CN112391488A - 一种用于鉴定青花菜品种浙青80的snp标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定青花菜品种‘浙青80’的SNP标记，所述SNP标记分别在青花菜HDEM参考基因组C8染色体第388951位置的碱基为G或A，在青花菜HDEM参考基因组C8染色体第32131581位置的碱基为G或C，在青花菜HDEM参考基因组8染色体第35830426位置的碱基为T或C。还提供了用于检测所述SNP标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～9所示。本发明SNP标记及其引物可基于KASP技术体系对‘浙青80’杂交种纯度进行鉴定，结果稳定、准确，可高通量鉴定‘浙青80’种子的纯度和真实性。

Description

一种用于鉴定青花菜品种浙青80的SNP标记
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，设计一种用于鉴定青花菜品种‘浙青80’的SNP标记，具体为一种基于KASP技术开发的用于青花菜品种‘浙青80’纯度或真实性鉴定的SNP标记。
背景技术
青花菜(Brassica oleracea L.var.italica)，又名西兰花、绿菜花、绿色花椰菜，起源于欧洲地中海沿岸，于上世纪80年代引入我国。 30多年来我国栽培的青花菜品种以国外引进为主且引进品种以细胞质雄性不育的杂交种为主(李占省，刘玉梅，方智远，杨丽梅，庄木，张扬勇，吕红豪，王勇等.我国青花菜产业发展现状、存在问题与应对策略.《中国蔬菜》，2019(4)：1-5.)。这增加了培育具有自主知识产权的青花菜新品种的难度。因而对于国内自主培育的青花菜品种需要加强保护力度。
青花菜品种‘浙青80’是由浙江省农业科学院蔬菜研究所自主选育的优质中熟青花菜杂交种。中熟，定植后约80天采收。生长势强，株型较直立，分枝少；花球紧实高圆，蕾粒中细均匀，蕾色蓝绿、低温不易发紫，商品性好。适宜长江流域和云南秋冬季种植。
KASP(竞争性等位基因特异性PCR，kompetitive allele specific PCR) 标记技术是由英国LGC公司开发的新一代高通量自动化SNP检测技术，具有共显性，显示DNA序列差异，易实现数据整合共享、通量高、单位点检测成本低等优点，现已成为国际上SNP分型以及插入缺失变异(InDel,Insertion or Deletion)检测的主要方法之一，并在水稻、玉米、小麦等作物中已得到了大量应用(陆海燕,周玲,林峰,王蕊, 王凤格,赵涵.基于高通量测序开发玉米高效KASP分子标记.作物学报,2019,45(6):872-878；王富强，樊秀彩，张颖，刘崇怀，姜建福.SNP 分子标记在作物品种鉴定中的应用和展望.植物遗传资源学报,DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20200309002)。本申请通过开发KASP标记引物并建立其鉴别方法，为实现‘浙青80’品种的遗传纯度鉴定、真伪鉴别及保护提供技术支持。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于KASP技术的SNP标记，用于鉴定‘浙青80’种子纯度和真实性，该方法结果稳定、准确，可高通量鉴定‘浙青80’种子的纯度和真实性。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明利用23份青花菜核心种质的重测序数据，获得了百万计的SNP位点，根据每个SNP位点的多态性指数(PIC)、最小等位基因频率(MAF)、在染色体上的分布等，筛选出100个SNP位点，利用 KASP技术对392份青花菜材料基因分型，建立了青花菜指纹图谱库数据。
本发明基于青花菜杂交种‘浙青80’及其双亲的基因分型结果，确定了3对引物组合，可用于‘浙青80’杂交种的种子纯度和真实性鉴定。
本发明一方面，提供了一种用于鉴定青花菜品种‘浙青80’的SNP标记，所述的SNP标记包括：
编号KCM8001的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C8染色体第388951位置的碱基为G或A；
编号KCM8002的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C8染色体第32131581位置的碱基为G或C；
编号KCM8003的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C8染色体第35830426位置的碱基为T或C。
在本方明的另一方面，提供了用于检测上述SNP标记的引物组合，所述的引物组合包括：
用于检测KCM8001标记的引物对，由正向引物F1、H1和反向引物C1组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示；
用于检测KCM8002标记的引物对，由正向引物F2、H2和反向引物C2组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示；
用于检测KCM8003标记的引物对，由正向引物F3、H3和反向引物C3组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～9所示。
进一步的，上述各标记引物对中两条正向引物只在3’末端存在碱基差异性，可以竞争性地与目标位点结合，显示相应的FAM或HEX 荧光，经信号放大后可判读目标位点基因型。
基于KASP技术体系对‘浙青80’杂交种纯度进行鉴定，在本发明的实施例中，采用2条上游引物并在上游引物5'端分别增加通用接头序列。上游引物F1～3增加的通用接头序列如SEQ ID NO.10所示；上游引物H1～3增加的通用接头序列如SEQ ID NO.11所示。
基于KASP基因分型技术体系，本发明SNP标记对应引物针对青花菜‘浙青80’及其双亲的基因型如下：
样品名称 KCM8001 KCM8002 KCM8003
浙青80 GA CG CT
父本 GG CC CC
母本 AA GG TT
在本发明的另一方面，还提供了用于鉴定青花菜品种‘浙青80’的试剂盒，所述的试剂盒包括SEQ ID NO.1～9所示的引物组合。
优选的，所述的试剂盒还包括如SEQ ID NO.10～11所示的通用接头序列。
在本发明的另一方面，还提供了一种鉴定青花菜品种‘浙青80’的方法，包括以下步骤：
1)提取待测青花菜基因组DNA；
2)利用上述引物组合和通用接头进行PCR扩增；
