KR101531303B1 - 초위성체 마커를 이용한 콩 품종 식별 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국내에서 유통되고 있는 콩 품종에 대하여 다형성을 나타내는 콩 품종을 식별하기 위한 마커, 콩 품종 식별 방법, 및 상기 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 국내에서 유통되고 있는 콩 148개 품종에 대해 높은 다형성을 갖는 초위성체 마커의 조합을 선별하고 이를 이용하여 국내에 육성된 콩 품종 식별을 식별할 수 있게 한다. 본 발명의 방법에서 사용된 콩 품종 식별용 분자 표지는 국내에서 육성된 콩 148개 품종을 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 콩 품종의 진위성 규명, 보급종 및 원종 종자 생산시 혼종 여부의 검정, 품종 보호 출원시 대조 품종의 선정 및 침해 여부의 확인 등과 같은 여러 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

초위성체 마커를 이용한 콩 품종 식별 방법{A method for identifying soybean varieties using microsatellites markers}
본 발명은 국내에서 육성된 콩 품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커, 상기 마커를 포함하는 키트, 및 상기 마커를 이용한 콩 품종의 식별 방법에 관한 것이다.
국제 신품종 보호 동맹(UPOV)에서는 품종보호제도 및 품종식별에 분자 마커의 활용시 신뢰도 높은 분석 결과를 도출하기 위하여, 유전자 분석 방법 및 DNA 마커의 선정, DNA 분리 방법 및 데이터베이스 구축 등에 대한 가이드라인을 제시하고 있다. 이 가이드라인에서는 분자 마커의 활용시 실험실 및 연구자 간에 반복 재현성이 높을 뿐만 아니라 공우성을 나타내며, 이용된 분자 마커가 염색체상에 고르게 분포되어 있을 뿐만 아니라 여러 가지 분석 장비를 활용하더라도 동일한 결과를 나타내어야 한다는 기준을 제시하고 있다. 이러한 기준에 가장 적합한 유전자 분석 방법이 염색체상에 존재하는 단순 반복 염기서열의 차이를 활용하여 분석 재료 및 품종 간에 다형성을 확인하는 SSR(simple sequence repeat) 분석 방법이라고 할 수 있다. 실제로 유럽품종보호사무소 (CPVO)에서는 밀, 감자, 장미, 토마토, 유채 등과 같은 작물을 대상으로 하여 여러 국가가 참여하는 유전자 분석 컨소시엄을 구성하고 분석 마커와 재료간 및 실험실간에 오차를 비교 분석하고 각 작물별 100 내지 500 품종 이상에 대한 DNA profile 데이터베이스를 구축하여 그 연구 결과를 보고하고 있다. 일본에서는 옥수수, 골풀, 딸기, 복숭아, 사과, 밤 등의 작물에 대하여 SSR 분석 기술을 활용하여 품종식별 체계를 구축하여 이 마커를 농업 생산물의 가공품에 대한 품종 진위성 확인 및 자국 농산물의 보호 등과 같은 분야에 활용하고 있다. 중국의 경우 옥수수와 벼에 대하여 SSR 분석 기술을 활용하여 품종별 데이터베이스를 구축하고 이를 품종보호침해 및 종자의 순도 검정 등 다방면에 이용하고 있다.
한편, 우리나라의 경우 국립종자원에서 종자시장에서 중요도가 높거나 분쟁의 발생 가능성이 높은 채소작물인 고추, 수박, 무, 배추, 참외, 멜론, 오이 등과 같은 작물에 대하여 다형성이 높은 SSR 마커를 활용하여 작물당 100 내지 500 품종 이상에 대한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축하였거나 구축 중에 있다. 이 결과는 품종보호출원 품종의 대조품종 선정 및 품종보호 재배심사시 구별성, 균일성 및 안정성을 확인하는데 이용되고 있다. 최근에는 품종보호등록 품종의 특성 유지 확인에 있어서 유전자 분석 기술과 재배시험에 의한 특성조사를 융복합적으로 이용하고 있다. 또한 품종식별 분자 마커는 농가와 종자 회사 및 종자회사 간에 발생하는 품종 진위성과 관련된 종자분쟁 발생시 이를 중재하기 위한 하나의 수단으로 적극 활용되고 있는 실정이다.
