CN111733274A - 用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的snp位点及引物组和方法 - Google Patents

用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的snp位点及引物组和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点及引物组和方法，KASP标记引物组针对SNP位点及其侧翼序列，其中，ZWSNP_119引物组包含：如SEQ ID.NO 1所示核苷酸序列的引物X、如SEQ ID.NO 2所示核苷酸序列的引物Y、如SEQ ID.NO 3所示核苷酸序列的通用引物R；ZWSNP_162引物组包含：如SEQ ID.NO 4所示核苷酸序列的引物X’、如SEQ ID.NO 5所示核苷酸序列的引物Y’、如SEQ ID.NO 6所示核苷酸序列的通用引物R’。本发明的引物组用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”，高效、准确、周期短，具有很高的实用价值。

Description

用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点及引物组和 方法
技术领域
本发明涉及一种KASP标记引物组，具体涉及一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点及引物组和方法。
背景技术
近年来，我国自主选育的花椰菜品种市场份额逐步提高，种子需求潜力巨大。花椰菜杂种优势明显，选育的品种几乎全部为F1代杂交种。但是，在杂交种制种过程中，由于农事操作传粉，蜜蜂、苍蝇等昆虫远距离传粉都会造成假杂种；利用自交不亲和系制种时，由于母本自交不亲和性不够彻底，导致杂交种中含有少量母本自交种子，形成假杂种的同时易造成亲本的流失；花椰菜各品种间种子形态差异小，容易造成机械混杂。
目前，花椰菜杂交种种子纯度鉴定仍以传统表型调查和经验等方法为主，不仅工作量大、周期长，且易受环境和人为判断的影响，不适应当前生产发展的需要。
大量基因组二代和三代测序数据的获得，为多类型分子标记的开发和使用提供了序列信息。而利用分子标记进行杂交种纯度鉴定，可以从DNA序列差异上判断和检测杂交种遗传物质一致性，具有用时短、重复性高、不受环境影响等优点。目前，包括花椰菜在内的大部分甘蓝类蔬菜使用SSR分子标记进行杂交种纯度鉴定，但这类型标记存在诸多缺陷，如通量低、带型分辨度低、重复性不高等缺点，并且在制胶和显影过程中要用到TEMED和甲醛等剧毒物质，对操作人员和环境造成伤害。因此，选用高通量、高分辨度和稳定度的新型分子标记及无毒、安全的检测系统来进行杂交种纯度鉴定势在必行。
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)标记是近年来兴起一种新型分子标记，利用终端不同荧光信号的读取，检测一个SNP位点的三种基因型。KASP标记具有高通量、高灵敏性并且无需低效的制胶、跑电泳等环节，已经被广泛应用于遗传多样性分析、遗传图谱构建、QTL/基因定位等研究，但对花椰菜杂交种纯度鉴定的应用还无相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点及引物组和方法，解决了传统传统表型调查周期长的问题，能够高效、准确鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点，两个SNP位点分别位于SEQ ID.NO 9中第100、101位和SEQ ID.NO 10中第100、101位，分别具有A/G多态性和具有T/G多态性。
本发明的另一目的是提供一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点标记，含有所述的SNP位点及其侧翼序列，具有如SEQ ID.NO 9和SEQ ID.NO 10所示核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种鉴定花椰菜“浙农松花80天”纯度的KASP标记引物组，该KASP标记引物组为ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组；其中，所述ZWSNP_119引物组包含：具有如SEQ ID.NO 1所示核苷酸序列的SNP特异性引物X、具有如SEQ ID.NO 2所示核苷酸序列的SNP特异性引物Y、具有如SEQ ID.NO 3所示核苷酸序列的通用引物R；所述ZWSNP_162引物组包含：具有如SEQ ID.NO 4所示核苷酸序列的SNP特异性引物X’、具有如SEQ ID.NO 5所示核苷酸序列的SNP特异性引物Y’、具有如SEQ ID.NO 6所示核苷酸序列的通用引物R’。
本发明的另一目的是提供一种鉴定花椰菜“浙农松花80天”的KASP基因分型试剂盒，该试剂盒的引物为所示的KASP标记引物组，SNP特异性引物X和X’的5’端标记有与FAM荧光结合的特异性序列，SNP特异性引物Y和Y’的5’端标记与HEX荧光结合的特异性序列。
