KR101748566B1 - 초위성체 마커를 이용한 국화 품종식별 방법 - Google Patents

초위성체 마커를 이용한 국화 품종식별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초위성체 프라이머 세트를 이용한 국화 품종식별 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 국내에서 수집된 국화 128개 품종에 대해 다형성을 보이는 국화 품종식별용 초위성체 프라이머 세트를 이용한 국화 품종의 식별방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 국화 품종 식별용 초위성체 마커로 사용함으로써, 국화 품종의 진위성 규명, 종자 분쟁의 중재 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정 등과 같은 여러 분야에 크게 기여할 수 있다.

Description

초위성체 마커를 이용한 국화 품종식별 방법{A method for identifying chrysanthemum varieties using microsatellites markers}
본 발명은 초위성체 마커를 이용한 국화 품종식별 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 국화 품종을 식별하기 위한 초위성체 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용한 국화 품종의 식별 방법에 관한 것이다.
DNA 마커는 게놈상에서 다형성 여부를 판단할 수 있는 특정 염기서열 단편을 의미한다. DNA 마커는 작물 육종분야에서 형질과 연관된 마커의 개발과 이를 이용한 marker assisted selection (MAS), 유전자 지도 작성, 양적 형질 유전자좌 분석, 순도 검정, 유전적 다양성 분석 및 품종식별 등의 분야에 활용되고 있다.
일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성 검정과 품종간 동위효소의 차이를 통한 검정, DNA 분석 방법으로 나뉜다. 이 중 DNA 분석 방법은 표현형에 근거한 식별방법에 비해 재배환경 및 작물의 생장단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점이 있다. 국제 신품종 보호 연맹(UPOV)은 DNA 마커를 신품종의 특성조사와 식물 품종보호권 부여에 활용하기 위한 논의를 진행 중이며, 아직까지 유전자 수준에서 단순한 염기서열 차이를 품종의 구별성으로 인정하고 있지는 않으나, 품종식별을 위한 분자표지의 활용 가능성을 제안하고 있다. 구체적으로 분자표지 종류 중 품종간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체상의 분포 정도를 고려할 때 SSR(Simple Sequence Repeat), SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 방법을 활용하는 것을 제안하고 있다.
국내에서 품종식별에 대한 DNA 분석 개발 및 활용 현황을 살펴보면, 농촌진흥청에서 벼, 콩 등에 대한 SSR 분자표지 및 딸기에 대한 CAPS 분자표지를 이용한 품종식별 기술을 보고한 바 있다. 국립종자원은 SSR 분자표지를 이용하여 고추, 배추, 수박, 토마토, 복숭아, 장미, 양파, 사과, 상추, 블루베리, 멜론, 딸기, 감귤, 자두 등에 대한 작물의 DNA 프로파일을 데이터베이스화하였으며, 종자 분쟁 발생시 이를 중재하기 위한 수단으로서 분자표지를 활용하고 품종보호 출원품종에 대한 대조품종 선정에 유전자 분석 결과를 활용하고 있는 추세이다.
국외 국가의 사례를 살펴보면 스페인에서는 포도, 복숭아 등의 작물에 SSR 분석 기술을 이용하여 각 품종별 DNA 프로파일을 데이터베이스화하여 기본 유래 품종의 식별, 기존 품종 관리 등에 활용하고 있다. 중국의 경우 옥수수 약 4000 품종에 대하여 SSR, SNP 분자표지를 이용한 DNA 프로파일을 데이터베이스화하고 있으며 법원에서도 품종보호 침해사례 판단에 유전자분석 결과를 적극 활용하고 있다. 일본은 복숭아, 배, 사과 등에 SSR 분자표지와, 딸기, 차에 CAPS 분자표지를 활용한 품종식별 방법을 개발하여 육종가 권리 보호에 활용하고 있다. 또한, 유럽에서는 감자, 토마토 등에 대하여 많은 품종을 수집하여 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축한 후 재배심사에 활용 가능성을 연구하고 있다.
2014년 11월 현재 국립종자원에 신품종보호 등록된 국화 품종수는 437품종, 국내 생산수입판매신고 건수는 601건으로 국화의 국내 품종보호 출원 및 생산수입판매신고 건수는 증가하고 있는 추세이다. 국화의 품종검정을 위해서는 재배시험을 수행해야 하며 재배시험시 재배 환경의 영향을 받고, 특성검정에 시간이 소요되기에 분자표지를 이용한 육종과 품종식별 방법 개발의 중요성이 증대되고 있다.
