KR101411890B1 - 초위성체 마커를 이용한 무 품종 식별 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국내에서 유통되고 있는 무 품종에 대하여 다형성을 나타내는 무 품종 식별용 초위성체 마커를 이용한 무 품종의 식별 방법 및 상기 초위성체 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 국내외에서 유통되고 있는 무 78개 품종에 대해 높은 다형성을 갖는 초위성체 마커의 조합을 선별하고 이를 이용하여 국내에서 육성된 무 품종을 식별할 수 있게 할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 무 품종 식별용 분자 표지는 국내에서 육성된 무 78개 품종을 식별할 수 있을 뿐만 아니라 모든 품종에 대하여 양친을 식별하는 이형접합성을 나타내는 마커가 있기 때문에 F1 종자의 순도 검정에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 농가와 종자 회사 또는 종자 회사와 종자 회사 간에 발생하는 종자 분쟁 발생시 이를 해결할 수 있는 중재 수단의 제공, 시중에서 유통되고 있는 무 품종의 진위성 규명, 품종 보호 출원시 대조 품종의 선정, 권리침해 여부의 사전 모니터링 및 F1 종자의 순도확인 등과 같은 여러 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

초위성체 마커를 이용한 무 품종 식별 방법{A Method for Identifying Radish Varieties using Microsatellites Markers}
본 발명은 국내외 종자 회사에서 육성된 무 품종에 대해 다형성을 나타내는 분자 표지인 초위성체 마커를 검출할 수 있는 프라이머 세트, 상기 마커를 이용한 무 품종의 식별 방법, F1 종자 순도 확인 방법 및 상기 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다.
국제 신품종 보호 연맹(UPOV)에서는 분자 마커의 활용과 테이터베이스 작성에 대한 표준화를 이루기 위해서 DNA 검정 방법, 활용 마커의 종류, DNA 분리 방법 등에 대한 가이드라인을 제시하고 있다. 이 가이드라인에 제시된 가장 주목할 점 중 하나가 반복 재현성이 떨어지고 데이터베이스화가 어려운 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)나 RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA) 분석 기술에 의해 도출된 결과는 인정하지 않고 있으며, 다른 DNA 검정법에 비해 다형성 및 재현성이 높은 SSR(Simple Sequence Repeat)이나 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 분석 방법의 활용을 제안하고 있다는 점이다.
실제로 스페인, 중국, 네덜란드, 및 일본에서는 벼, 옥수수, 고추, 가지, 체리, 복숭아, 토마토, 멜론 및 포도 등의 작물에 대하여 SSR 분석 기술을 이용한 품종별 DNA 프로파일을 데이터베이스화하여 품종보호 권리 침해와 자국 농산물의 보호 등과 같은 분야에 활용하고 있다.
한편, 우리나라도 종자시장에서 중요도가 높거나 분쟁의 발생 가능성이 높은 고추, 수박, 오이, 배추, 멜론, 참외 및 토마토 등과 같은 작물에 대하여 품종식별력이 높은 20~50개의 SSR 마커를 활용하여 작물당 100~300 품종에 대한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축하였거나 구축 중에 있다. 이러한 품종식별 분자표지 및 데이터베이스는 농가와 종자 회사 및 종자 회사간에 발생하는 종자 분쟁 발생시 이를 중재하기 위한 하나의 수단으로 적극 활용하고 있으며, 최근에는 수박, 참외, 오이, 배추 및 고추 품종보호출원 품종에 대하여 유전적 유사도가 높은 품종을 대조 품종으로 선정하는데 적극 활용하고 있다.
무는 우리나라 채소 작물 중 종자 수출 비중이 가장 큰 작물의 하나로 알려져 있으며 2011년 10월 현재 품종보호 등록된 69 품종과 생산 수입판매 신고된 1,309 품종이 국내 종자시장에서 유통되고 있다. 무에 대한 분자유전학적 연구는 2000년대 초에 시작되기 시작하여 캐나다에서는 RFLP 마커(Bett KE and Lydiate JL. 2003 Genome 46, 423-430), 일본에서는 AFLP 및 배추과 식물에서 유래된 SSR 마커를 이용한 무 유전자 지도 작성을 보고한 이래(Tsuro M, Suwabe K, Kubo N, Matsumoto S and Hirai M. 2005 Breeding Science 55, 107-111), 최근에는 EST(Expressed Sequence Tags)에서 유래된 630개 SSR 마커를 이용한 고밀도 유전자 지도가 작성될 정도로 크게 발전해 왔다(Shirasawa K, Oyama M, Hirakawa H, Sato S, Tabata S, Fujioka T, Kimizuka-Takagi C, Sasamoto S, Watanabe A, Kato M, Kishida Y, Kohara M, Takahashi C, Tsuruoka H, Wada T, Sakai T and Isobe S. 2011, DNA Research, 1-12).
무 유전자원 특성평가에 분자 마커 활용의 경우 연구초기에는 RAPD 마커의 활용이 대부분이었으나(Rabbani MA, Murakami Y, Kuginuki Y and Takayanagi K. 1998, Genetic Resources and Crop Evolution, 45:307-316), 근래에는 AFLP 분석 방법(Wang N, Kitamoto N, Ohsawa R and Fujimura T. 2008, Breeding Science 58, 107-112)과 극히 일부 연구자에 의해 무 EST에서 유래된 SSR 마커의 활용 가능성에 대한 연구(Wang N. Hu J, Ohsawa R, Ohta M and Fujimura T. 2007, Molecular Ecology Notes 7, 503-506)가 보고되고 있다.