우리나라 콩의 재배 면적은 2012년 기준 80,842 ha이며 생산량은 122,519톤으로 과거에 비해 그 다소 감소하고 있는 추세이다. 그러나, 최근 건강에 대한 국민의 관심 증대로 인하여 그 중요도는 점점 커질 것으로 예상되며, 육종 목표도 다수성 이외에 용도별 신품종 개발, 기능성 고품질, 안정생산을 위한 병충해 및 재해 저항성 품종 개발 등으로 다양화되고 있다. 국내 콩 품종은 2013년 5월 31일 기준 국가 목록 등재 및 품종 보호 출원 및 등록된 163개 품종이 국내에서 생산 및 보급되고 있다.
분자 마커를 이용한 콩의 유전자원 특성 평가 및 품종식별에 대한 국내외 연구 동향을 살펴보면, 2006년도에 20개의 SSR 마커 중 다형성 정도가 높은 5개의 SSR 마커를 활용하여 우리나라 콩 품종 91개 중 82 품종이 식별됨을 확인한 이래(Kim, S.H. et al., 2006 Korean J. Crop Sci. 51, 658-668), 최근에는 STS-CAPS(Sequence tagged sites-Cleaved amplification polymorphic sequence) 마커를 개발하여 콩 110 품종 중 106 품종의 판별이 가능하다는 연구내용이 보고되고 있다(Hwang, T.Y. et al., 2012 Korean J. Breed Sci. 44, 258-272). 일본의 경우 377개 SSR 마커를 활용하여 82개 유전자원 및 육성품종에 대해 유전적 다양성을 분석하였으며(Hwang, T.Y. et al., 2008 Breeding Science 58, 315-323), 미국에서는 콩 품종식별에 적합한 SNP 마커를 개발하여 132개 유전자원 및 품종의 식별에 대한 연구결과를 보고한 바 있다(Yoon, M.S. et al., 2007 Theor. Appl. Genet. 114, 885-899). 이러한 국내외 연구 결과를 종합해 볼 때, 우리나라에서 육성된 콩 품종에 대한 식별력이 우수한 분자 마커를 선정하고 자동염기서열분석기 등과 같은 정밀기기를 활용하여 정밀한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축하고 이를 활용할 수 있는 체계는 아직 확립되지 않은 상태이다.
이에 본 발명자는 국내외에서 육성된 콩 148개 품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 선별하고, 이를 프라이머로 이용하여 콩 게놈 DNA를 증폭시킨 후, 생성된 증폭 산물에 대하여 대립 유전자 패턴 및 PIC(Polymorphic Information Content) 값을 분석한 결과, 상기 초위성체 마커가 콩 품종 식별 방법에 적합하여 원종 및 보급종의 혼종 여부에 대한 과학적 검증 및 품종 보호 출원시 대조 품종 선정 등에 실용적으로 활용할 수 있음을 밝혀, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 우리나라에서 육성된 콩 148개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 초위성체 마커를 이용하는 콩 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 국내외에서 육종된 콩 품종에 대한 유전적 유사도를 DNA 수준에서 예측 가능하게 함으로써 이를 품종 보호 출원시 대조품종 선정에 직접 활용할 수 있게 하는 콩 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내에서 유통되고 있는 콩 품종에 대하여 다형성을 나타내는, 서열번호 3 내지 6, 11, 12, 15 내지 22, 25, 26, 29 및 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 9쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 콩 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 콩 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 콩으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물로부터 콩 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 콩 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 국내에서 유통되고 있는 콩 품종에 대하여 다형성을 나타내는, 서열번호 3 내지 6, 11, 12, 15 내지 22, 25, 26, 29 및 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 9쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 콩 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 마커는 국내외에서 재배되어 유통되고 있는 콩 148개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커로서, 국내에서 유통되고 있는 콩 품종을 특이적으로 식별할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 마커는 하기 표 2에 기재된 콩 148개 품종에 대하여 높은 다형성 및 반복 재현성을 나타낸다.
