CN106636342A - 基于川芎转录组序列开发的est‑ssr标记引物组、其获取方法及应用 - Google Patents
基于川芎转录组序列开发的est‑ssr标记引物组、其获取方法及应用 Download PDFInfo
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明公开了一种基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组、其获取方法及应用，本发明基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。本发明首次公开了川芎EST‑SSR标记引物组，该引物经验证后得到多态性较高的74对EST‑SSR，与通用引物相比，川芎EST‑SSR标记引物组具有多态性高，易扩增，重复性好，结果更准确等优点，可用于后续川芎的遗传图谱构建、川芎品种指纹图谱构建等基础研究，促进川芎分子育种和功能基因发掘、中药品种标准化等应用研究。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术开发及应用的技术领域，更具体地，涉及一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用。
背景技术
川芎为是伞形科藁本属药用植物，主要种植于四川彭州，都江堰等地，是我国著名传统中药材，以其干燥根茎入药，其味辛，性温，有活血行气、祛风止痛功效，用于治疗头痛、风湿、月经不调等。
川芎有效成分研究十分深入，研究者分离出了包括川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等多种有效成分。检索川芎研究文献结果显示，对川芎活性成分提取，药理药性上的研究较多。对川芎遗传多样性、种质指纹图谱、基因定位、遗传图谱构建、分子育种等研究却鲜有报道，川芎中能够用于上述研究的分子标记甚少，都是一些通用引物，如RAPD、ISSR、ITS等，使得川芎分子研究难以深入，严重限制了川芎优质种质资源快速、有效的选育及生产应用。
微卫星序列又称简单重复序列（SSR）、短串联重复序列，由若干个串联重复单元组成，每单元含1-10个核苷酸，广泛分布在真核生物基因组中（9-10）。SSR具有标记之间密度大、材料间多态性好、易扩增、重复性高等优点，已被广泛在水稻，玉米，小麦等作物上应用。SSR按来源分为两类genome-SSR和EST-SSR，随着EST数据库的不断丰富，EST-SSR被大量开发。截止目前，药用植物已有红花、丹参、党参、人参、西洋参、金银花等开发了EST-SSR，逐渐代替通用引物应用于遗传多样性、道地性鉴定等研究。
近年来二代测序飞速发展，成本急剧降低。使得利用转录组测序开发EST-SSR成为一种便捷高效的手段。但目前还未有利用川芎转SSR标记引物的报道。因此，利用转录组数据批量开发川芎EST-SSR引物。该标记能直接用于川芎种质资源指纹图谱构建、遗传作图、基因定位和比较基因组学研究，对川芎品种的标准化、真伪品种的鉴定、分子标记辅助选择育种都有重要作用。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用。
本发明提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，所述引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。
本发明还提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，该方法包括以下步骤：
（1）对川芎转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene；
（2）利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘；
（3）利用Primer 3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，得到设计的EST-SSR引物；
（4）采用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，用设计的EST-SSR引物对川芎DNA进行PCR扩增，然后进行毛细管电泳，根据电泳结果数据筛选出EST-SSR标记引物组。
进一步的，步骤（2）中，SSR位点发掘时的基本参数设置为：单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。
进一步的，步骤（3）中，引物设计时参数设置为：引物长度18-25bp；退火温度52.0-60.0℃，且上游引物和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%；PCR扩增产物长度100-300bp。
进一步的，步骤（4）中，PCR扩增的反应体系为：DNA2μL、5U·μL-1Tap酶0.2μL、10mmol·L-1引物2μL、2.5mmol·L-1dNTP 2μL、25mM 10×Buffer2μL、ddH2O 11.8μL。
进一步的，步骤（4）中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸6min。
本发明基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在川芎种质资源遗传多样性分析中的应用。
本发明基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在鉴定川芎品种中的应用。
本发明的有益效果：本发明首次公开了川芎EST-SSR标记引物组，该引物经验证后得到多态性较高的74对EST-SSR，与通用引物相比，川芎EST-SSR标记引物组具有多态性高，易扩增，重复性好，结果更准确等优点，可用于后续川芎的遗传图谱构建、川芎品种指纹图谱构建等基础研究，促进川芎分子育种和功能基因发掘、中药品种标准化等应用研究。
附图说明
图1是本发明开发的EST-SSR标记引物组的UPGMA聚类图谱；
图2是本发明利用引物对25得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图；
图3是本发明利用引物对43得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图；
图4是本发明利用引物对52得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
本发明的一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，其中，各引物的核苷酸序列如表1（序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148）所示。
一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，该方法包括以下步骤：
（1）拼接川芎转录组测序数据，得到通用基因库(unigene)；
（2）利用MISA软件发掘川芎EST-SSR位点；
（3）利用Primer3进行批量设计SSR引物；
（4）挑选235对引物进行合成，对收集的川芎资源进行扩增、验证；
（5）用NTSYS-pc2.l0e软件对川芎资源进行聚类分析，使用POPGENE对川芎各个引物多样性指数进行检测。
实施例1
本实施例制备川芎EST-SSR标记引物组，包括以下步骤：
(1)川芎转录组数据的SSR引物获得
（1.1）对川芎根转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene。
（1.2）利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘，基本参数设置为单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。
（1.3）采用Primer 3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，参数设置为引物长度18-25bp；退火温度52.0-60.0℃，且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%；PCR扩增产物长度100-300bp。去重复后，得到设计出的引物共计3602个，合成其中的235对。
（2）利用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，川芎材料如表2所示。用设计的EST-SSR引物对上述材料的DNA进行PCR扩增，用于验证引物设计的效率，同时筛选出多态性较高的核心引物。
（2.1）取新鲜幼嫩的川芎叶片，采用CTAB提取法提取川芎DNA。
（2.2）PCR扩增：总体积20μL，DNA2μL、Tap酶（5U·μL-1)0.2μL、引物（10mmol·L-1）2μL、dNTP(2.5mmol·L-1)2μL、10×Buffer(25mM)2μL、ddH2O 11.8μL。扩增反应程序为：预变性94℃5min，34个循环（94℃变性30S，56℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min，降温到20℃，-4℃保存）。
（2.3）PCR产物中加入5μL的dilution buffer，最后一孔加25μL DNALadder，30-1500bp分离胶进行毛细管电泳。
（2.4）利用毛细管电泳自动数据分析软件PROSizeTM分析数据，有条带的数据为“1”，没有条带的为“0”。
（2.5）使用NTSYS-pc2.l0e软件对34份川芎样品进行聚类分析，使用POPGENE软件计算各引物的等位基因数(Na)、基因多样性(h)和Shannon值(I)。
（2.6）利用实施步骤2.1-2.5对235对SSR引物进行检测，发现74对扩增条带清晰、且有多态性的引物。聚类分析结果显示34份川芎遗传相似系数为0.58-0.91，被分成两大类。Nei基因多样性为0.31，Shannon指数为0.46，川芎聚类结果没有明显的地域关系，这与四川川芎种植时相互引种有关。
表1
表2
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所
<120> 基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用
<160> 148