따라서, 본 발명에서는 국내에서 수집된 국화 품종을 대상으로 분자표지를 이용한 국화 품종식별 방법 및 체계를 확립하고자 하였다.
본 발명은 국화 품종식별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종식별용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 국화의 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-13 프라이머 세트; 및 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-14 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트 (이하 'CHM-1 내지 CHM-14 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트'라고도 함)를 포함하는, 국화 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 국내에서 유통되는 국화 품종에 대해 높은 다형성을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 프라이머 세트는 국화 품종을 식별하기 위해 이용될 수 있다. 상기 프라이머 세트는 예를 들면, 하기 표 2에 기재된 국화 품종 중 하나 이상의 품종을 식별하기 위해 이용되는 것일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 CHM-1 내지 CHM-14 프라이머 세트 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 또는 13개 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프라이머 세트는 CHM-1 내지 CHM-14 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 14쌍의 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타내었다. 본 명세서에서 '마커'는 각 프라이머 세트를 통해 얻어진 증폭 산물 또는 각 프라이머 세트 자체를 의미하는 것일 수 있다.
서열번호 SSR 프라이머 서열 형광라벨
1 CHM-1
　		 정방향: TGAGATCATTCCCAACCTCC VIC
2 역방향: CTAGCGTCCAAAGAATTGGC 　
3 CHM-2
　		 정방향: CCCCCTCTTCTTCTTCAACC NED
4 역방향: CAATAGAAAGCGCGTGACAA 　
5 CHM-3
　		 정방향: AGTGACCCGAGCCAGATAGA FAM
6 역방향: CCGACAAATCATTTCCGTCT 　
7 CHM-4
　		 정방향: TAACAAGGGGTTTCAGCGTC FAM
8 역방향: TCAGGAAGAACAACCCAACC 　
9 CHM-5
　		 정방향: CCCAGAGAAGCGTGAGATTT VIC
10 역방향: TCCCCTGCTACTACCACCAC 　
11 CHM-6
　		 정방향: AGCTAAAACAAACAAGCGGC NED
12 역방향: GCGTTAACTGTGTCGGTTGA 　
13 CHM-7
　		 정방향: CTGTTGAGCAGTTCAGGCAC FAM
14 역방향: GTGTGATCGAGGCGATTTTT 　
15 CHM-8
　		 정방향: ACACCGAATAGGACGGACAG PET
16 역방향: TTTTCTGAAGTCCCGACCAC 　
17 CHM-9
　		 정방향: CCAAAATGGAGACCAGGAGA NED
18 역방향: TCCAGTTGCTTCAGTTGGAA 　
19 CHM-10
　		 정방향: TCTTCCTCACACGCAAACAC FAM
20 역방향: AGCTGCCACTCGCTATCACT 　
21 CHM-11
　		 정방향: CGATCACCATTCTTTTCCCA PET
22 역방향: CCGATAAGTTCGTCCTTGGT 　
23 CHM-12
　		 정방향: TGGTTATGGGTGACCCTGAT VIC
24 역방향: AAGAAAGTGCAGGCCAAGAA 　
25 CHM-13
　		 정방향: AGGAAGAAGATCGACACCCA NED
26 역방향: AAGTTCGGGTTTCCCCATAC 　
27 CHM-14
　		 정방향: CACAACCAGACAAGCCTTCA FAM
28 역방향: ACTAACGGCGGTAGCTGAGA 　
상기 프라이머 세트를 구성하는 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체(analogue), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid) 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 형광 표지 물질은 VIC, NED, FAM, PET, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 표지될 수 있다. 또한, 방사성 표지 물질은, 32P 또는 35S 와 같은 방사성 동위원소가 첨가된 PCR 반응액을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭 산물에 혼입될 수 있다.
또한, 본 발명은 CHM-1 내지 CHM-14 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 국화 품종식별용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트는 CHM-1 내지 CHM-14 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.