본 발명의 마커는 예를 들면, 서열번호 3으로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6으로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 11로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 15로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16으로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 17로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 19로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20으로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 21로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 25로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 29로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 30으로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 상기 연속 뉴클레오티드의 길이는 예를 들면, 10 내지 20, 10 내지 19, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 10 내지 14, 10 내지 13, 10 내지 12, 또는 10 내지 11 뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 본 발명의 마커는 추가로, 서열번호 1로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 9로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10으로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 13으로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 23으로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 27로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 31로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 32로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다. 상기 연속 뉴클레오티드의 길이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 마커는 예를 들면, 하기 표 1에 기재된 서열번호 3 내지 6, 11, 12, 15 내지 22, 25, 26, 29 및 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 9쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 마커는 상기 9쌍의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 마커는 추가로, 하기 표 1에 기재된 서열번호 1, 2, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 23, 24, 27, 28, 31, 및 32의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 7쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
서열
번호		 초위성체
표지인자		 프라이머의 염기서열 (5' →3') 형광표지
1 Satt184
 정방향 : GCGCTATGTAGATTATCCAAATTACGC FAM
2 역방향 : GCCACTTACTGTTACTCAT
3 Satt216
 정방향 : TACCCTTAATCACCGGACAA VIC
4 역방향 : AGGGAACTAACACATTTAATCATCA
5 Satt614
 정방향 : CTCCCCTTTAACCTTTCCTTTATTAG NED
6 역방향 : CGCGGTAGGAATTAATTGTAGATAGGAT
7 Satt354
 정방향 : GCGAAAATGGACACCAAAAGTAGTTA PET
8 역방향 : GCGATGCACATCAATTAGAATATACAA
9 Sat_151
 정방향 : GCTGCATCAGATCACCCATCCTTC FAM
10 역방향 : CATGCCATGTTGTATGTATGT
11 Sat_255
 정방향 : CGGCATGTCATGGTATACGTAACTTTAGA VIC
12 역방향 : GCGCAACTGAAGCAAGAAAAGAAACCT
13 Satt417
 정방향 : TCTTGCTAATTGCTTCATTTCAT NED
14 역방향 : AATTGCTTGGGATTTTCATTT
15 Sat_391
 정방향 : GCGTAGGCATCGGTCAATATTTT PET
16 역방향 : GCGTTAGCGAGTGGATCAAGATCA
17 Satt308
 정방향 : GCGTTAAGGTTGGCAGGGTGGAAGTG FAM
18 역방향 : GCGCAGCTTTATACAAAAATCAACAA
19 Satt157
 정방향 : GGGCTCACTCTCGATAGTAGGTATAAAG VIC
20 역방향 : GGGATACCAAAAGGAATAATTGTCTT
21 Satt534
 정방향 : CTCCTCCTGCGCAACAACAATA NED
22 역방향 : GGGGGATCTAGGCCATGAC
23 Satt181
 정방향 : TGGCTAGCAGATTGACA PET
24 역방향 : GGAGCATAGCTGTTAGGA
25 Satt160
 정방향 : TCCCACACAGTTTTCATATAATATA FAM
26 역방향 : CATCAAAAGTTTATAACGTGTAGAT
27 Satt002
 정방향 : TGTGGGTAAAATAGATAAAAAT VIC
28 역방향 : TCATTTTGAATCGTTGAA
29 Satt030
 정방향 : AAAAAGTGAACCAAGCC NED
30 역방향 : TCTTAAATCTTATGTTGATGC
31 Satt070
 정방향 : TAAAAATTAAAATACTAGAAGACAAC PET
32 역방향 : TGGCATTAGAAAATGATATG
또한, 본 발명은 서열번호 3 내지 6, 11, 12, 15 내지 22, 25, 26, 29 및 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 9쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 콩 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트는 상기 9쌍의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는, 상기 9쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트에 더하여, 서열번호 1, 2, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 23, 24, 27, 28, 31, 및 32의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 7쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액(buffer)을 포함할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 콩으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 3 내지 6, 11, 12, 15 내지 22, 25, 26, 29 및 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 9쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 얻어진 증폭 산물로부터 콩 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 콩 품종을 식별하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 증폭 단계는 상기 9쌍의 프라이머 세트를 모두 사용하여 핵산을 증폭하는 것일 수 있다. 또한 상기 증폭 단계는, 서열번호 1, 2, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 23, 24, 27, 28, 31, 및 32의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 7쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 더 사용하여 핵산을 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 콩 품종 식별 방법에서 상기 게놈 DNA는 콩의 종자 및 콩의 식물 전체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 상기 게놈 DNA는 콩의 종자 또는 어린 식물체의 잎, 줄기 및 과실로부터 유래되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 콩의 종자 또는 콩의 잎, 특히 종자를 파종하고 출아한 후 콩의 어린 식물체의 잎으로부터 게놈 DNA를 채취할 수 있다.
