CN107513567A - 鹰嘴豆ssr指纹图谱的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鹰嘴豆SSR指纹图谱的构建方法。利用本发明开发的22对核心SSR引物(SEQ ID NO:1‑44)，进行PCR扩增，并结合荧光PCR毛细管电泳检测技术，可在短时间内完成鹰嘴豆品系鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点。本发明的方法可以对鹰嘴豆种子真伪进行有效监控，从DNA水平揭示品种间的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为鹰嘴豆优异种质资源的研究与利用、优异基因的挖掘及育种提供理论依据和技术支持，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和植物品种鉴别技术领域，具体地说，涉及鹰嘴豆SSR指纹图谱的构建方法及应用。
背景技术
鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)属鹰嘴豆属(Cicer)中的一个栽培种，因其籽粒形状酷似鹰头或鸡头而得名。鹰嘴豆起源于亚洲西部、地中海沿岸和埃塞俄比亚，是世界上种植面积较广的第二大食用豆类。全世界有40多个国家种植鹰嘴豆，其中印度和巴基斯坦为最主要的鹰嘴豆生产国。在我国，鹰嘴豆主要种植于新疆、甘肃等干旱或半干旱地区。鹰嘴豆适应性极强，具有耐旱、耐盐碱、抗病、抗虫等特点，是一座天然的抗逆基因库，是农作物抗逆性改良重要的基因来源。鹰嘴豆属于高营养豆类植物，富含高蛋白、高不饱和脂肪酸、高纤维素、高钙、高锌、高钾、高维生素B等有益人体健康营养素。现代医学表表明：鹰嘴豆对改善糖尿病及糖尿病引起的血脂代谢紊乱具有积极的意义。
目前我国对鹰嘴豆品种进行鉴定的主要方法是按照NY/T 2487-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南鹰嘴豆》进行田间测定。该方法简便、经济，但受限于许多形态学性状鉴定周期长、易受环境影响等因素。蛋白质电泳技术具有稳定性好、重复性高以及适用性强等特点，但对亲缘关系较近的品种难以有效鉴别。同工酶电泳技术能分析大量样品，技术比较简单，但受限于组织特异性、可利用的数量少、对酶的提取要求高等缺点。随着育种骨干亲本的利用集中化，传统的纯度鉴定方法已经不能适应品种鉴定和纯度分析的要求。
随着生物技术的飞速发展，基于分子标记技术而建立起来的DNA指纹图谱(fingerprint)在品种(品系)鉴别方面发挥着重要作用。DNA指纹技术是指由于不同品种间的遗传物质DNA的碱基组分、排列顺序不同，具有高度的特异性，能够可视化识别遗传物质DNA的碱基组分、排列顺序差异而区分品种的技术，主要包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP、EST等分子标记技术。品种DNA指纹数据库的构建在鹰嘴豆品种纯度及真实性鉴定、种子质量标准化、品种审定及产权登记保护、真假种辨别、品种纠纷等方面具有重要应用价值，在探究我国鹰嘴豆种质资源的亲缘关系、杂种优势群划分、种质资源创新利用及新品种选育等方面发挥着显著作用。
简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)，是第二代基于PCR技术的分子标记技术，具有多态性丰富、遗传信息多、操作便利、共显性、高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物资源遗传研究和分子辅助育种实践中。微卫星是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。为了有效保护我国鹰嘴豆的品种知识产权，有必要在我国开展鹰嘴豆微卫星标记开发，并应用于鹰嘴豆优良品种“分子身份证”构建的研究。
发明内容
本发明的目的是提供鹰嘴豆SSR指纹图谱的构建方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明提供一套鹰嘴豆核心SSR引物，包括22对核心SSR引物，分别对应于表1中Ca-SSR1～Ca-SSR22，引物信息如下：
表1 22对核心SSR引物信息
本发明还提供含有所述核心SSR引物的检测试剂或试剂盒。
本发明还提供所述核心SSR引物、或所述检测试剂或试剂盒在鉴定鹰嘴豆品系中的应用。
本发明还提供所述核心SSR引物、或所述检测试剂或试剂盒在鹰嘴豆种质资源改良中的应用。
本发明还提供所述核心SSR引物、或所述检测试剂或试剂盒在鹰嘴豆分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供一种鹰嘴豆SSR指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
1)提取待测鹰嘴豆的基因组DNA；
2)以提取的DNA为模板，分别利用表1中每对核心SSR引物进行PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物，构建鹰嘴豆的SSR指纹图谱。
前述的方法，进行PCR扩增前，还包括对每对核心SSR引物进行荧光标记的步骤，在引物对Ca-SSR1、Ca-SSR4、Ca-SSR5、Ca-SSR9、Ca-SSR10、Ca-SSR12、Ca-SSR13、Ca-SSR16～Ca-SSR19的上游引物5′端标记FAM荧光基团，在其余核心SSR引物对的上游引物5′端标记HEX荧光基团。
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min。
PCR扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix 5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 2.5μL。