本发明的另一目的是提供一种KASP标记鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的方法，该方法采用所示的ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组分别对待检测样品的基因组DNA进行PCR扩增，根据荧光信号确定分型情况，两个引物组均鉴定为杂种的单株为“浙农松花80天”真杂种。
优选地，所述ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组中，SNP特异性引物X和X’的5’端均添加与FAM荧光结合的特异性序列，SNP特异性引物Y和Y’的5’端均添加与HEX荧光结合的特异性序列。
优选地，与FAM荧光结合的特异性序列具有如SEQ ID.NO 7所示核苷酸序列，与HEX荧光结合的特异性序列具有如SEQ ID.NO 8所示核苷酸序列。
优选地，所述ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组中，SNP特异性引物X或X’：SNP特异性引物Y或Y’：通用引物R或R’的体积比为12:12:30。
优选地，该方法采用的KASP反应体系包含：如所示的ZWSNP_119引物组或ZWSNP_162引物组、2×Mastermix、基因组DNA和无菌蒸馏水。
本发明的另一目的是提供一种KASP标记鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种纯度的方法，采用所述的KASP标记鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的方法，任意一对引物组呈现严重偏离的被确定为假杂种，杂种纯度＝真杂种株数/检测总株数×100％。
本发明的用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点及引物组和方法，解决了传统传统表型调查周期长的问题，具有以下优点：
本发明利用双亲重测序数据，寻找双亲纯合稳定的SNP位点，开发KASP标记，设计的引物组能够应用于自主选育的花椰菜品种“浙农松花80天”的纯度鉴定，能够高效、准确鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种，缩短了鉴定周期，具有很高的实用价值。
附图说明
图1为本发明的两对引物KASP分型图。
图2为本发明实施了1的ZWSNP_119的KASP分型图。
图3为本发明实施了2的ZWSNP_162的KASP分型图。
注：图中，蓝色表示父本，红色表示母本，紫色表示F1杂种，绿色表示混杂的材料。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点，通过针对最小等位基因频率(MAF)大于0.05、多态信息含量(PIC)>0.4、基因型缺失率小于20％的SNP待选位点，筛选出前后各100bp没有其它变异位点，Blast为单拷贝的靶标SNP位点，两个SNP位点分别位于SEQ ID.NO 9中第100、101位和SEQ ID.NO 10中第100、101位，分别具有A/G多态性和具有T/G多态性。
一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点标记，含有上述SNP位点及其侧翼序列，具有如SEQ ID.NO 9和SEQ ID.NO 10所示的核苷酸序列，具体为：
SEQ ID.NO 9的核苷酸序列为：
5’-CGGATTGTGGGAGGCGATCCGTACTGGCGACGTACTGAAAGGGATAGACTGATGAGGCTTGGTCGGCTGTTTCCGTAGACGGCTTGATAGTATCTGATGAGGAGGCGTCTGTACTGACGATGCGGATCAGACGGGAAGGGTTGTCTGAGGCGGTTAGGGCTCGGATCGAGTCTTAACGTTCTGTACCGGCTATGGTACATG-3’(SNP位点处，父本为A，母本为G，F1杂种为AG)；SEQ ID.NO 10所示的核苷酸序列为：
5’-TCAGGAGAAAACTCAAGAATGGTGGTGATTCCAGTTACTCTTAAAGGAGCTAACTATCTACATTGGGCAAGGCTTGCTAAGACAGCTCTTGGAGGCAGATGGGCTTTGGGAGATTGTTGAAGAAGGCATGCCACAAAAGAAGACTATCCTAGGAGAGGATGGCAAAGAGGTTGTTCTTGCTGATGCTGGCGCCAAGAAGAA-3’(SNP位点处，父本为T，母本为G，F1杂种为TG)。
一种鉴定花椰菜“浙农松花80天”纯度的KASP标记引物组，针对上述SNP位点标记，该KASP标记引物组为ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组。
上述ZWSNP_119引物组，包含如下引物：
SNP特异性引物X(SEQ ID.NO 1)：
5’-CATCGTCAGTACAGACGCCTCT-3’；
SNP特异性引物Y(SEQ ID.NO 2)：
5’-ATCGTCAGTACAGACGCCTCC-3’；
通用引物R(SEQ ID.NO 3)：
5’-CCGTAGACGGCTTGATAGTATCTGAT-3’。
上述ZWSNP_162引物组，包含如下引物：
SNP特异性引物X’(SEQ ID.NO 4)：
5’-CTTCTTCAACAATCTCCCAAAGCCA-3’；
