CN102643913A

CN102643913A - 一种基于pcr技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法

Info

Publication number: CN102643913A
Application number: CN2012101102501A
Authority: CN
Inventors: 王燕; 徐坚; 许园园; 郑岳忠
Original assignee: WENZHOU INSTITUTE OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: WENZHOU INSTITUTE OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2012-04-16
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2032-04-16
Also published as: CN102643913B

Abstract

本发明公开了一种基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法，本发明以花椰菜杂交种‘东方白雪100天“为研究对象，开展分子标记的筛选，鉴定出杂种中能够同时产生父、母本特异条带标记的特异引物组合SREM8-1/SRodd58，幼苗叶片的基因组DNA。本发明引物的应用，具有准确性高、结果稳定、不受环境条件及发育时期的影响、统计简便等优点，可以简单、快速、准确地检测花椰菜杂交品种‘东方白雪100天’的种子遗传纯度，有利于花椰菜种子高效准确的质量控制，加快了花椰菜商品种子的质量检测进程。

Description

一种基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法，利用SRAP分子标记技术进行花椰菜品种东方白雪100天种子遗传纯度的检测。

背景技术

花椰菜即Brasica oleraceae .var. botyris L.又称花菜、菜花，是十字花科芸薹属的一种重要蔬菜，在中国、印度、意大利、欧洲、美国等世界各地有广泛种植。花椰菜的食用部分是由无数短缩肥壮的花枝和花蕾聚合而成，称为“花球”。花椰菜营养丰富，除含有蛋白质、纤维素和各种矿物质外，还含有多种吲哚衍生物，具有抗癌作用，近年已被列为抗癌蔬菜。近年来我国花椰菜的生产发展迅速，我国不仅是世界上花椰菜种植面积最大、总产最高的国家，也是花椰菜种植面积增长最快的国家之一，在蔬菜周年供应中占有越来越重要的地位。

目前，现有的许多蔬菜新品种无需审定即可推广应用，并且由于经营种子的单位越来越多，种子质量参差不齐。由于一些客观原因，如亲本不是纯系、制种区生态条件复杂等，以及一些人为因素，例如假冒伪劣、坑农害农事件、销售纯度不合格的种子等，造成了很多农业生产事故与群体事件，给蔬菜生产者与种子销售企业带来严重的损失与极大的负面影响。在花椰菜F1代杂种制种过程中，母本系自交的种子、外来花粉窜粉以及机械混杂产生的假杂种常混杂于F1中，严重影响种子的质量和纯度，给农户带来巨大经济损失，给种子生产者、经营者带来索赔风险。因此，花椰菜产业与种业良性健康发展需要准确、高效的种子遗传纯度检测技术。

‘东方白雪100天’花椰菜是瑞安南方蔬菜种苗有限公司采用欧洲耐寒白花菜亲本，利用自交不亲和方法育成的杂交种品种。该品种的花椰菜具有中晚熟、抗病、优质、高产、耐寒、植株直立、生长势强，蜡粉中等、花球结白紧密、内叶自覆性好、适应性广等优点，是花椰菜的理想品种。为保证优良品种产生最大的经济效益，需要一种准确、快速检测杂交种品种的遗传纯度的方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测准确快速、不受环境影响、多态性高的基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法，这种方法可以弥补现有纯度检测工作的不足，从而为种子质量高效控制提供重要的技术手段。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法，其特征在在于包括以下步骤：

（1）提取花椰菜杂交种“东方白雪100天”幼苗叶片的基因组DNA；

（2）采用特异引物组合SREM8-1/ SRodd58：

正向引物SREM8-1：GACTGCGTACGAATTCAC和

反向引物SRodd58：TTCTAGGTAATCCAACAACA，

以基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（3）将扩增后的DNA片段，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

（4）对电泳结果进行分析，将同时具有母本特异性标记条带和父本特异性标记条带的单株判定为真正的杂交种，缺少其中任意一个条带记为假杂种，计算种子遗传纯度，其中：

特异引物组合SREM8-1/ SRodd58产生大小为110bp母本特异性标记条带，产生大小为80bp父本特异性标记条带。

作为优选，所述的PCR扩增反应包括以下步骤：

SRAP-PCR反应体系含基因组10ngDNA，2.5mmol·L^-1Mg²⁺，0.15mmol·L^-1dNTPs， 0.5μmol·L^-1 SRAP正向引物SREM8-1与反向引物SRodd58，0.75U Taq DNA聚合酶；