본 발명의 콩 품종 식별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR 반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 콩으로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다.
본 발명의 콩 품종 식별 방법에서 얻어진 증폭 산물의 검출은 예를 들면, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 얻어진 증폭 산물의 검출은 자동 염기 서열 분석기를 이용하여 대립 유전자(밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램을 통해 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 콩 품종 식별 방법에서 얻어진 증폭 산물로부터 콩 품종을 결정하는 단계는 예를 들면, 공지된 콩 품종에 대하여 본 발명의 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표시하고, 얻어진 증폭 산물과의 비교 분석에 의해 콩 품종을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 증폭 산물의 유무를 표시하는 단계는 예를 들면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 공지된 콩 품종으로부터 나온 대립 유전자의 크기를 미리 하나의 표로 정리한 다음 대립 유전자의 존재 유무에 따라 존재할 때에는 "1"로 나타내고 존재하지 않을 때에는 "0"으로 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 품종을 식별하고자 하는 콩으로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고, 얻어진 증폭 산물의 크기를 분석한 다음 통계 프로그램을 통하여 모든 품종을 확인할 수 있다.
본 발명의 콩 품종 식별용 마커 만을 사용하여 국내에서 육성 보급되고 있는 콩 148개 품종을 식별할 수 있다. 따라서, 콩 품종의 진위성 규명, 콩 원종 및 보급종의 혼종에 대한 과학적 검증 및 품종 보호권의 침해 여부 및 품종 보호 출원시 대조품종의 선정 등과 같은 여러 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1d는 본 발명에 따른 마커에 의해 분석된 각 콩 품종을 코드화하고 NTSYSPC 컴퓨터 프로그램을 활용하여 콩 품종 식별 및 품종별 유전적 유사도를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2i는 국내외에서 육성된 148개 콩 품종을 대상으로 본 발명의 9쌍의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였을 때 대립 유전자의 크기(bp)에 따라 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고, 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3p는 국내외에서 육성된 148개 콩 품종을 대상으로 본 발명의 16쌍의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였을 때 대립 유전자의 크기(bp)에 따라 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고, 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 콩 품종 식별을 위한 마커의 평가
(1) 콩 시료
본 발명에서는 하기 표 2에 기재된 콩 148개 품종을 콩 품종 식별용 프라이머 세트의 선별 및 콩 품종 식별 가능성 검정을 위해 사용하였다.