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
进一步的，所述PCR反应体系为：PCR预混液5μL；引物混合液 0.14μL，其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL。
进一步的，所述PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性 20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10 个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
进一步的，根据基因分型结果，判定待测样本为亲本、杂交种或异型株。
判定标准如下：
每个样本中，若3个SNP标记的基因型结果分别为GG、CC、CC，则可判定该样本为父本；若基因型结果分别为AA、GG、TT，则可判定该样本为母本；若基因型结果分别为GA、CG、CT，则可判定该样本为‘浙青80’杂交种F1；其它情况(缺失基因型除外)，则可判定该样本为异型株。
根据判定结果，统计亲本、杂交种和异型株的数目，可计算‘浙青80’的种子纯度。纯度计算公式如下：
Pur(％)＝[(N-P-H)/F]×100％
其中，Pur为种子纯度；N为待测样本数；P为亲本单株数；H 为异型株数；F为杂交种数。
在本发明的另一方面，还提供了所述的SNP标记或引物组合在鉴定‘浙青80’杂交种纯度中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明基于392份青花菜代表性材料的指纹图谱数据，基于高通量的KASP基因分型平台，对100个SNP位点进行筛选，根据多态性指数、最小等位基因频率、基因分型的质量、结果的重复性等，筛选出适用于‘浙青80’种子纯度鉴定的3个SNP位点，并设计出用于检测SNP位点的共9条引物序列。利用这9条引物序列，可实现‘浙青80’种子的高通量、高效率纯度鉴定。本发明还提供了判定种子为亲本、杂交种或异型株，并计算纯度的方法，为青花菜品种‘浙青80’的推广提供了强有力的技术支撑。
附图说明
图1为本发明用于‘浙青80’种子纯度鉴定的KCM8001位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图；图中，左上角一簇的基因型为GG，中间一簇的基因型为GA，右下角一簇的基因型为 AA；
图2为本发明用于‘浙青80’种子纯度鉴定的KCM8002位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图；图中，左上角一簇的基因型为CC，中间一簇的基因型为CG，右下角一簇的基因型为GG；
图3为本发明用于‘浙青80’种子纯度鉴定的KCM8003位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图；图中，左上角一簇的基因型为CC，中间一簇的基因型为CT，右下角一簇的基因型为TT。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1SNP分子标记及引物的确定
1)备选位点：100个用于对392份青花菜材料(由国内11家西兰花育种联合攻关单位提供)指纹图谱构建的SNP位点。
2)位点的筛选：从100个SNP位点中，根据位点的多态性指数、最小等位基因频率、对‘浙青80’杂交种及其双亲的基因分型结果，挑选了3对重复性好、分型结果明晰的特异性位点组合，用于‘浙青80’的纯度鉴定。
3)3个SNP标记的编号分别为KCM8001、KCM8002和KCM8003，它们的位点信息如下：
表1青花菜品种‘浙青80’的SNP位点信息
Figure RE-GDA0002879810970000071
4)本发明确定的基于KASP技术检测上述SNP位点的引物序列，以及对392份材料基因分型后的PIC、MAF和杂合率信息如下：
表2基于KASP技术检测青花菜SNP位点的信息
Figure RE-GDA0002879810970000072
每对引物包括3条引物序列，其中F1～3和H1～3分别为正向引物，C1～3为反向引物。两条正向引物只在3’末端存在碱基差异性，可以竞争性地与目标位点结合，显示相应的FAM或HEX荧光，经信号放大后可判读目标位点基因型。
基于KASP技术体系对‘浙青80’杂交种纯度进行鉴定，在本发明的实施例中，采用两条上游引物，并在上游引物5'端分别增加通用接头序列。上游引物F1～3增加的通用接头序列为5’-GAAGGTGACCA AGTTCATGCT-3’；上游引物H1～3增加的通用接头序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
5)青花菜‘浙青80’及其双亲在3对SNP引物上的基因型数据如下：
表3‘浙青80’及其双亲的基因型
样品名称 KCM8001 KCM8002 KCM8003
浙青80 GA CG CT
父本 GG CC CC
母本 AA GG TT
实施例2‘浙青80’青花菜杂交种纯度的鉴定
本实施例具体提供了一种鉴定‘浙青80’青花菜杂交种纯度的方法，包括以下步骤：
1.DNA的提取
随机挑选待测的‘浙青80’杂交种种子180粒、父母本各2粒，进行DNA制备。
1)将种子播种于穴盘，两周后取1cm大小的叶片于2ml离心管中，放入4mm直径的玻璃珠。
2)加入500ul的2％的CTAB，用研磨机充分研磨。
3)65℃水浴45min后，加入等体积的氯仿－异戊醇(体积比24： 1)，颠倒混匀。
4)12000rpm离心15min，取上清(约400ul)于新的1.5ml管中。
5)向上清中加入2倍体积的无水乙醇，待DNA析出。
6)10000rpm离心2min，倒掉上清液后，加75％的乙醇清洗3 次，风干。
7)加入200μl TE(pH 8.0)或ddH2O，充分溶解备用。
2.利用KASP技术进行基因分型检测
利用标记KCM8001、KCM8002和KCM8003组成的特异性KASP 标记对‘浙青80’进行纯度鉴定。
具体步骤为：
1)提取待测青花菜基因组DNA；
2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Mastermix，进行PCR扩增；
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
KASP Mastermix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2。