국내의 경우 국립종자원에서 AFLP분석을 이용한 45개의 무 유통품종 식별체계를 구축하였으나(Kwon YS, Moon JY, Kwon YS, Park DY, Yoon HM, Song IH and Yi SI. 2003, Korean J. Breed 35 : 319-328) 마커의 활용시 반복 재현성의 문제, 품종별 데이터베이스의 구축이 단순하지 않아, SSR 마커에 의한 무 품종식별 체계의 확립이 필요한 것으로 나타났다.
이에 본 발명자는 국내에서 육성된 무 78개 품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 개발하여 이를 선별하고, 이들 초위성체 마커 세트를 프라이머로 이용하여 무 게놈 DNA를 증폭시킨 후 생성된 증폭 산물을 확인함으로써, 대립 유전자 패턴 및 다형정보지수(Polymorphic Information Content, PIC) 값을 살펴 보았을 때 상기 초위성체 마커가 무 품종 식별 방법에 적합함을 밝힘과 동시에 공시된 모든 무 품종에 양친을 식별할 수 있는 이형접합성을 가진 분자표지가 존재하는 것이 확인되어 이 마커 세트는 무 종자의 순도검정에 매우 유용하게 이용될 수 있는 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 종자 분쟁 발생시 품종 진위성에 대한 과학적 검증, 품종 보호 출원시 대조 품종 선정, 종자 유통 관리 및 F1 종자의 품질관리 등 다양한 방면에 실용적으로 활용될 수 있을 것이다.
Kwon YS, Moon JY, Kwon YS, Park DY, Yoon HM, Song IH and Yi SI. 2003, Korean J. Breed 35 : 319-328 Tsuro M, Suwabe K, Kubo N, Matsumoto S and Hirai M. 2005 Breeding Science 55, 107-111
본 발명의 목적은 우리나라 종자 시장에서 판매되고 있는 무 78개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 초위성체 마커를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 이용하는 무 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 종자 회사에서 육종된 무 품종에 대한 유전적 유사도를 DNA 수준에서 예측 가능하게 함으로써 이를 품종 보호 출원시 대조품종 선정에 직접 활용할 수 있게 하는 무 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 무 품종에 대한 진위성 검정에 분자생물학적 기술을 접목하여 종자 시장에서 판매되는 무 품종의 진위성 여부를 실험실 수준에서 판단함으로써, 불량 종자의 유통을 근절하는데 크게 기여할 수 있고, 농가와 종자 회사, 육묘업체와 농가 또는 종자 회사와 종자 회사간에 발생하는 품종 진위성과 관련된 종자 분쟁 해결에 매우 유용하게 이용될 수 있는, 무 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 무 품종 식별에 활용된 분자 표지 중에서 품종에 따라 2개의 대립유전자를 나타내는 것은 품종 육성시 교배된 양친의 유전자형을 나타내는 것이기 때문에, F1 품종에 대해 양친의 교배 여부를 DNA 수준에서 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내외에서 유통되고 있는 무 품종에 대하여 다형성을 나타내는 마커를 식별할 수 있는 프라이머 세트(서열번호 1 내지 54)를 포함하는, 무 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 무로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 서열번호 54 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물로부터 상기 무의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 무 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 무로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 서열번호 54 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 상기 증폭 산물에서 품종 특이적인 대립유전자를 가지면서 그 개수가 2개로 나타난 프라이머 세트를 선별하는 단계; 순도를 검정하고자 하는 무의 일대 잡종(F1) 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물이 상기 품종 특이적인 대립 유전자의 크기를 가지면서 대립 유전자의 수가 2개로 나타난 상기 무의 일세대 잡종(F1) 품종은 순종인 것으로 판별하는 단계를 포함하는 무 F1 품종의 순도를 검정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 54 중 하나 이상의 프라이머 세트 또는 모든 프라이머 세트를 포함하는 무 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 54 중 하나 이상의 프라이머 세트 또는 모든 프라이머 세트를 포함하는 무 일세대 잡종(F1) 품종의 순도를 검정하기 위한 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 국내 종자 시장에서 유통되고 있는 무 품종에 대하여 다형성을 나타내는 마커를 식별하기 위한 프라이머 세트(서열번호 1 내지 54)를 제공한다.
상기 마커는 국내에서 유통되고 있는 무 78개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커로서, 국내에서 유통되고 있는 무 품종을 특이적으로 식별할 수 있다. 본 발명의 마커는 국내 종자 회사에서 육성되어 판매되고 있는 무 78개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 SSR 마커이다. 구체적으로, 본 발명의 마커는 하기 표 2에 기재된 무 78개 품종에 대하여 높은 다형성을 나타내었다.