연번 품종명 육성자 연번 품종명 육성자 연번 품종명 육성자
1 화성풋 강원도 51 단미 농촌진흥청 101 원황 농촌진흥청
2 흑청 강원도 52 다진 농촌진흥청 102 장기 농촌진흥청
3 호반 강원도 53 청자2 농촌진흥청 103 풍원 농촌진흥청
4 청아 강원도 54 소진 농촌진흥청 104 조남 농촌진흥청
5 대왕 강원도 55 선유 농촌진흥청 105 갈채 농촌진흥청
6 강일 강원도 56 검정새올 농촌진흥청 106 소황 농촌진흥청
7 햇살 강원도 57 단미2 농촌진흥청 107 영양 박의호
8 만풍 경기도 58 일품검정2 농촌진흥청 108 소영 박의호
9 연풍 경기도 59 흑미 농촌진흥청 109 풀무흑채 서울대
10 아가1 경북대 60 소청 농촌진흥청 110 풀무지기 서울대
11 아가2 경북대 61 녹원 농촌진흥청 111 아가3 소이벤처
12 경상2 경상대 62 만수 농촌진흥청 112 아가4 소이벤처
13 개척1 경상대 63 남풍 농촌진흥청 113 아가9 소이벤처
14 개척2 경상대 64 상원 농촌진흥청 114 아가8 소이벤처
15 경상3 경상대 65 대양 농촌진흥청 115 아가10 소이벤처
16 진농1 경상대 66 대흑 농촌진흥청 116 중황13 이영필
17 진양 경상대 67 흑성 농촌진흥청 117 경상1 제노마인
18 진율 농촌진흥청 68 대하1 농촌진흥청 118 갈미 충청남도
19 검정3 농촌진흥청 69 천상 농촌진흥청 119 조생서리 원자력연구소
20 안평 농촌진흥청 70 검정5 농촌진흥청 120 원율 원자력연구소
21 신기 농촌진흥청 71 원흑 농촌진흥청 121 원현 원자력연구소
22 청두1 농촌진흥청 72 소청2 농촌진흥청 122 진풍 농촌진흥청
23 대망 농촌진흥청 73 청엽1 농촌진흥청 123 조양1 농촌진흥청
24 청자3 농촌진흥청 74 익산나물 농촌진흥청 124 중모3008 농촌진흥청
25 대망2 농촌진흥청 75 알찬 농촌진흥청 125 대청 충청북도
26 미랑 농촌진흥청 76 풍산나물 농촌진흥청 126 우람 농촌진흥청
27 다장 농촌진흥청 77 신팔달2 농촌진흥청 127 황금올 농촌진흥청
28 금강 농촌진흥청 78 검정1 농촌진흥청 128 새단백 농촌진흥청
29 한남 농촌진흥청 79 단백 농촌진흥청 129 장연 경기도
30 일품검정 농촌진흥청 80 광안 농촌진흥청 130 늘찬 농촌진흥청
31 검정올 농촌진흥청 81 푸른 농촌진흥청 131 참올 농촌진흥청
32 장미 농촌진흥청 82 다원 농촌진흥청 132 부석태1 영주시
33 두유 농촌진흥청 83 대원 농촌진흥청 133 중모3009 농촌진흥청
34 부광 농촌진흥청 84 진품2 농촌진흥청 134 해품 농촌진흥청
35 소백나물 농촌진흥청 85 검정2 농촌진흥청 135 중모3004 농촌진흥청
36 일미 농촌진흥청 86 진품 농촌진흥청 136 중모3005 농촌진흥청
37 새올 농촌진흥청 87 소명 농촌진흥청 137 태광 농촌진흥청
38 명주나물 농촌진흥청 88 소담 농촌진흥청 138 만리 농촌진흥청
39 소원 농촌진흥청 89 선흑 농촌진흥청 139 장수 농촌진흥청
40 대황 농촌진흥청 90 팔도 농촌진흥청 140 무한 농촌진흥청
41 장원 농촌진흥청 91 송학 농촌진흥청 141 보광 농촌진흥청
42 새별 농촌진흥청 92 도레미 농촌진흥청 142 백운 농촌진흥청
43 청자 농촌진흥청 93 소호 농촌진흥청 143 큰올 농촌진흥청
44 선녹 농촌진흥청 94 진미 농촌진흥청 144 삼남 농촌진흥청
45 신록 농촌진흥청 95 서남 농촌진흥청 145 단원 농촌진흥청
46 소록 농촌진흥청 96 다기 농촌진흥청 146 남해 농촌진흥청
47 검정4 농촌진흥청 97 호장 농촌진흥청 147 단경 농촌진흥청
48 대풍 농촌진흥청 98 보석 농촌진흥청 148 새알 농촌진흥청
49 다채 농촌진흥청 99 소강 농촌진흥청 　 　 　
50 다올 농촌진흥청 100 녹채 농촌진흥청 　 　 　
(2) 게놈 DNA의 추출
상기 표 2에 기재된 공시된 콩 품종당 종자 5립을 게놈 DNA의 분리 재료로 이용하였다. 콩 종자 5립을 마쇄하여 NucleoSpin® PlantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA는 1.0% 아가로스겔에서 전기 영동하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 ㎕당 10 ng의 농도로 희석한 다음 이를 PCR 분석에 이용하였다.