상기 키트는 DNA 중합 효소, dNTP 및 PCR 완충용액을 더 포함할 수 있다. 또한, PCR 반응 또는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분이 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 국화로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 CHM-1 내지 CHM-14 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 얻어진 증폭 산물로부터 상기 국화의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 국화 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
상기 게놈 DNA는 상기 국화의 잎, 줄기, 또는 그의 조합으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 게놈 DNA는 식물체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 상기 게놈 DNA는 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용하여 수득될 수 있다.
상기 방법에서, 핵산의 증폭은 PCR을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 핵산의 증폭은 CHM-1 내지 CHM-14 프라이머 세트를 모두 사용하여 수행되는 것일 수 있다. PCR 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수 있다. PCR 반응은 당업계에 PCR 반응에 필요한 것으로 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응액은 예를 들면, 분석하고자 하는 국화로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 프라이머 세트, DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은, 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 겔 전기영동을 통해 검출할 경우, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 형광 측정을 통해 검출할 경우, 형광 물질로 표지된 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 형광 측정기를 이용하여 형광을 측정할 수 있다. 방사성 측정을 통해 검출할 경우, 방사성 물질을 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)와 같은 방사성 측정기를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
상기 방법에서, 얻어진 증폭 산물로부터 상기 국화의 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, CHM-1 내지 CHM-14 프라이머 세트 중 상기 국화의 핵산 증폭시 이용된 프라이머 세트에 의해 공지된 국화 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 증폭된 산물로부터 국화 품종을 결정하는 단계는 자동 염기서열 분석기를 이용하여 증폭 산물(밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램에 의해 확인함으로써 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 공지된 국화 품종에 대하여 본 발명의 프라이머 세트를 통해 증폭된 산물(각 대립유전자에 해당함)의 유무를 미리 하나의 표로 정리한다. 구체적으로, 대립유전자가 존재할 때에는 "1"로 나타내고 대립유전자가 존재하지 않을 때에는 "0"으로 나타낸다. 품종을 식별하고자 하는 국화로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물의 크기를 분석한 다음, 이 분석 결과를 상기 공지된 국화 품종의 핵산을 증폭한 결과와 통계 프로그램을 이용하여 비교함으로써 국화의 품종을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 국화 품종 식별용 프라이머 세트는 여러 국화 품종에 대한 식별능이 우수하여, 국화 품종의 진위성 규명, 분쟁종자대비시험 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정 등과 같은 여러 분야에 활용될 수 있다.
도 1a 내지 1h는 국화 128개 품종을 대상으로 본 발명에 따른 국화 품종식별용 프라이머 세트를 사용하여 확인된 대립유전자의 유무를 코드화한 결과를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 본 발명에 따른 국화 품종식별용 프라이머 세트에 의해 분석된 각 국화 품종의 유전적 유사도를 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 국화 품종식별을 위한 마커의 평가
(1) 국화 시료