본 발명의 프라이머 세트는 예를 들면, 하기 표 1에 기재된 염기 서열(서열번호 1 내지 54)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 식별할 수 있는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 무 품종 식별에 사용된 마커
서열
번호		 초위성체
표지인자		 프라이머의 염기서열 (5' -> 3') 형광염색
1 RS012
　		 정방향 : CGCAGAAAACGGGAATCAG FAM
2 역방향 : CAGTGGACCCAGTCTTGCAT
3 RS028
　		 정방향 : GGCATCGGAAAAGTGAGGTT VIC
4 역방향 : TGATCATTACGGGGTTGACG
5 RS068
　		 정방향 : AGAGAGAACCCGGAATCGAA NED
6 역방향 : CGATGACGTGGTCTTTGGTC
7 RS071
　		 정방향 : CCACCCTTCACTGCTTACGA PET
8 역방향 : TGAGGCCCCAATGATAGTGA
9 RS086
　		 정방향 : AGAAAGATCCCTTCTCGCCA FAM
10 역방향 : TCGCAAAGTGCTACACCACA
11 RS107
　		 정방향 : AGAGAGAACCCGGAATCGAA NED
12 역방향 : TGACGTGGTCCTTGGTCTTG
13 RS110
　		 정방향 : GGCATCGGAAAAGTGAGGTT PET
14 역방향 : TGATCATTACGGGGTTGACG
15 RS118
　		 정방향 : TGGGAAGAAGCCTCAGGAAT FAM
16 역방향 : CGGTCACTTTTGTTGCCTTC
17 RS119
　		 정방향 : CGCAAGAAGAAGCAGGTACG VIC
18 역방향 : AAATCCTCCGTCGCATCTCT
19 RS122
　		 정방향 : AGAACGCCTCGAAGAAGAGG NED
20　 역방향 : TCGTCTCTAATCTCAACACCTGC
21 RS124
 정방향 : TTTAACTCATTCCCCCTCCAA FAM
22　 역방향 : GTTTCTAGGGTTTCGCTGGG
23 RS125
 정방향 : GAGGAAGAAGGACGAAACGG VIC
24 역방향 : GCACGAATCCATCGTCTCAC
25 RS131
 정방향 : AGTGGGTGTTGGAAGGGAAG NED
26 역방향 : GGAAATTCCTGGTTTGGTGAA
27 RS133
 정방향 : AAGCAGGCAATGCTTGAAGA PET
28 역방향 : AAGGCAGACGATTAGGAGGG
29 RS135
 정방향 : TCCACACACGCCTGAGAAGT FAM
30 역방향 : CTCGAGGAATCCTGCAAACC
31 RS139
 정방향 : CTTCACCTCGCAAAATCAATG VIC
32 역방향 : GCATCCAGTTCATCCTCCCT
33 RS150
 정방향 : GCTGCTACTGAGTTGCGTCC NED
34 역방향 : GCGCATAACCGAAAGCCTAT
35 RS163
 정방향 : GAACCTCCACTAGCCTTCGG PET
36 역방향 : AATTGCCAGGTGTTGCATGT
37 RS177
 정방향 : CCAATTCCCCACATAGGCTT FAM
38 역방향 : CACTTCTTCAAGACGCCGAA
39 RS188
 정방향 : GGTCAAACCTTTTTCCCCAA VIC
40 역방향 : CAACGGAAGACATCTCTCGCTA
41 RS191
 정방향 : TGGTTGATGGGATTCAAGGA NED
42 역방향 : TCAAAAAGAGCAATGTGGGG
43 RS194 정방향 : TTTAACTCATTCCCCCTCCAA PET
44 역방향 : GTTTCTAGGGTTTCGCTGGG
45 RS196
 정방향 : AGAAGCGGAAGCAGTCCAAT FAM
46 역방향 : CGTTGTGCCAGTTCATCACA
47 RS207
 정방향 : CTCCGACCTCCTTGATCCAT NED
48 역방향 : TTGATTCCGTCCCTCAAACA
49 RS208
 정방향 : AGTACCACACGCAAACCTCG PET
50 역방향 : GGATCCTGCTCATTTCAAGAGA
51 RS216
 정방향 : GGTCAAACCTTTTTCCCCAA FAM
52 역방향 : CAACGGAAGACATCTCTCGCTA
53 RS231
 정방향 : ACGACCACTTCACGAAACGA VIC
54 역방향 : GAACAGAAACAGTGGGCGTG
또한, 본 발명은 무로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 서열번호 54 중 하나 이상의 프라이머 세트 또는 모든 프라이머 세트내의 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물로부터 상기 무의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 무 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 무 품종 식별 방법에서 무로부터 유래된 게놈 DNA는 무의 종자와 식물체 전체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 무로부터 유래된 게놈 DNA는 무의 종자 또는 무의 잎, 줄기 또는 뿌리로부터 유래될 수 있고, 특히 종자를 파종하고 출아한 후의 무의 어린 식물체의 잎으로부터 채취될 수 있다.