(3) 품종식별용 SSR 프라이머 세트의 선발
콩 품종식별에 효율적인 분자표지를 선발하기 위하여 ‘청자’ 등 148품종(표 2)의 DNA를 기 보고된 40개 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음 반복 재현성이 높고 대립유전자의 패턴이 깨끗하며 다형성 정도가 높은 16개를 선정하였다. 이들 16개 분자 표지에 대해 자동 염기 서열 분석기를 통한 정밀 분석을 위하여, 정방향 프라이머에 형광 발생 물질 FAM, VIC, NED 및 PET 중 하나로 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 제작하였다.
(4) PCR 증폭 및 전기 영동
상기 준비된 게놈 DNA와 상기 제작된 마커를 재료로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 상기 제조된 콩 게놈 DNA 20 ng, 0.1 μM의 상기 마커, 2.0 ㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq polymerase 1U(Takara CAT. RR011A), 2.5 ㎕의 10 x PCR 버퍼(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl2)를 증류수에 첨가하여 전체 부피를 25 ㎕로 조절하였다. PCR(C1000, BioRad, 미국) 증폭은 94℃에서 10분 동안 게놈 DNA를 충분히 변성시킨 다음, 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 45초간 신장을 40회 반복 수행하였다. PCR 산물의 최종 신장을 위하여 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 각각의 프라이머 세트에 대한 어닐링 온도는 하기 표 3에 나타내었다. PCR이 완료된 후, 2.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인하였다. 증폭된 시료들은 다음 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다. PCR에 증폭된 시료들은 초순수 150 ㎕에 적정 농도로 희석한 다음, 희석된 3 ㎕의 PCR 산물을 탈이온된 포름아마이드(deionized formamide) 10 ㎕, 대립유전자 크기를 측정하는 사이즈 마커(size marker)(LIZ500 size standard) 0.25 ㎕를 잘 혼합하여 섞은 다음 94℃에서 2분간 변성시켰다. 변성시킨 유전자 증폭 산물은 자동 염기 서열 분석장치(Genetic Analyzer 3730XL, Applied Biosystem)를 활용하여 전기영동하였다. 각 품종별 초위성체 분자 표지에 대한 대립유전자 크기는 GeneMapper4.1 컴퓨터 프로그램(Applied Biosystem)을 이용하여 정확하게 측정하였다.
(5) 본 발명에 따른 마커의 콩 품종 식별 가능성 검정
상기에서 자동염기서열분석기로 확인한 대립유전자 크기를 이용하여 본 발명에 따른 마커의 콩 품종 식별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 PIC(polymorphism information content)값을 산출하였다. 하기 식에서 Pij는 마커 i의 밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다(Anderson et al., 1993, Genome 36: 181-186).
<식 1>
Figure 112013079294571-pat00001
그 결과, 각 마커에 따른 어닐링 온도(℃), 증폭 산물의 크기(bp), 대립 유전자의 수 및 PIC 값을 하기 표 3에 나타내었다.