본 발명에서는 하기 표 2에 기재된 국화 128개 품종을 국화 품종식별 가능성 검정을 위해 사용하였다.
연번 품종명 구분 연번 품종명 구분
1 보라미 스탠다드 65 세이아스트론 스프레이
2 무지개 스탠다드 66 스위트스노우 스프레이
3 휘파람 스탠다드 67 포드 스프레이
4 하이백산 스탠다드 68 스위트썬 스프레이
5 매직 스탠다드 69 스윗캔디 스프레이
6 수미 스탠다드 70 핑키 스프레이
7 일월 스탠다드 71 아티퍼플레이디 스프레이
8 체리블럿섬 스탠다드 72 아티다크초콜릿 스프레이
9 포리스트아로마 스탠다드 73 예스홀릭 스프레이
10 백마 스탠다드 74 째즈 스프레이
11 피치엔디 스탠다드 75 옐로우드림 스프레이
12 파워엔디 스탠다드 76 스파이벨리 스프레이
13 드림라운드 스탠다드 77 옐로우마블 스프레이
14 파이어핑크 스탠다드 78 Sei-agness 스프레이
15 신마 스탠다드 79 옐로우키드 스프레이
16 금화 스탠다드 80 챔피 스프레이
17 보령황국 스탠다드 81 오렌지드림 스프레이
18 그린엔디 스탠다드 82 자리타 스프레이
19 델리아카리 스탠다드 83 오렌지키드 스프레이
20 화이트런너 스탠다드 84 히라리오 스프레이
21 설미 스탠다드 85 젬블라 스프레이
22 에코그린 스탠다드 86 Cheeks 스프레이
23 젬블라라임 스탠다드 87 파이어옐로우 스프레이
24 그레이스엔디 스프레이 88 카리스옐로우 스프레이
25 킹피셔 스프레이 89 핑키카리스 스프레이
26 예스루비 스프레이 90 옐로우팡팡 스프레이
27 보그 스프레이 91 핑크팡팡 스프레이
28 드림해피 스프레이 92 루비나 스프레이
29 드림리버 스프레이 93 홍파 스프레이
30 퍼플캡 스프레이 94 국야진주 스프레이
31 롤리팝 스프레이 95 국야미홍 스프레이
32 핑크맘 스프레이 96 국야백미 스프레이
33 아르거스 스프레이 97 국야수율 스프레이
34 퍼플콘 스프레이 98 국야연미 스프레이
35 Biarittz P 스프레이 99 국야설화 스프레이
36 골드리치 스프레이 100 알마도리스 스프레이
37 골든보이 스프레이 101 암플루 스프레이
38 바카디필 스프레이 102 마이루비 스프레이
39 핑키보이 스프레이 103 비노 스프레이
40 바티칸 스프레이 104 마이걸 스프레이
41 연자 스프레이 105 핑크아이 스프레이
42 나오스 스프레이 106 마이소울 스프레이
43 네스터 스프레이 107 가야골드 스프레이
44 세이프릴그린 스프레이 108 가야오렌지 스프레이
45 델리단테퍼플 스프레이 109 가야글로리 스프레이
46 델리비스카리 스프레이 110 가야옐로우 스프레이
47 델리텐츠 스프레이 111 가야네온 스프레이
48 델리퀘백 스프레이 112 가야루비 스프레이
49 델리마리모 스프레이 113 퍼플에그 스프레이
50 델리팀 스프레이 114 줄리엣 스프레이
51 러브마인 스프레이 115 피스큐티 스프레이
52 여심 스프레이 116 가야핑크 스프레이
53 매직스타 스프레이 117 마이골드 스프레이
54 델몬트 스프레이 118 마이써니 스프레이
55 써니엔디 스프레이 119 마이레드 스프레이
56 바운스엔디 스프레이 120 가야센스 스프레이
57 아도스 스프레이 121 마이윙 스프레이
58 아즈마 스프레이 122 마이크림 스프레이
59 사스인옐로우 스프레이 123 넓은잎구절초 스프레이
60 노스타 스프레이 124 캔디볼 화단국
61 사스인크림 스프레이 125 다솜볼 화단국
62 세이렌느 스프레이 126 마루볼 화단국
63 세이마이라 스프레이 127 마당볼 화단국
64 세이테드 스프레이 128 금방울 화단국
(2) 국화 게놈 DNA 의 분리
상기 표 2에 기재된 국화 품종의 잎을 채취하여 2 ㎖ Eppendorf 튜브에 텅스텐 구슬 2개를 넣고 분쇄기(FRITSCH, Germany)에 돌려 종자를 고르게 마쇄하였다. 이어 NucleoSpin?PlantⅡ (Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 세포 용해 버퍼(lysis buffer)는 PL2를 사용하였다. 추출된 게놈 DNA를 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 농도를 확인하고, 정량한 후 PCR 분석을 위해 냉동고(-20℃)에서 보관하였다.
(3) 프라이머 세트의 제작
국화 품종식별에 효율적인 분자표지를 선발하기 위하여, '예스모닝', '하이백산', '매직', '옐로우캡', '수미', '백마', '오렌지엔디', '피치엔디' 총 8품종으로부터 분리된 DNA와 기 보고된 국화 741개의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음, 8품종에서 다형성을 나타내는 17개의 분자표지를 선발하였다. 이들 17개의 분자표지에 대하여, 형광 발생 물질 VIC, NED, FAM 및 PET 중 하나로 형광 표지된 올리고뉴클레오티드를 제작하여 정방향 프라이머로 이용하였다. 자동 염기서열 분석기 (Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystems)를 통한 분석 결과, 상기 128개의 국화 품종에 대하여 재현성이 높고 밴드의 패턴이 깨끗하면서 다형성 정도가 높은 14개의 분자표지를 선정하였다. 선정된 14개의 분자표지에 대한 14쌍의 프라이머 세트를 상기 표 1에 나타내었다.