본 발명의 무 품종 식별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR 반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 무로부터 유래된 게놈 DNA, 표 1의 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충 용액(buffer) 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 또한, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 증폭된 산물로부터 무 품종을 식별하는 단계는 자동 염기 서열 분석기를 이용하여 대립 유전자(밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램에 의해 확인한 다음 각각의 품종을 식별할 수 있다. 구체적으로는, 각각의 무 품종에 대하여 본 발명의 마커에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성하고 상기 증폭된 산물과의 비교 분석을 통해 무 품종을 식별할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 마커를 이용하여 각각의 무 품종으로부터 나온 대립 유전자의 크기를 미리 하나의 표로 정리한 다음 대립 유전자의 존재 유무를 밝혀 대립 유전자가 존재할 때에는 "1"로 나타내고 대립 유전자가 존재하지 않을 때에는 "0"으로 나타낸다. 따라서, 품종을 식별하고자 하는 무로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 마커를 이용하여 증폭하고, 증폭된 산물의 크기를 분석한 다음 통계 프로그램을 통하여 무 품종의 식별 여부를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 무 F1 품종의 순도를 검정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 무로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 54 중 하나 이상의 무 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계;
상기 증폭 산물에서 품종 특이적인 대립 유전자를 나타내며 대립 유전자의 개수가 2개로 나타난 프라이머 세트를 선별하는 단계;
순도를 검정하고자 하는 무 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물이 상기 품종 특이적인 대립 유전자의 크기를 가지면서 대립 유전자의 수가 2개로 나타난 상기 무의 F1 품종은 순종인 것으로 판별하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 무로부터 유래된 게놈 DNA는 무의 종자 및 무의 식물 전체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 상기 얻은 무로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 54 중 하나 이상의 무 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭 산물의 유무를 표로 작성한다. 예를 들면, 하기 표 2에서 기재된 국내외 무 78개 품종으로부터 DNA를 채취하고, 무 품종 식별용 프라이머 세트를 사용하여 증폭함으로써, 도 2a-도 2c에서 도시된 바와 같은 증폭 산물의 유무를 표로 작성한다. 예를 들어, 도 2a-도 2c에 따르면, '슈퍼길조' 품종(도 2a-2c 13번 품종)은 RS028 프라이머 세트에 대해서는 2개의 대립 유전자가 존재하고, RS068 프라이머 세트에 대해서도 2개의 대립 유전자가 존재한다. 상기 표에서 각각의 무 품종에 대하여 특이적인 대립유전자를 가지면서 그 개수가 2개로 나타나게 하는 프라이머 세트, 즉 공우성(co-dominance)인 프라이머 세트를 선별한다. 예를 들어, '슈퍼길조' 품종(도 2a-2c에서 13번 품종)에 대해서 마커 RS012와 RS133은 대립 유전자를 나타내는 밴드가 1개만 나타나서 양친을 구별할 수 없으므로, '슈퍼길조' 품종의 순도를 검정할 수 있는 마커로 사용할 수 없다. 그러나, '슈퍼길조' 품종에 대해서 마커 RS028, RS068 등은 특이적인 대립유전자 크기를 나타내며 그 개수가 2개로 나타났다. 이들 마커는 '슈퍼길조' 품종의 양친을 식별할 수 있어 '슈퍼길조' 품종의 순도를 검정할 수 있는 마커로 사용될 수 있다.
순도를 검정하고자 하는 무의 F1 품종의 게놈 DNA를 추출한다. 상기 게놈 DNA를 추출하는 방법은 상기 무로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법과 동일한 방법으로 실시한다.
순도를 검정하고자 하는 무의 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭한다.
상기 증폭 산물에서 대립 유전자의 크기가 품종 특이적이고 그 개수가 2개로 나타나면, 상기 무의 F1 품종은 양친간의 정상적인 교배가 이루어진 순종인 것으로 검정된다. 상기 증폭 산물에서 대립 유전자의 수가 1개로 나타나면, 상기 무의 F1 품종은 양친간의 교배가 되지 않은 것으로 판단한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 54 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 무 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함한다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기 영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 54 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 무 일대 잡종 (F1) 품종의 순도를 검정하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함한다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기 영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 무 품종 식별용 마커만을 식별할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 국내외 종자 시장에서 판매되고 있는 주요 무 품종 78개를 식별할 수 있다. 따라서, 무 품종의 진위성 규명을 통한 종자 유통관리, 품종 보호 침해 여부의 사전 모니터링 및 침해 여부 확인, 품종 보호 출원시 대조 품종의 선정, F1 종자 생산시 순도확인 등과 같은 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 마커에 의해 분석된 각 무 품종을 코드화하고 NTSYSPC 컴퓨터 프로그램을 활용하여 무 품종 식별 및 품종별 유전적 유사도를 나타낸 것이다.
도 2는 국내에서 육성되는 78개 무 품종을 대상으로 본 발명의 27개의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였을 때 대립 유전자의 크기(bp)에 따라 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고, 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 하기 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 무 품종 식별을 위한 마커의 평가
<1-1> 무 시료
본 발명에서는 하기 표 2에 기재된 무 78개 품종을 무 품종 식별용 프라이머 세트의 선별 및 무 품종 식별 가능성 검정을 위해 사용하였다.