用于KASP检测的PCR反应体系如下：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL，其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL；
用于PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s， 61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
3.结果分析
通过检测，获得180个待测杂交种‘浙青80’种子及其亲本在编号为KCM8001、KCM8002和KCM8003的SNP标记基因分型结果。
表4 180个待测样品的KASP基因分型结果
Figure RE-GDA0002879810970000091
Figure RE-GDA0002879810970000101
统计结果表明：180个待测样本用3个标记基因分型结果分别为 GA、CG、CT，父本分别为GG、CC和CC，母本分别为AA、GG和TT，杂交种纯度为100％(图1～3)。
实施例3‘浙青80’的鉴定
随机挑选待测青花菜种子与‘浙青80’标准样品种子各48粒，按照实施例2中的方法制备DNA，同时利用本发明涉及的3个SNP标记进行基因分型检测。PCR反应体系和反应条件如实施例2。
表5待测品种与标准样品‘浙青80’在3个SNP位点上的分型结果
编号 待测种子 标准样品
KCM8001 AA GA
KCM8002 CC CG
KCM8003 CT CT
结果分析：通过上述检测，获得待测的青花菜种子与‘浙青80’在 3个SNP位点上分型结果，比对分析表明：待测杂交种在2个SNP位点与‘浙青80’存在差异，表明待测杂交种不是‘浙青80’的真实杂交种。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种用于鉴定青花菜品种‘浙青80’的SNP标记
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggtatcct tgagtaagct ctgag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtatcct tgagtaagct ctgaa 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gataggttcg tcacctgcat aa 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgttttgat ctgattaagc ttc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgttttgat ctgattaagc ttg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgtcgtct ttcgcaacca ga 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaacaaataa ccgaaccgtc ccc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaacaaataa ccgaaccgtc cct 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaggtcaac tcctcatcat tcc 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims (8)

1.一种用于鉴定青花菜品种‘浙青80’的SNP标记，其特征在于，所述的SNP标记包括：
编号KCM8001的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C8染色体第388951位置的碱基为G或A；
编号KCM8002的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C8染色体第32131581位置的碱基为G或C；
编号KCM8003的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C8染色体第35830426位置的碱基为T或C。
2.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的引物组合，其特征在于，所述的引物组合包括：
用于检测KCM8001标记的引物对，由正向引物F1、H1和反向引物C1组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示；
用于检测KCM8002标记的引物对，由正向引物F2、H2和反向引物C2组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示；
用于检测KCM8003标记的引物对，由正向引物F3、H3和反向引物C3组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～9所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测权利要求1所述SNP标记的引物组合，其特征在于，还包括序列如SEQ ID NO.10～11所示的通用接头。
4.一种用于鉴定青花菜品种‘浙青80’的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括SEQID NO.1～9所示的引物组合。
5.根据权利要求4所述的一种用于鉴定青花菜品种‘浙青80’的试剂盒，其特征在于，还包括序列如SEQ ID NO.10～11所示的通用接头。
6.一种鉴定青花菜品种‘浙青80’的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测青花菜基因组DNA；
2)利用上述引物组合和通用接头进行PCR扩增；
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
7.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL，其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
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