(4) PCR 증폭 및 전기영동
상기 128개의 국화 품종으로부터 분리된 게놈 DNA 및 14쌍의 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭 및 전기영동을 수행하였다.
PCR 반응액은 국화 게놈 DNA 20 ng, 10 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머 세트, 2.0 ㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq DNA polymerase 1U(GeNet bio, Korea), 2.5 ㎕의 10X PCR 완충용액(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl2)에 증류수를 첨가하여 제조하였고, 전체 부피를 25 ㎕로 조절하였다. PCR(Biometra, Germany) 증폭은 94℃에서 4분 동안 국화 게놈 DNA를 충분히 변성시킨 다음, 94℃에서 변성 30초, 55℃에서 어닐링 30초, 및 72℃에서 신장 45초를 40회 반복 수행하고, 최종 신장을 위하여 72℃에서 신장 10분을 수행하였다. PCR 완료 후, 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인하였다. 증폭된 시료들은 다음 실험을 위해 4℃ 냉장고에서 보관하였다. 증폭된 시료를 멸균된 증류수 150 ㎕에 적정 농도로 희석한 다음, 희석된 1 내지 3 ㎕의 PCR 산물을 탈이온 포름아마이드(deionized formamide) 10 ㎕, 사이즈 마커 (LIZ500 size standard) 0.25 ㎕와 잘 혼합하여 섞고 94℃에서 2분간 변성시켰다. 변성시킨 증폭 산물을 자동 염기서열 분석기를 통해 전기영동하였다. GeneMapper 컴퓨터 프로그램 (Applied Biosystems)을 이용하여 각 분자표지별 대립유전자의 정확한 크기를 결정하였다.
(5) 본 발명에 따른 마커의 국화 품종식별 가능성 검정
본 발명에 따른 마커의 국화 품종식별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 PIC(polymorphism information content)값을 산출하였다. 하기 식 1에서 K는 각 대립유전자의 총 밴드수이며 Pi는 마커의 밴드 중에서 i 번째 공통 밴드패턴의 빈도수를 나타낸다 (Anderson et al. 1993).
<식 1>
Figure 112014120702821-pat00001
마커별 어닐링 온도(℃), 증폭 산물의 크기(bp), 대립유전자의 수 및 PIC 값을 하기 표 3에 나타내었다.
서열번호 마커명 어닐링
온도(℃) 		증폭 산물의 크기 대립유전자수 PIC 값
1 및 2 CHM-1 55 206-214 4 0.663
3 및 4 CHM-2 55 197-240 7 0.779
5 및 6 CHM-3 55 233-247 5 0.572
7 및 8 CHM-4 55 262-270 4 0.374
9 및 10 CHM-5 55 129-154 4 0.668
11 및 12 CHM-6 55 176-182 3 0.508
13 및 14 CHM-7 55 204-219 6 0.617
15 및 16 CHM-8 55 227-240 5 0.558
17 및 18 CHM-9 55 190-196 4 0.657
19 및 20 CHM-10 55 247-259 6 0.766
21 및 22 CHM-11 55 208-240 7 0.656
23 및 24 CHM-12 55 145-151 3 0.481
25 및 26 CHM-13 55 126-136 3 0.314
27 및 28 CHM-14 55 129-181 10 0.690
　 Total 　 　 71 　
　 Mean 　 　 5.1 0.593
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 국화 품종식별용 프라이머 세트는 서열번호 1과 2(마커명: CHM-1), 서열번호 3과 4(마커명: CHM-2), 서열번호 5과 6(마커명: CHM-3), 서열번호 7과 8(마커명: CHM-4), 서열번호 9와 10(마커명: CHM-5), 서열번호 11과 12(마커명: CHM-6), 서열번호 13과 14(마커명: CHM-7), 서열번호 15와 16(마커명: CHM-8), 서열번호 17과 18(마커명: CHM-9), 서열번호 19와 20(마커명: CHM-10), 서열번호 21과 22(마커명: CHM-11), 서열번호 23과 24(마커명: CHM-12), 서열번호 25와 26(마커명: CHM-13) 및 서열번호 27과 28(마커명: CHM-14)의 14개 마커의 평균 PIC값은 0.593으로, 본 발명의 마커를 통해 국화 품종의 식별이 충분히 가능함을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 마커에 대해 대립유전자(밴드) 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수 "1"로 코드화하고 밴드가 존재하지 않을 경우에는 "0"으로 코드화하였다.