품종 식별용 무 78개 품종
연
번		 품종명 육성회사 연
번		 품종명 육성회사 연
번		 품종명 육성회사
1 가을일품 KS 27 싱싱 NH 53 YR무타리열 농우
2 옥석 KS 28 청일품 몬산토 54 YR강한열 농우
3 청풍명월 제일 29 평정 농우 55 SA13 동부
4 청산골드 NH 30 YR행운 농우 56 청왕 농우
5 강호 NH 31 길조 농우 57 R67 신젠타
6 청일 NH 32 청대봄 농우 58 R64 신젠타
7 청단 삼성 33 장형봄 몬산토 59 R63 신젠타
8 고향산천 삼성 34 새로운대형봄 농우 60 조청 동부
9 만추대청 삼성 35 청복 몬산토 61 청정고원 농우
10 청동봄 고농 36 장원 신젠타 62 진광 현대
11 슈퍼토광무 동부 37 백봉 몬산토 63 청해 사카타
12 대들보 농우 38 평지여름 농촌진흥청 64 청운플러스 몬산토
13 슈퍼길조 농우 39 태청 신젠타 65 대지월동 몬산토
14 청황 농우 40 서동 몬산토 66 맛추임봄 몬산토
15 관동여름 몬산토 41 청치미 농우 67 슈퍼모델 몬산토
16 백신 코레곤 42 여름달랑 농우 68 신만복열 사카타
17 여가무 코레곤 43 은봉 권농 69 장녹수단무지 몬산토
18 강성무 코레곤 44 금봉 권농 70 새하얀봄단무지 권농
19 개량한백옥 제일 45 하우스초롱 동부 71 올백봄단무지 권농
20 한국대근 제일 46 기찬 농우 72 새봉 권농
21 샐러드 농우 47 S50140 신젠타 73 삼복다발 농우
22 길동 농우 48 서광다발 농우 74 YR흑보석열 농우
23 장군 사카타 49 소춘 농우 75 에이스봄 농우
24 호평 농우 50 햇살알타리 동부 76 늘푸른봄 몬산토
25 알070 농우 51 흑광열 진흥 77 환상 농우
26 청태 몬산토 52 YR흑기사열 농우 78 신세계 사카타
<1-2> 게놈 DNA의 추출
상기 표 2에 기재된 공시된 무 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하고 3주일 경과 후, 연한 부위의 유엽을 채취하여 게놈 DNA의 분리 재료로 이용하였다. 채취한 무의 유엽이 보관되어 있는 2 ml 튜브에 텅스텐 구슬 3개를 넣고 액체 질소(-196℃)를 이용하여 급속 동결시킨 다음 볼텍싱(Vortexing) 과정을 반복하면서 조직을 고르게 마쇄하였다. 충분히 마쇄된 조직은 NucleoSpin®lantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA는 1.0 % 아가로스 겔에서 전기영동 하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 ㎕당 10 ng의 농도로 희석한 다음 이를 PCR 분석에 이용하였다.
<1-3> 무 SSR-enriched library 제작
SSR 마커 개발을 위하여 '태청' 품종을 공시품종으로 선정하여 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA 10 ㎍을 AluI과 XmnI을 이용하여 4시간 동안 37 ℃에서 digestion 하였다. 절단된 DNA에 아래 표 3과 같은 염기서열을 가진 아답터(adaptor)를 16℃ 30분, 37℃ 10분씩 15 사이클로 PCR을 이용하여 ligation 시켰다.
아답터의 염기서열
SNX forward 5' CTAAGGCCTTGCTAGCAGAAGC 서열번호 55
SNA reverse 3' AAAAGATTCCGGAACGATCGTCTTCGp 서열번호 56
아답터가 ligation된 DNA는 biotin-표지된 올리고 반복서열(oligo repeat)[(CA)10,(CT)10]들과 혼성화 시켰다. 혼성화을 통하여 형성된 DNA와 biotin-표지된 올리고 복합체는 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합되어 있는 자성 비드(magnetic beads)와 혼합하여 biotin-스트렙타비딘 결합이 생성되도록 반응을 수행하였다. 이 방법을 통하여 반복서열을 소유하는 DNA-올리고 복합체를 순수 분리하였다. 그리고 이 분리된 복합체는 아래의 조건과 같은 PCR 반응을 거쳐 DNA의 양을 증폭시켰다(표 4).
PCR 반응액의 조성 및 반응 조건
PCR 반응액의 조성 반응 조건
Elute DNA: 10 ㎕ 95 ℃: 5 분
10% Buffer: 5 ㎕ 59 ℃ : 1 분
2.5mM dNTP: 5 ㎕ 72 ℃ : 2 분
10 pmole SNX forward: 4 ㎕ 95 ℃ : 45 초
Ex-Taq: 0.4 ㎕ 72 ℃ : 10 분
D.W.:25.6 ㎕
Total: 50 ㎕ *첫번째 내지 세번째 단계를 40-45회 반복
증폭된 반복서열을 가지는 DNA는 TA-클로닝 벡터(cloning vector)에 클로닝되어 DH5 E.coli cell에 형질전환시켰다. 항생제를 함유한 LB배지에서 자란 콜로니들은 아답터 서열과 일치하는 프라이머를 이용하여 PCR 반응하고 삽입물(insert)를 소유하는지 여부는 전기영동하여 확인하였다. 0.4 kb 보다 큰 insert 를 가지는 콜로니들은 LB-amp 액체 배지에 배양한 후, plasmid mini-prep kit (Intron, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 Perkin-Elmer 의 PCR sequencing kit를 이용하여 반응시킨 후, ABI310 Genetic Analyzer를 이용하여 시퀀싱하여 반복서열을 가진 시퀀싱을 확보한 다음 Primer3 프로그램을 이용하여 SSR 프라이머를 제작하였다.
<1-4> 품종식별용 SSR 프라이머 선발
무 품종식별에 효율적인 분자표지를 선발하기 위하여 '수퍼길조', '탐스런', '춘왕', '태청', '서동', '하우스초롱', '햇살알타리', '만경알타리', 'YR무타리열', 'YR백춘' 품종의 DNA를 enrich-library에서 유래된 237개 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음 모세관 전기영동 장치(HDA-GT12TM System, eGEnE, Inc.)와 컴퓨터 프로그램 (Biocalculator2.0, eGEnE, Inc.)을 활용하여 각 시료별 대립 유전자의 차이를 분석한 다음 밴드의 패턴이 깨끗하며 다형성 정도가 높은 마커 27개를 선정하였다. 이들 27개 마커의 분자 표지에 대해 자동 염기 서열 분석기를 통한 정밀 분석을 추진하기 위하여, 정방향 프라이머가 형광 발생 물질 FAM, VIC, NED 및 PET 중 하나로 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 제작하였다.