SNP特异性引物Y’(SEQ ID.NO 5)：
5’-TTCTTCAACAATCTCCCAAAGCCC-3’；
通用引物R’(SEQ ID.NO 6)：
5’-GCAAGGCTTGCTAAGACAGCTCTT-3’。
实施例1
一种KASP标记鉴定花椰菜“浙农松花80天”纯度的方法，采用上述KASP标记引物组，SNP特异性引物X和X’的5’端添加能够与FAM荧光结合的特异性序列(SEQ ID.NO 7：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)，SNP特异性引物Y和Y’的5’端添加能够与HEX荧光结合的特异性序列(SEQ ID.NO 8：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)，鉴定的材料有：“浙农松花80天”父本2份、母本2份和样品，样品为98份“浙农松花80天”真杂种和4份人为混杂的材料，该方法具体如下：
(1)基因组DNA的提取
采用传统的CTAB方法提取“浙农松花80天”杂交种及其双亲的基因组DNA，具体如下：
取待选植株幼嫩叶片0.1g，放入2.0mL的平头离心管中，添加600μL 2％CTAB缓冲液(60℃预热30min)，同时加入1个小钢珠，在200r/s震荡破碎2min。随后，离心管放入65℃水浴锅中40min，期间上下颠倒4次；加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24:1)轻柔摇晃5次，在12000rpm离心10min，取上清液加入2/3体积预冷异丙醇，混匀，-20℃冰箱静置120min，在12000rpm离心10min。弃上清，沉淀出的DNA用70％乙醇洗涤两次，干燥后加入无菌蒸馏水-20℃保存备用。
(3)PCR扩增体系和程序
预混液的配制，具体为：将上述每组引物中的3条引物均稀释到100μmol，并按照体积比为12:12:30(X:Y:R或X’:Y’:R’)混匀，加入46μL的无菌蒸馏水至引物预混液100μL，得到两个引物预混液。
样品DNA的稀释，具体为：基因组DNA用无菌蒸馏水稀释至30-50ng/μL。
以384孔板进行PCR扩增和检测，具体如下：
KASP反应总体系为5μL：2×Mastermix 2.5μL，引物预混液0.07μL，稀释后的DNA 1μL，无菌蒸馏水1.43μL。
PCR程序为：第一步94℃，15min；第二步94℃，20s，61℃～55℃，1min，10个循环，每循环温度降低0.6℃；第三步94℃，20s，接着55℃，60s，继续扩增26个循环。
(4)KASP标记分型
PCR扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。从分型结果来看，父本信号集中在纵坐标HEX荧光轴旁，母本信号集中在横坐标FAM荧光轴旁，“浙农松花80天”杂交种信号集中于纵/横坐标轴中间的位置，98个“浙农松花80天”真杂种信号集中于纵/横坐标轴中间的位置，4份人为混杂的材料信号严重偏离。鉴定结果与事实的符合度为100％(参见图2)。
实施例2大田收获的杂交种真实性鉴定
“浙农松花80天”父本1份、母本1份，当年收获的杂交种208份。将这些材料于2019年7月15日穴盘育苗，8月15日移栽大田，2019年10月15日至11月15日对208份材料的叶型，株型和球型等农艺性状进行观察，并与父、母本材料进行比较，确定杂株数和待测样品的纯度，并采用实施例1的方法鉴定。
结果显示，利用常规田间表型鉴定方法，208份待测样品中共有8份混杂单株，种子纯度为96.2％。利用本发明的方法对208份待测样品进行检测，其中共有8份混杂单株，种子纯度为96.2％，两者检测结果相符度达100％(参见图3)。但是，采用田间表型鉴定从播种到鉴定需要3-4个月时间，而本发明方法从播种到鉴定只需5-6天。而且，田间种植鉴定成本包括劳动力、农药、化肥、用地等是本发明方法的所需费用的10倍以上。由此可见，本发明方法在花椰菜杂交种鉴定的可行性、可靠性与时效性方面都具有明显优势。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点及引物组和方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
catcgtcagt acagacgcct ct 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atcgtcagta cagacgcctc c 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccgtagacgg cttgatagta tctgat 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cttcttcaac aatctcccaa agcca 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ttcttcaaca atctcccaaa gccc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gcaaggcttg ctaagacagc tctt 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 9