前述的方法，对PCR扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，获得待测鹰嘴豆的SSR指纹图谱。
本发明还提供按照上述方法构建得到的鹰嘴豆SSR指纹图谱。
本发明还提供所述方法在鉴定鹰嘴豆品系中的应用。
按照上述方法构建待测鹰嘴豆的SSR指纹图谱，与采用相同方法获得的已知鹰嘴豆品种的SSR指纹图谱进行比较，若指纹图谱完全一致，则判定该待测鹰嘴豆属于已知鹰嘴豆品种，若材料间差异位点数≥2，则判定为不同鹰嘴豆品系，若材料间差异位点数<2，则判定为近似鹰嘴豆品系。
利用本发明的22对核心SSR引物，进行PCR扩增，并结合荧光PCR毛细管电泳检测技术对鹰嘴豆品系进行鉴定，可在短时间内完成鹰嘴豆品系鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点。本发明方法可以对鹰嘴豆种子的真伪进行有效监控，从DNA水平揭示品种间的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为鹰嘴豆优异种质资源的研究与利用、优异基因的挖掘及育种提供理论依据和技术支持，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中56份鹰嘴豆品系聚类分析结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明品种判定原则遵照以下国家标准进行，NY/T 2594-2014植物品种鉴定DNA指纹方法总则；NY/T 2487-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南鹰嘴豆》；GB/T 19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则。
实施例1 22对核心SSR引物的获得
本发明以56份代表性鹰嘴豆品系的基因组DNA为模板，对已报道的800对SSR分子标记(参见http://nipgr.res.in/CGAP2/download/genomic_resources/ssr/和VarshneyR K,Song C,Saxena R K,et al.Draft genome sequence of chickpea(Cicerarietinum)provides a resource for trait improvement.[J].Nature Biotechnology,2013,31(3):240-246.)进行筛选，获得22对重复性好、稳定性强的核心SSR引物(表2)。此22对核心SSR引物可完全鉴别56份鹰嘴豆品系之间的差异。所述的56份代表性参试鹰嘴豆材料见表3。
表2 22对SSR核心引物
表2引物分别对应序列表中的SEQ ID NO:1-44。
表3 56份鹰嘴豆品系
经过多次反复筛选，选择在连锁群上的均匀分布、多态性较高、PCR扩增较稳定，同时满足常规非变性凝胶电泳检测和毛细管荧光电泳检测两种技术平台，最终筛选出在鹰嘴豆品系间多态性信息含量值高、等位位点数多、重复性好、扩增带型清晰度高、连锁群分布均匀的SSR引物作为鹰嘴豆SSR指纹图谱库构建的核心引物。
实施例2鹰嘴豆特征指纹图谱的构建与鹰嘴豆品系鉴定方法的建立
1、鹰嘴豆总DNA提取
采用改良CTAB法提取供试样品DNA：取2g左右的新鲜幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末状装入2.0ml离心管中，放入-80℃冰箱保存待用；将预热到65℃的2×CTAB提取液，按占溶液容量的1％的比例加入β-巯基乙醇，充分混匀；取出研磨好的叶片组织，每份样品中加入800μL预热后的CTAB提取液，涡旋1-2min，65℃水浴1h(每15min上下颠倒轻翻一次，充分混匀)；水浴加热结束后，加入800μL氯仿/异戊醇(24：1)溶液于离心管中，混合15-20min，之后10000rpm离心15min；吸取600μL左右上清液移至新离心管(量可适当减少，但切不可接触蛋白质层)，后加入95％等体积乙醇，摇匀后于-20℃冰箱放置2h或者4℃冰箱过夜，保证充分沉淀；12000rpm离心10min，倒掉上清，保留沉淀；用90％乙醇500μL清洗白色沉淀，10000rpm离心5min，小心倒掉上清；室温风干，加入100μL ddH2O充分溶解沉淀。利用Nanodrop2000/2000C仪器检测样品DNA浓度，将DNA浓度稀释到50ng/μL，4℃保存备用。
2、以表3所述56份鹰嘴豆参试材料，利用实施例1筛选得到的用于扩增22个分子标记的引物对分别对所述的56个鹰嘴豆品系基因组DNA进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；10μL扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix 5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 2.5μL。
3、PCR扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，具体如下：
PCR产物样品准备及电泳分析：将FAM(蓝色)和HEX(绿色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释25倍，分别取等体积的上述2种稀释后溶液混合形成混合液，吸取1μL混合液、0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺分别加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出后立即置于碎冰上，冷却15min左右；瞬时离心10s，进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集。以DNA MarkerI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；无效等位变异的大小记录为0/0(注：小片段在前，大片段在后)。通过对多个位点的数据整合，最终形成不同鹰嘴豆品系的SSR指纹图谱(表4-1和表4-2)。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～5个参照材料的扩增产物。