연번 SSR 마커명 어닐링 온도(℃) 대립유전자의 크기(bp) 대립유전자의 수 PIC 값
1 Satt184 50 135-197 8 0.77
2 Satt216 50 140-217 12 0.84
3 Satt614 50 257-394 21 0.95
4 Satt354 50 179-247 9 0.76
5 Sat_151 50 215-272 9 0.81
6 Sat_255 50 232-328 28 0.94
7 Satt417 50 280-327 8 0.75
8 Sat_391 50 220-276 17 0.92
9 Satt308 50 132-175 12 0.90
10 Satt157 50 188-295 19 0.91
11 Satt534 50 148-212 17 0.89
12 Satt181 50 178-217 6 0.87
13 Satt160 50 199-270 12 0.88
14 Satt002 50 123-145 7 0.90
15 Satt030 50 129-170 10 0.84
16 Satt070 50 123-178 9 0.87
총계 204 13.81
평균 12.75 0.86
상기 표 3에서 살핀 바와 같이, 본 발명에서 활용된 16개 마커는 0.75 내지 0.95까지 높은 PIC 값을 나타내어 콩 품종을 충분히 식별할 수 있음을 알 수 있다. 특히, Satt216 프라이머 세트, Satt614 프라이머 세트, Sat_255 프라이머 세트, Sat_391 프라이머 세트, Satt308 프라이머 세트, Satt157 프라이머 세트, Satt534 프라이머 세트, Satt160 프라이머 세트, 및 Satt030 프라이머 세트로 이루어진 9개 마커는 0.84 내지 0.95까지의 높은 PIC 값을 나타내어 콩 품종을 충분히 식별할 수 있음을 알 수 있다.
또한 마커에 대해 대립 유전자의 크기에 따른 품종 밴드의 유무에 따라 NTSYS pc(version 2.10b)(Rohlf, 2000, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System-Version 2.10b. Applied Biostatistics Inc., New York.) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법(Sneath and Sokal 1973, Numerical taxonomy: The Principles and Practice of Numerical Classification, W. H. Freeman, San Francisco.)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973) 방법에 의해 집괴 분석하여 계통도(dendrogram)를 작성하였고 그 결과를 도 1a 내지 1d에 나타내었다. 도 1a 내지 1d에 따르면 본 발명의 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 148개 콩 품종의 식별을 가능하게 함을 알 수 있다.
실시예 2: 콩 품종 식별
(1) 본 발명의 마커를 이용한 품종 식별표 작성
국내에서 육성되는 148개 콩 품종 각각으로부터 게놈 DNA를 상기 실시예 1의 (2)의 방법에 따라 추출하였다. 본 발명의 16개 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시에 1의 (4)의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 결과물로부터 본 발명에 따른 마커에 대해 밴드의 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수 1로 코드화하고 밴드가 존재하지 않을 경우에는 0으로 코드화함으로써, 본 발명의 마커를 이용한 148개 콩 품종 각각에 대한 품종 식별표를 작성하였다. 그 결과를 도 2a 내지 2i 및 도 3a 내지 3p에 나타내었다. 본 발명의 마커에 따른 대립 유전자수에 따라 콩 품종 각각은 서로 다른 형태의 밴드 크기를 나타내었다. 예를 들어, 표 2에서 콩의 품종 연번 43인 ‘청자’ 품종은 분자 표지 Sat_255로 증폭할 경우 268 bp 크기의 대립 유전자 1개가 존재한다.
(2) 콩 품종 식별
품종을 식별하고자 하는 콩 종자 5립을 마쇄한 다음, NucleoSpin® PlantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA는 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 ㎕당 10 ng의 농도로 희석하였다.
본 발명의 16개 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 PCR로 증폭하고 전기영동 하였다. PCR 증폭 및 전기 영동은 상기 실시예 1에서 기술된 방법과 동일한 방법을 사용하였다. 각각의 전기영동 결과물에서 나타난 밴드의 유무를 도 3a 내지 3p의 결과와 비교하였다. 품종을 식별하고자 했던 콩은 ‘청자’ 품종의 밴드 유무와 동일한 밴드 형태를 나타내었으므로, ‘청자’ 품종으로 확인되었다.