도 1a 내지 도 1h는 국화 128개 품종을 대상으로 본 발명에 따른 국화 품종식별용 프라이머 세트를 사용하여 확인된 대립유전자의 유무를 코드화한 결과를 나타낸다.
품종을 식별하고자 하는 국화로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭 산물과 도 1a 내지 도 1h의 결과를 비교 분석함으로써 국화 품종을 식별할 수 있다.
대립유전자의 유무를 NTSYS pc(version 2.10b)(Rohlf, 2000) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법(Sneath and Sokal, 1973)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 계산된 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973)에 의해 집괴 분석하여 계통도(dendrogram)를 작성하고 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 국화 품종식별용 프라이머 세트에 의해 분석된 각 국화 품종의 유전적 유사도를 나타낸다. 이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 모든 품종의 구별이 가능함을 확인할 수 있었다.
<110> Korea seed and variety service <120> A method for identifying chrysanthemum varieties using microsatellites markers <130> PN108213 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-1 F <400> 1 tgagatcatt cccaacctcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-1 R <400> 2 ctagcgtcca aagaattggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-2 F <400> 3 ccccctcttc ttcttcaacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-2 R <400> 4 caatagaaag cgcgtgacaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-3 F <400> 5 agtgacccga gccagataga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-3 R <400> 6 ccgacaaatc atttccgtct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-4 F <400> 7 taacaagggg tttcagcgtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-4 R <400> 8 tcaggaagaa caacccaacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-5 F <400> 9 cccagagaag cgtgagattt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-5 R <400> 10 tcccctgcta ctaccaccac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-6 F <400> 11 agctaaaaca aacaagcggc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-6 R <400> 12 gcgttaactg tgtcggttga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-7 F <400> 13 ctgttgagca gttcaggcac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-7 R <400> 14 gtgtgatcga ggcgattttt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-8 F <400> 15 acaccgaata ggacggacag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-8 R <400> 16 ttttctgaag tcccgaccac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-9 F <400> 17 ccaaaatgga gaccaggaga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-9 R <400> 18 tccagttgct tcagttggaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-10 F <400> 19 tcttcctcac acgcaaacac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-10 R <400> 20 agctgccact cgctatcact 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-11 F <400> 21 cgatcaccat tcttttccca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-11 R <400> 22 ccgataagtt cgtccttggt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-12 F <400> 23 tggttatggg tgaccctgat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-12 R <400> 24 aagaaagtgc aggccaagaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-13 F <400> 25 aggaagaaga tcgacaccca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-13 R <400> 26 aagttcgggt ttccccatac 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-14 F <400> 27 cacaaccaga caagccttca 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHM-14 R <400> 28 actaacggcg gtagctgaga 20

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-13 프라이머 세트; 및 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 CHM-14 프라이머 세트를 포함하고, 하기 표에 열거된 국화 품종 가운데 하나 이상을 식별하는, 국화 품종식별용 프라이머 세트
    [표]
    Figure 112016125300765-pat00012
    .
  2. 삭제
  3. 청구항 1의 국화 품종식별용 프라이머 세트를 포함하고, 하기 표에 열거된 국화 품종 가운데 하나 이상을 식별하는, 국화 품종식별용 키트
    [표]
    Figure 112016125300765-pat00013
    .
  4. 국화로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 1의 국화 품종식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    얻어진 증폭 산물로부터 하기 표에 열거된 국화 품종 가운데 상기 국화의 국화 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 국화 품종을 식별하는 방법
    [표]
    Figure 112016125300765-pat00014
    .
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 게놈 DNA는 상기 국화 잎, 줄기, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것인, 국화 품종을 식별하는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것인, 국화 품종을 식별하는 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 국화 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, 청구항 1의 국화 품종식별용 프라이머 세트에 의해 하기 표에 열거된 국화 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것인, 국화 품종을 식별하는 방법
    [표]
    Figure 112016125300765-pat00015
    .
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