲线分析含突变位点基因时，由于突变位点不匹配会导致双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA双链上释放，根据荧光强度与时间曲线峰形差异就可以判断是否存在突变位点，而且不同突变位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此，高分辨率熔解曲线分析能够准确而有效地区分不同突变位点与不同基因型。目前，高分辨率熔解分析的应用领域主要集中在SNP分析、突变扫描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等医学和微生物学研究方面，近年来已成为生命科学研究中的热点技术（Tokuko等，2010）。在植物研究中，高分辨率熔解曲线分析的应用也已经逐步开展，主要用于SNP分析与做图、基因分型和种质鉴别等（Koeyer等，2010）。

常规的SSR指纹图谱构建方法大都基于SSR扩增产物的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，不适于农作物杂交种真实性简便、快速、准确鉴定。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管电泳技术在农作物杂交种鉴定中的不足，推进SSR等共显性分子标记技术在农作物杂交种真实性鉴定上的广泛应用与推广，提供一种操作简便、检测快捷、准确可靠的适于水稻杂交种真实性鉴定的SSR指纹图谱构建方法。本发明采用的技术方案如下所述。

一种适于水稻杂交种真实性鉴定的SSR指纹图谱构建方法，该方法的步骤依次包括水稻杂交种及其亲本种子基因组DNA提取、对所述基因组DNA进行SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析、针对前述SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析结果利用GeneScan软件进行SSR指纹图谱构建。

其中，基因组DNA提取步骤是以水稻杂交种及其亲本种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至10ng/μL，于-20℃保存备用。

其中，SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析步骤是：

采用10μL反应体系，内含Mg²⁺（25mM）1μL，SSR上下游引物（5μM）各0.3μL（上游引物：CCGATCTCATCAACCAACTG下游引物：CTTCACGAGGATCTCAAAGG），基因组DNA（10ng/μL）2μL，

480High Resolution Melting Master Mix（2×高分辨率溶解分析混合总液，含饱和荧光染料Resolight）5μL，灭菌双蒸水1.4μL。

PCR扩增程序条件为：95℃预变性10min，然后按95℃变性15s、62℃到53℃（每循环下降1℃）退火15s、72℃延伸20s的程序进行10个循环。再按照95℃变性15s、53℃退火15s、72℃延伸20s的程序进行45个循环。

扩增产物的高分辨率熔解步骤在PCR循环结束后立即进行，其程序为：升温至95℃1min，降温至40℃1min，然后再升温至60℃，从60℃连续升温至95℃过程中，每升高0.05℃，收集荧光1次。最后降温至40℃。

PCR反应和高分辨率熔解曲线分析程序在满足每步升温0.02～0.1℃的实时荧光定量PCR仪上完成。

其中，杂交种及其亲本的SSR指纹图谱构建步骤是：

用GeneScan软件进行数据分析，生成水稻杂交种及其亲本种子扩增片段高分辨率熔解曲线的归一化和差异图谱，建立SSR指纹图谱，该图谱用于杂交种及其亲本的鉴别。

其中，所述SSR指纹图谱中，水稻杂交种与其亲本种子都有其特异的曲线图谱，能将水稻杂交种与其亲本种子区别开来。

本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：

（1）本发明利用SSR分子标记技术来构建水稻杂交种及其亲本的指纹图谱，有利于水稻杂交种真实性的快速、准确鉴定，与常规的种植检验和生化检验相比，不受作物生长环境和季节的影响，结果更稳定、可靠，且省时省力；与常规的凝胶电泳和毛细管电泳检测相比，更加安全、低廉，快速且直观；构建DNA指纹图谱和鉴定技术使SSR分子标记技术在农作物杂交种真实性鉴定中广泛的推广应用打下良好的基础。

（2）本发明所采用的SSR指纹图谱构建及鉴定方法，除了可以应用于水稻杂交种真实性鉴定外，还可以应用于其他物种杂交种或种质的真实性鉴定。

（3）本发明所提供的指纹图谱构建及鉴定方法，除了可以应用于SSR指纹图谱构建，还可以应用于其他共显性分子标记技术，如SNP、Indel等的指纹图谱构建。

（4）本发明SSR指纹图谱构建方法可以在两个小时内完成384个样品的指纹分析，该方法具有操作简单、检测快速、直观实用等特点，可以促进SSR分子标记在准确、快速、简便的水稻杂交种真实性鉴定中更广泛地应用。