<1-5> PCR 증폭 및 전기 영동
상기 준비된 게놈 DNA와 상기 제작된 마커를 재료로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 상기 제조된 무 게놈 DNA 20 ng, 0.1 μM의 상기 마커, 2.0 ㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq 폴리머라제 1U(Takara CAT. RR011A), 2.5 ㎕의 10 x PCR 버퍼(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl2)를 증류수에 첨가하여 전체 부피를 25 ㎕로 조절하였다. PCR(C1000, BioRad, 미국) 증폭은 94℃에서 5분 동안 게놈 DNA를 충분히 변성시킨 다음, 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 55℃에서 30초, 그리고 신장을 72℃에서 45초간 40회 반복 수행하였다. PCR 산물의 최종 신장을 위하여 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 각각의 프라이머 세트에 대한 어닐링 온도는 하기 표 5에 나타내었다.
PCR이 완료된 후, 2.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인하였다. 증폭된 시료들은 다음 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다. PCR에 증폭된 시료들은 초순수 150㎕에 적정 농도로 희석한 다음, 희석된 3 ㎕의 PCR 산물을 탈이온된 포름아마이드(deionized formamide) 10㎕, 대립유전자 크기를 측정하는 사이즈 마커(Size marker)(LIZ500 size standard) 0.25㎕를 잘 혼합하여 섞은 다음 94℃에서 2분간 변성시켰다. 변성시킨 유전자 증폭 산물은 자동 염기 서열 분석장치(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystem)를 활용하여 전기 영동하였다. 각 품종별 초위성체 분자 표지에 대한 대립유전자 크기는 GeneMapper3.7 컴퓨터 프로그램(Applied Biosystem)을 이용하여 정확하게 측정하였다.
<1-6> 본 발명에 따른 마커의 무 품종 식별 가능성 검정
상기에서 자동염기서열분석기로 확인한 대립유전자 크기를 이용하여 본 발명에 따른 마커의 무 품종 식별 가능성을 조사하였다. 하기 화학식 1을 사용하여 다형정보지수(PIC)값을 산출하였다. 하기 식에서 Pij는 마커 i의 밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다(Anderson et al., 1993, Genome 36: 181-186).
Figure 112012034567169-pat00001
그 결과, 각 마커에 따른 어닐링 온도(℃), 증폭 산물의 크기(bp), 대립 유전자의 수 및 PIC 값을 하기 표 5에 나타내었다.
마커의 특징
연번 SSR
마커명		 어닐링
온도(℃)		 대립유전자
크기(bp)		 대립
유전자의 수		 PIC값
1 RS012 55 272-315 12 0.869
2 RS028 55 208-238 12 0.823
3 RS068 55 317-344 8 0.869
4 RS071 55 204-237 7 0.854
5 RS086 55 139-168 9 0.857
6 RS107 55 314-341 9 0.883
7 RS110 55 210-240 11 0.822
8 RS118 55 148-167 4 0.729
9 RS119 55 182-193 5 0.828
10 RS122 55 270-275 2 0.500
11 RS124 55 180-194 6 0.836
12 RS125 55 275-282 3 0.557
13 RS131 55 278-289 4 0.720
14 RS133 55 281-297 4 0.701
15 RS135 55 161-200 3 0.522
16 RS139 55 162-201 4 0.530
17 RS150 55 160-171 2 0.499
18 RS163 55 286-306 6 0.677
19 RS177 55 186-200 4 0.667
20 RS188 55 126-142 5 0.755
21 RS191 55 272-280 6 0.857
22 RS194 55 182-196 6 0.836
23 RS196 55 156-195 9 0.904
24 RS207 55 119-135 4 0.687
25 RS208 55 196-212 4 0.702
26 RS216 55 125-141 5 0.755
27 RS231 55 118-134 3 0.563
계 157.00 15.36
평균 5.81 0.731
상기 표 5에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 활용된 마커 중 6개(RS122, RS125, RS135, RS139, RS150, RS231)는 0.60보다 낮은 PIC 값을 나타내었고, 나머지 21개는 0.667~0.904까지 높은 PIC 값을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 마커는 무 품종을 충분히 식별 가능하게 할 수 있음을 알 수 있다.
또한 마커에 대해 대립 유전자의 크기에 따른 품종 밴드의 유무에 따라 NTSYS pc(version 2.10b)(Rohlf, 2000, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System-Version 2.10b. Applied Biostatistics Inc., New York.) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법(Sneath and Sokal 1973, Numerical taxonomy : The Principles and Practice of Numerical Classification, W. H. Freeman, San Francisco.)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973)에 의해 집괴 분석하여 계통도(dendrogram)를 작성하였고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 따르면 본 발명의 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 78개 무 품종의 식별이 가능하게 함을 알 수 있다.