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccaaaaagt attgaatatg acaaa 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcccctggt actcaccatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agtgtgatgg agatggaggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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<211> 20
<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 23
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 17
<211> 21
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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tgttttcacc ccgttgtttt 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
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<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atggaaatcg atcggtgact 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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aggcaagaaa cgactcaaat g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaatttacgc agcagggttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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aaattagtgg tcccccgatg 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
aatttgcacc accccataga 20
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tcaacatatc tatggctcat ttcaa 25
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
cacgtgcatc cacacacata 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tatcgttgaa cccgaacctc 20
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<212> DNA
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<210> 56
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cgtgttaaat tcgttcgttc c 21
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
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<210> 58
<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 58
acttgcggcc acgtaaatag 20
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
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<210> 60
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<213> 人工序列
<400> 60
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<210> 61
<211> 20
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<212> DNA
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<400> 69
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<210> 70
<211> 22
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<213> 人工序列
<400> 70
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<210> 71
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<213> 人工序列
<400> 71
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<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 74
ggtaaggagg cggtttgatt 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
gcaatcaaac aatgccaaaa 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
gtgctggaaa acccaagaag 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
acttcgaatg tcggaatcca 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
cgaaatcgtc gaatgaatga 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
gcaatggatt aggaccgcta 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
ttttcgtcat ttcaccatcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
gtcgagaagc cgagagagaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
acccccgaca tttatcgagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
ccgttctcca aacaccaact 20
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<211> 20
<212> DNA
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gggggaaagaa aatcggaagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
tgaagccaag aacagtgcaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
aacaacccag agctgcaaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
gaagccactc actaatcgcc 20
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<213> 人工序列
<400> 88
ttaccaggaa gatcaccagg a 21
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
acaaaccaaa cgtcccacat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
ctttcctcta ggcgctttca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
cgtttgacat tttccgaggt 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
tcaacgaatt aggattcgcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
tattatttcc attcccgcca 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
cgatcaacgg tgatgatttg 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
tcctctttct ttgcctcagc 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
tactttccga ggtgaaggga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
cggatcttct tgctattcgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
gcccaccaag taaagattgc 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
cgcacacaca gacacacaag 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
ttgttacttc cacccccaga 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
ttgcattgct tctgcatgat 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
ggtcaaagaa gccgtagtgg 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
tccagattgt gggttgttga 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