附图说明

图1是本发明实施例中RM211对Y两优689、Y58S及R689扩增结果的高分辨率熔解曲线归一化图谱（蓝色代表杂交种Y两优689，红色代表母本Y58S，绿色代表父本R689）；

图2是本发明实施例中RM211对Y两优689、Y58S及R689扩增结果的高分辨率熔解曲线差异图谱（蓝色代表杂交种Y两优689，红色代表母本Y58S，绿色代表父本R689）。

具体实施方式

下面给出本发明的较佳的实施例，这些实施例并非限制本发明的内容。

实施例

本实施例以水稻杂交种Y两优689及其母本Y58S和父本R689种子为供试材料，提取幼苗基因组DNA做模板，利用SSR引物RM211进行SSR-PCR扩增，对SSR-PCR产物高分辨率熔解曲线分析，利用GeneScan软件进行数据分析，将构建的SSR指纹图谱用于水稻杂交种Y两优689的真实性鉴定。

具体操作步骤如下：

（1）基因组DNA提取

以水稻杂交种及其亲本种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至10ng/μL，于-20℃保存备用。

（2）SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析

采用10μL反应体系，内含Mg²⁺（25mM）1μL，SSR引物RM211上下游引物（5μM）各0.3μL（上游引物：CCGATCTCATCAACCAACTG；下游引物：CTTCACGAGGATCTCAAAGG），水稻基因组DNA（10ng/μL）2μL，

PCR扩增程序条件为：95℃预变性10min，然后按95℃变性15s、62℃～53℃（每循环下降1℃）退火15s、72℃延伸20s的程序进行10个循环。再按照95℃变性15s、53℃退火15s、72℃延伸20s的程序进行45个循环。

PCR反应和高分辨率熔解曲线分析程序在可以满足每步升温0.02～0.1℃的罗氏

480实时荧光定量PCR仪上完成。

（3）杂交种及其亲本的SSR指纹图谱构建与鉴别

高分辨率熔解曲线分析程序结束后，用GeneScan软件进行数据分析，生成SSR引物RM211对水稻杂交种Y两优689及其母本Y58S、父本R689扩增片段高分辨率熔解曲线的归一化图谱（图1）和差异图谱（图2），如图所示，蓝色代表杂交种Y两优689，红色代表母本Y58S，绿色代表父本R689，建立SSR指纹图谱。由图1和图2，可以直观地看到杂交种Y两优689与其母本Y58S、父本R689的图谱具有显著的差异，从而将杂交种与亲本鉴别出来。

Claims

1.一种适于水稻杂交种真实性鉴定的SSR指纹图谱构建方法，其特征在于，该方法的步骤依次包括水稻杂交种及其亲本种子基因组DNA提取、对所述基因组DNA进行SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析、针对前述SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析结果，利用GeneScan 软件进行SSR指纹图谱构建。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA提取步骤是以水稻杂交种及其亲本种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至10 ng/μL，于-20℃保存备用。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SSR-PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析步骤是：

PCR扩增程序条件为：95℃预变性10 min，然后按 95℃变性15 s、62℃~53℃每循环下降 1℃，退火 15 s、72 ℃延伸 20 s 的程序进行 10个循环，再按照95℃变性15 s、53℃退火15 s、72℃延伸20 s的程序进行 45个循环；

扩增产物的高分辨率熔解步骤在 PCR 循环结束后立即进行，其程序为：升温至95℃ 1 min，降温至40℃ 1 min，然后再升温至60℃，从60℃连续升温至95℃过程中，每升高 0.05 ℃，收集荧光 1 次，最后降温至 40 ℃；

PCR反应和高分辨率熔解曲线分析程序在满足每步升温0.02~0.1℃的实时荧光定量PCR仪上完成。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，杂交种及其亲本的SSR指纹图谱构建步骤是：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述SSR指纹图谱中，水稻杂交种与其亲本种子都有其特异的曲线图谱，能将水稻杂交种与其亲本种子区别开来。