不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过预试验确定。
检测结果判定：材料间差异位点数≥2，则为不同鹰嘴豆品系；材料间差异位点数<2，则为近似鹰嘴豆品系。比较56份鹰嘴豆材料的指纹数据，发现任意两个材料间的差异位点数都不小于2，说明这22对核心引物可以有效地将这些鹰嘴豆品系鉴别开；利用PowerMarker和MEGA软件进行聚类，分析参试材料间的遗传关系，从图1中可以发现在遗传相似系数为0.0295左右时可以将56份鹰嘴豆材料区分开。
实施例3 SSR指纹图谱在鉴定鹰嘴豆品系中的应用
提取已知品系名称的7个鹰嘴豆样品的叶片DNA，以实施例1筛选得到的分子标记组合中的22对引物分别对待检鹰嘴豆品种的DNA进行PCR扩增；参照实施例2的PCR反应体系，PCR反应程序，采用荧光毛细管电泳法和变异位点记录方法，将得到的指纹代码与本发明得到的鹰嘴豆品系的特征指纹图谱进行比对，以验证实施例2所建立鉴定方法的准确度。
结果发现，利用22对引物组合对7份鹰嘴豆材料进行PCR扩增，采用荧光毛细管电泳法测得7份鹰嘴豆样品变异位点，结果见表5-1和表5-2，与本发明建立的鹰嘴豆指纹图谱目标品系的差异位点数＜2，Y1-Y7为待测7个鹰嘴豆品系，经过对比鉴定得到Y1-Y7分别对应L0000753(BC4)，BYZD01-01(BC5)，BYZD01-03(BC37)，木鹰1号变异2号(WS7)，新317号2117(WS13)，新引1号(WS11)，BYZD01-06(BC1)，与已知品系名称一致，准确度100％。以上结果表明本发明筛选得到的22对引物组合可以较好的可以区分不同鹰嘴豆品系。应用本发明提供的鉴别鹰嘴豆品系或品种的方法准确性较高，适合推广使用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 鹰嘴豆SSR指纹图谱的构建方法及应用
<130> KHP171115873.4
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
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Claims (10)
1.鹰嘴豆核心SSR引物，其特征在于，包括22对核心SSR引物，分别对应于表1中Ca-SSR1～Ca-SSR22，引物信息如下：
表1 22对核心SSR引物信息
2.含有权利要求1所述核心SSR引物的检测试剂或试剂盒。
3.权利要求1所述核心SSR引物、或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在鉴定鹰嘴豆品系中的应用。
4.权利要求1所述核心SSR引物、或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在鹰嘴豆种质资源改良中的应用。
5.鹰嘴豆SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测鹰嘴豆的基因组DNA；
2)以提取的DNA为模板，分别利用权利要求1所述的每对核心SSR引物进行PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物，构建鹰嘴豆的SSR指纹图谱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进行PCR扩增前，还包括对每对核心SSR引物进行荧光标记的步骤，在引物对Ca-SSR1、Ca-SSR4、Ca-SSR5、Ca-SSR9、Ca-SSR10、Ca-SSR12、Ca-SSR13、Ca-SSR16～Ca-SSR19的上游引物5′端标记FAM荧光基团，在其余核心SSR引物对的上游引物5′端标记HEX荧光基团。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；
PCR扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix 5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 2.5μL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对PCR扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，获得待测鹰嘴豆的SSR指纹图谱。
9.权利要求5-8任一项所述方法在鉴定鹰嘴豆品系中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，按照所述方法构建待测鹰嘴豆的SSR指纹图谱，与采用相同方法获得的已知鹰嘴豆品种的SSR指纹图谱进行比较，若指纹图谱完全一致，则判定该待测鹰嘴豆属于已知鹰嘴豆品种，若材料间差异位点数≥2，则判定为不同鹰嘴豆品系，若材料间差异位点数<2，则判定为近似鹰嘴豆品系。
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-
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- 2017-09-15 CN CN201710831162.3A patent/CN107513567A/zh active Pending
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