<실시예 2> 무 품종 식별
<2-1> 본 발명의 마커를 이용한 품종 식별표 작성
국내에서 육성되는 78개 무 품종 각각으로부터 게놈 DNA를 상기 실시예 <1-2>의 방법에 따라 추출하였다. 본 발명의 27개 마커를 프라이머 세트로 이용하여 상기 실시에 <1-5>의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 결과물로부터 본 발명에 따른 마커에 대해 밴드의 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수 1로 코드화하고 밴드가 존재하지 않을 경우에는 0으로 코드화함으로써, 본 발명의 마커를 이용한 78개 무 품종 각각에 대한 품종 식별표를 작성하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 마커에 따른 대립 유전자수에 따라 무 품종 각각은 서로 다른 형태의 밴드 크기를 나타내었다. 예를 들어, 표 2에서 무의 품종 연번 13인 '슈퍼길조' 품종은 분자 표지 RS012로 증폭할 경우 279 bp 크기의 1개 대립 유전자가 존재한다.
<2-2> 무 품종 식별
품종을 식별하고자 하는 무의 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하고 3주일 경과 후, 연한 부위의 유엽을 채취하여 게놈 DNA의 분리 재료로 이용하였다. 채취한 무의 유엽이 보관되어 있는 2 ml 튜브에 텅스텐 구슬 3개를 넣고 액체 질소(-196℃)를 이용하여 급속 동결시킨 다음 볼텍싱(Vortexing) 과정을 반복하면서 조직을 고르게 마쇄하였다. 충분히 마쇄된 조직은 NucleoSpin®PlantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA는 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 ㎕당 10 ng의 농도로 희석하였다.
본 발명의 27개 마커 각각을 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 PCR로 증폭하고 전기영동하였다. PCR 증폭 및 전기 영동은 상기 실시예 1에서 기술된 방법과 동일한 방법을 사용하였다. 각각의 전기영동 결과물에서 나타난 밴드의 유무를 도 2의 결과와 비교하였다. 품종을 식별하고자 했던 무는 '슈퍼길조' 품종의 밴드 유무와 동일한 밴드 형태를 나타내었으므로, '슈퍼길조' 품종으로 확인되었다.
<실시예 3> 무 F1 종자 순도 검정용 마커의 선별
무 78개 품종에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에 따라 품종 식별표를 작성하였다(도 2a-2c 참조). 무 78개 품종 중 '슈퍼길조' 품종에 대한 종자를 마쇄한 다음 상기 실시예 2의 (2)와 동일한 방법으로 DNA를 분리하였다. 상기 분리한 DNA에 대해서 표 3에 기재된 27개의 프라이머로 사용하여 증폭한 후 대립 유전자의 크기와 수를 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 의하면, 마커 RS012, RS118, RS122, RS133, RS135, RS139, RS163, RS188, RS207, RS208, RS216, RS231은 1개의 대립유전자만을 나타내어 양친을 구분하지 못하므로 F1 종자의 순도 검정에는 사용할 수 없다. 또한, RS177과 RS196은 3개의 대립유전자 수를 나타내는 복잡한 양상을 보여 이를 순도검정에 활용하는 데는 적합하지 않은 것으로 판단되었다.
그러나, 마커 RS28, RS68, RS71, RS86, RS107, RS110, RS119, RS124, RS125, RS131, RS150, RS191, RS194는 품종 특이적인 대립 유전자 2개가 뚜렷하게 구분되는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 마커는 무 '슈퍼길조' 품종의 양친을 식별할 수 있어, F1 품종이 양친의 정상적인 교배로 생성되었음을 판단하기 위한 마커로 사용될 수 있다.
<실시예 4> 무 F1 종자의 순도 검정
순도를 검정하고자 하는 '슈퍼길조' 품종의 종자에 대해 상기 실시예 2의 (2)에서 기재된 바에 따라 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA에 대해서 마커 RS28, RS68, RS71, RS86, RS107, RS110, RS119, RS124, RS125, RS131, RS150, RS191, RS194 마커를 프라이머로 사용하여 증폭하였다. 증폭 조건은 상기 실시예 <1-5>에서 기재된 바와 동일하게 실시하였다. 그 결과 품종에 특이적인 대립 유전자의 개수가 2개가 나타났다. 따라서 실험한 '수퍼길조' F1 품종의 종자는 양친의 정상적인 교배로부터 생성된 종자임을 확인할 수 있었다.