<211> 201
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cggattgtgg gaggcgatcc gtactggcga cgtactgaaa gggatagact gatgaggctt 60
ggtcggctgt ttccgtagac ggcttgatag tatctgatga ggaggcgtct gtactgacga 120
tgcggatcag acgggaaggg ttgtctgagg cggttagggc tcggatcgag tcttaacgtt 180
ctgtaccggc tatggtacat g 201
<210> 10
<211> 201
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tcaggagaaa actcaagaat ggtggtgatt ccagttactc ttaaaggagc taactatcta 60
cattgggcaa ggcttgctaa gacagctctt ggaggcagat gggctttggg agattgttga 120
agaaggcatg ccacaaaaga agactatcct aggagaggat ggcaaagagg ttgttcttgc 180
tgatgctggc gccaagaaga a 201

Claims (10)

1.一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点，其特征在于，两个SNP位点分别位于SEQ ID.NO 9中第100、101位和SEQ ID.NO 10中第100、101位，分别具有A/G多态性和具有T/G多态性。
2.一种用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的SNP位点标记，其特征在于，含有如权利要求1所述的SNP位点及其侧翼序列，具有如SEQ ID.NO 9和SEQ ID.NO 10所示核苷酸序列。
3.一种鉴定花椰菜“浙农松花80天”纯度的KASP标记引物组，其特征在于，该KASP标记引物组为ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组；
其中，所述ZWSNP_119引物组包含：具有如SEQ ID.NO 1所示核苷酸序列的SNP特异性引物X、具有如SEQ ID.NO 2所示核苷酸序列的SNP特异性引物Y、具有如SEQ ID.NO 3所示核苷酸序列的通用引物R；
所述ZWSNP_162引物组包含：具有如SEQ ID.NO 4所示核苷酸序列的SNP特异性引物X’、具有如SEQ ID.NO 5所示核苷酸序列的SNP特异性引物Y’、具有如SEQ ID.NO 6所示核苷酸序列的通用引物R’。
4.一种鉴定花椰菜“浙农松花80天”的KASP基因分型试剂盒，其特征在于，该试剂盒的引物为如权利要求3中所示的KASP标记引物组，SNP特异性引物X和X’的5’端标记有与FAM荧光结合的特异性序列，SNP特异性引物Y和Y’的5’端标记与HEX荧光结合的特异性序列。
5.一种KASP标记鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的方法，其特征在于，该方法采用如权利要求3中所示的ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组分别对待检测样品的基因组DNA进行PCR扩增，根据荧光信号确定分型情况，两个引物组均鉴定为杂种的单株为“浙农松花80天”真杂种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组中，SNP特异性引物X和X’的5’端均添加与FAM荧光结合的特异性序列，SNP特异性引物Y和Y’的5’端均添加与HEX荧光结合的特异性序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，与FAM荧光结合的特异性序列具有如SEQID.NO 7所示核苷酸序列，与HEX荧光结合的特异性序列具有如SEQ ID.NO 8所示核苷酸序列。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ZWSNP_119引物组和ZWSNP_162引物组中，SNP特异性引物X或X’：SNP特异性引物Y或Y’：通用引物R或R’的体积比为12:12:30。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的方法，其特征在于，该方法采用的KASP反应体系包含：如权利要求3中所示的ZWSNP_119引物组或ZWSNP_162引物组、2×Mastermix、基因组DNA和无菌蒸馏水。
10.一种KASP标记鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种纯度的方法，其特征在于，采用如权利要求5-9中任意一项所述的方法，任意一对引物组呈现严重偏离的被确定为假杂种，杂种纯度＝真杂种株数/检测总株数×100％。
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