<110> Korea Seed and Variety Service <120> A method for identifying soybean varieties using microsatellites markers <130> PN101801 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt184_F <400> 1 gcgctatgta gattatccaa attacgc 27 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt184_R <400> 2 gccacttact gttactcat 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt216_F <400> 3 tacccttaat caccggacaa 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt216_R <400> 4 agggaactaa cacatttaat catca 25 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt614_F <400> 5 ctccccttta acctttcctt tattag 26 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt614_R <400> 6 cgcggtagga attaattgta gataggat 28 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt354_F <400> 7 gcgaaaatgg acaccaaaag tagtta 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt354_R <400> 8 gcgatgcaca tcaattagaa tatacaa 27 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat_151_F <400> 9 gctgcatcag atcacccatc cttc 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat_151_R <400> 10 catgccatgt tgtatgtatg t 21 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat_255_F <400> 11 cggcatgtca tggtatacgt aactttaga 29 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat_255_R <400> 12 gcgcaactga agcaagaaaa gaaacct 27 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt417_F <400> 13 tcttgctaat tgcttcattt cat 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt417_R <400> 14 aattgcttgg gattttcatt t 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat_391_F <400> 15 gcgtaggcat cggtcaatat ttt 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat_391_R <400> 16 gcgttagcga gtggatcaag atca 24 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt308_F <400> 17 gcgttaaggt tggcagggtg gaagtg 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt308_R <400> 18 gcgcagcttt atacaaaaat caacaa 26 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt157_F <400> 19 gggctcactc tcgatagtag gtataaag 28 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt157_R <400> 20 gggataccaa aaggaataat tgtctt 26 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt534_F <400> 21 ctcctcctgc gcaacaacaa ta 22 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt534_R <400> 22 gggggatcta ggccatgac 19 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt181_F <400> 23 tggctagcag attgaca 17 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt181_R <400> 24 ggagcatagc tgttagga 18 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt160_F <400> 25 tcccacacag ttttcatata atata 25 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt160_R <400> 26 catcaaaagt ttataacgtg tagat 25 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt002_F <400> 27 tgtgggtaaa atagataaaa at 22 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt002_R <400> 28 tcattttgaa tcgttgaa 18 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt030_F <400> 29 aaaaagtgaa ccaagcc 17 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt030_R <400> 30 tcttaaatct tatgttgatg c 21 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt070_F <400> 31 taaaaattaa aatactagaa gacaac 26 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Satt070_R <400> 32 tggcattaga aaatgatatg 20

Claims (7)

  1. 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt216 프라이머 세트;
    서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt614 프라이머 세트;
    서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Sat_255 프라이머 세트;
    서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Sat_391 프라이머 세트;
    서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt308 프라이머 세트;
    서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt157 프라이머 세트;
    서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt534 프라이머 세트;
    서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt160 프라이머 세트; 및
    서열번호 29 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt030 프라이머 세트를 모두 포함하는, 콩 품종 식별용 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt184 프라이머 세트;
    서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt354 프라이머 세트;
    서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Sat_151 프라이머 세트;
    서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt417 프라이머 세트;
    서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt181 프라이머 세트;
    서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt002 프라이머 세트; 및
    서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 Satt070 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함하는 것인 콩 품종 식별용 프라이머 세트.
  3. 청구항 1 또는 2의 콩 품종 식별용 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함하는 콩 품종 식별용 키트.
  4. 콩으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 1 또는 2의 콩 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    얻어진 증폭 산물로부터 상기 콩의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 콩 품종을 식별하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 게놈 DNA는 상기 콩의 종자 또는 어린 식물체의 잎, 줄기 및 과실로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 콩 품종을 식별하는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 얻어진 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 콩 품종을 식별하는 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 얻어진 증폭 산물로부터 콩 품종을 결정하는 단계는 공지된 콩 품종에 대해 청구항 1 또는 2의 콩 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표시하고, 얻어진 증폭 산물과의 비교 분석에 의해 콩 품종을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 콩 품종을 식별하는 방법.
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Int. J. Mol. Sci., Vol. 13, No. 10, pp. 12608-12628 (2012.10.03.) *
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