<110> Korea Seed & Variety Service <120> A Method for Identifying Radish Varieties using Microsatellites Markers <130> PN096787 <160> 56 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS012 <400> 1 cgcagaaaac gggaatcag 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS012 <400> 2 cagtggaccc agtcttgcat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS028 <400> 3 ggcatcggaa aagtgaggtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS028 <400> 4 tgatcattac ggggttgacg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS068 <400> 5 agagagaacc cggaatcgaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS068 <400> 6 cgatgacgtg gtctttggtc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS071 <400> 7 ccacccttca ctgcttacga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS071 <400> 8 tgaggcccca atgatagtga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS086 <400> 9 agaaagatcc cttctcgcca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS086 <400> 10 tcgcaaagtg ctacaccaca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS107 <400> 11 agagagaacc cggaatcgaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS107 <400> 12 tgacgtggtc cttggtcttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS110 <400> 13 ggcatcggaa aagtgaggtt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS110 <400> 14 tgatcattac ggggttgacg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS118 <400> 15 tgggaagaag cctcaggaat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS118 <400> 16 cggtcacttt tgttgccttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS119 <400> 17 cgcaagaaga agcaggtacg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS119 <400> 18 aaatcctccg tcgcatctct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS122 <400> 19 agaacgcctc gaagaagagg 20 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS122 <400> 20 tcgtctctaa tctcaacacc tgc 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS124 <400> 21 tttaactcat tccccctcca a 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS124 <400> 22 gtttctaggg tttcgctggg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS125 <400> 23 gaggaagaag gacgaaacgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS125 <400> 24 gcacgaatcc atcgtctcac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS131 <400> 25 agtgggtgtt ggaagggaag 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS131 <400> 26 ggaaattcct ggtttggtga a 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS133 <400> 27 aagcaggcaa tgcttgaaga 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS133 <400> 28 aaggcagacg attaggaggg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS135 <400> 29 tccacacacg cctgagaagt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS135 <400> 30 ctcgaggaat cctgcaaacc 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS139 <400> 31 cttcacctcg caaaatcaat g 21 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS139 <400> 32 gcatccagtt catcctccct 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS150 <400> 33 gctgctactg agttgcgtcc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS150 <400> 34 gcgcataacc gaaagcctat 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS163 <400> 35 gaacctccac tagccttcgg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS163 <400> 36 aattgccagg tgttgcatgt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS177 <400> 37 ccaattcccc acataggctt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS177 <400> 38 cacttcttca agacgccgaa 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS188 <400> 39 ggtcaaacct ttttccccaa 20 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS188 <400> 40 caacggaaga catctctcgc ta 22 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS191 <400> 41 tggttgatgg gattcaagga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS191 <400> 42 tcaaaaagag caatgtgggg 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS194 <400> 43 tttaactcat tccccctcca a 21 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS194 <400> 44 gtttctaggg tttcgctggg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS196 <400> 45 agaagcggaa gcagtccaat 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS196 <400> 46 cgttgtgcca gttcatcaca 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS207 <400> 47 ctccgacctc cttgatccat 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS207 <400> 48 ttgattccgt ccctcaaaca 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS208 <400> 49 agtaccacac gcaaacctcg 20 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS208 <400> 50 ggatcctgct catttcaaga ga 22 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS216 <400> 51 ggtcaaacct ttttccccaa 20 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS216 <400> 52 caacggaaga catctctcgc ta 22 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to amplify RS231 <400> 53 acgaccactt cacgaaacga 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify RS231 <400> 54 gaacagaaac agtgggcgtg 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer to amplify SNX <400> 55 ctaaggcctt gctagcagaa gc 22 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer to amplify SNX <400> 56 aaaagattcc ggaacgatcg tcttcg 26

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS012 프라이머 세트;
    서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS028 프라이머 세트;
    서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS068 프라이머 세트;
    서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS071 프라이머 세트;
    서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS086 프라이머 세트;
    서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS107 프라이머 세트;
    서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS110 프라이머 세트;
    서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS118 프라이머 세트;
    서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS119 프라이머 세트;
    서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS122 프라이머 세트;
    서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS124 프라이머 세트;
    서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS125 프라이머 세트;
    서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS131 프라이머 세트;
    서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS133 프라이머 세트;
    서열번호 29 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS135 프라이머 세트;
    서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS139 프라이머 세트;
    서열번호 33 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS150 프라이머 세트;
    서열번호 35 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS163 프라이머 세트;
    서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS177 프라이머 세트;
    서열번호 39 및 서열번호 40의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS188 프라이머 세트;
    서열번호 41 및 서열번호 42의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS191 프라이머 세트;
    서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS194 프라이머 세트;
    서열번호 45 및 서열번호 46의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS196 프라이머 세트;
    서열번호 47 및 서열번호 48의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS207 프라이머 세트;
    서열번호 49 및 서열번호 50의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS208 프라이머 세트;
    서열번호 51 및 서열번호 52의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS216 프라이머 세트; 및
    서열번호 53 및 서열번호 54의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 RS231 프라이머 세트로 구성되는 모든 프라이머 세트를 포함하는, 무 품종 식별용 프라이머 세트.
  2. 무로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 무 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물로부터 상기 무의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 무 품종을 식별하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 상기 무의 종자 또는 어린 식물체의 잎, 줄기 및 과실로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 무 품종을 식별하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 증폭 산물로부터 무 품종을 식별하는 단계는
    1) 각각의 무 품종에 대해 제1항의 무 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성하는 대조표 작성 단계;
    2) 샘플을 제1항의 무 품종 식별용 프라이머 세트로 증폭시키는 증폭 단계; 및
    3) 상기 증폭 단계에서 증폭된 결과를 상기 대조표 작성 단계에서 작성된 대조표와 비교하여 무 품종을 식별하는 단계를 포함하는 무 품종을 식별하는 방법.
  6. 1) 무로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 54의 무 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계;
    2) 상기 증폭 산물에서 품종 특이적인 대립 유전자를 나타내며 대립 유전자의 개수가 2개로 나타난 프라이머 세트를 선별하는 단계;
    3) 순도를 검정하고자 하는 무의 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물이 상기 품종 특이적인 대립 유전자의 크기를 가지면서 대립 유전자의 수가 2개로 나타난 상기 무의 F1 품종은 순종인 것으로 판별하는 단계를 포함하는, 무 일대 잡종(F1) 품종의 순도를 검정하는 방법.
  7. 제1항의 무 품종 식별용 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액(buffer)을 포함하는 무 품종 식별용 키트.
  8. 제1항의 무 품종 식별용 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함하는 무 일대 잡종(F1) 품종의 순도 검정용 키트.
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