ctggcacttg tacgaaacca 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
gtctgatatt gggcctgctc 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
atcggcctcc ttatcatcct 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
ataagttcgt gcaaatcggg 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
gcagcagcaa gaaatgtacg 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
tttgacacca ccaccatcag 20
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
ggtcatgctc aagaagttcc a 21
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
gttctggtgc aggacaaggt 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
aggttgtgag gcagatcaaa 20
<210> 113
<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 113
atgagttctt catccgtggg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
caatcaaatc ttcctccctc t 21
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
gcgacactcc tatgccatct 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
gcaagcctta catgcgttct 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
tgctaaatcg gcgagtttct 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
tcatttccat tacacacggc 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
gtttccgcca gtgaagtagc 20
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
caaaacatac aatttccctg gat 23
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
atcgagatgg gtggtctcag 20
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
ggaaacttga tgtggaaatg ag 22
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
cagatctccg tccagggtaa 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
actgcaatca atgtccacca 20
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
cagaatcacc agaacccgta a 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
ttgctgtgtt tgaaatgttg g 21
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
ttgatggaaa acatcctacg g 21
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
taagaggtgg cggacagttt 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
cttctttttg gctgctaccg 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
aggaacactc ggcctcataa 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
acatcgacac caaacagcaa 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
aaggtcgcga aaatgatgac 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
cttgggtcgg gtcttgttta 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
ccactttcaa ttttccccaa 20
<210> 135
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
aaaagcaaac atcaatatga ccaa 24
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
cagctttagg gactcatcgg 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
gcatagtgaa gaagagccgc 20
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
caacccgaac taaaatctcc a 21
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
caaacaattc cacaagaacc aa 22
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
ttgctgcccc tactactgct 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
tgtcaatatg tgtttggggg 20
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
tcacctgcca cttagttttc c 21
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
agtaccacca cctccaccag 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
agcacatggt cctaactggg 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
ctggttgacc tggatgacct 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
tgatcaattc gaggagggtc 20
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
agagtgagcg acatcggagt 20
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
ccctcagctc ttccctttct 20
Claims (8)
1.一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。
2.一种获取权利要求1所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)对川芎转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene；
(2)利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘；
(3)利用Primer 3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，得到设计的EST-SSR引物；
(4)采用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，用设计的EST-SSR引物对川芎DNA进行PCR扩增，然后进行毛细管电泳，根据电泳结果数据筛选出EST-SSR标记引物组。
3.根据权利要求2所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，其特征在于，步骤(2)中，SSR位点发掘时的基本参数设置为：单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。
4.根据权利要求2所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，其特征在于，步骤(3)中，引物设计时参数设置为：引物长度18-25bp；退火温度52.0-60.0℃，且上游引物和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40％-60％；PCR扩增产物长度100-300bp。
5.根据权利要求2所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增的反应体系为：DNA 2μL、5U·μL-1Tap酶0.2μL、10mmol·L-1引物2μL、2.5mmol·L-1dNTP 2μL、25mM 10×Buffer 2μL、ddH2O 11.8μL。
6.根据权利要求2所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸6min。
7.权利要求1所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在川芎种质资源遗传多样性分析中的应用。
8.权利要求1所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在鉴定川芎品种中的应用。
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