PCR扩增程序：90℃ 3min；94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1.5min，5个循环；94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1.5min， 33个循环；72℃ 7min延伸，10℃保存。

作为优选，所述的凝胶电泳检测方法包括以下步骤：

所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶中含有：Arc：Bis 6.65ml、5×TBE 5ml、TEMED 20μl、10%AP 0.3ml，其中，Arc：Bis的质量比为29:1；

将PCR扩增产物在浓度为6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。在50～60V预电泳30min后上样，在120V稳压下电泳2.5～3.0 h，电泳结束后，凝胶采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定液固定12～20min；用0.2% AgNO3溶液染色10～15 min；洗涤后于显影液中显影，拍照，所述的显影液中包括1.5%NaOH、0.4%甲醛和0.002%Na2S2O3。

本发明的有益效果在于：

本发明从大量的引物中筛选出能够在一代杂种中同时产生具有父、母特异标记条带的，而且条带清晰、重复性好的引物：特异引物组合SREM8-1与 SRodd58，作为‘东方白雪100天’的遗传纯度鉴定的特征引物。

本发明引物的应用，具有准确性高、结果稳定、不受环境条件及发育时期的影响、统计简便等优点，可以简单、快速、准确地检测花椰菜杂交品种‘东方白雪100天’的种子遗传纯度，有利于花椰菜种子高效准确的质量控制，加快了花椰菜商品种子的质量检测进程。

附图说明

图1为花椰菜杂交品种‘东方白雪100天’种子遗传纯度检测特征引物组合SREM8-1/SRodd58的SRAP-PCR电泳图谱

泳道F：‘东方白雪100天’母本；泳道M：‘东方白雪100天’父本；泳道1-22：‘东方白雪100天’F1杂交种；泳道L：100bp分子量标准；箭头表示特异性标记条带。

具体实施方式

1、花椰菜基因组DNA的提取

（1）提取花椰菜杂交种‘东方白雪100天’幼苗的幼嫩叶片约0.5g，经过液氮研磨，加入500μl CTAB裂解液，转入1.5ml的离心管中，在65℃的水浴下30～50min。其中，CTAB裂解液中含有2%的CTAB，2mol·L^-1NaCl,20mmol·L^-1EDTA,100mmol·L^-1Tris-HCl与 0.2%的β-巯基乙醇,V/V，Tris-HCl的pH值为8.0。

（2）取出离心管，将离心管在16℃、12000rpm的条件下离心10min，取上清液，转入新灭菌的1.5ml的离心管中，加入与上清液等体积的氯仿：异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，轻轻摇晃，在室温、12000rmp的条件下离心10min。

（3）取离心后的上清液，转入新的离心管中，重复步骤（2）1次，加入上清液的0.1体积的醋酸钠，和与上清液等体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转5～10次，放置于冰箱内，在-20℃下放置至少30min。

（4）在4℃、12000rmp的条件下离心10min，倒掉上清液，用70%预冷乙醇洗涤DNA沉积物；

（5）在4℃、12000rmp的条件下离心2～4min，倒掉上清液，干燥后加入80μL灭菌TE缓冲液溶解DNA，琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA后保存于4℃或-20℃备用。

2、筛选纯度鉴定的特征引物

（1）合成用于PCR扩增所需的SRAP引物，筛选出能够检测亲本与杂交种之间稳定差异位点的引物；即筛选出能够在一代杂种中同时产生母本特异标记条带和父本特异标记条带，且带型清晰、重复性好、可靠性强的特异引物组合SREM8-1/ SRodd58。

3、PCR扩增及分子标记分析

利用获得的有效特征引物对花椰菜‘东方白雪100天’幼苗基因组DNA进行PCR扩增。SRAP标记扩增反应体系与扩增程序为：

PCR扩增程序：90℃3min；94℃1min，35℃1min，72℃1.5min，5个循环；94℃1min，50℃1min，72℃1.5min， 33个循环；72℃7min延伸，10℃保存。

4、扩增产物的检测

扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，即PAGE。25ml凝胶中含有：Arc：Bis 6.65ml，5×TBE 5ml、TEMED 20μl、10%AP 0.3ml；其中Arc与Bis的质量比为29：1。将PCR扩增产物在浓度为6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。在50～60V预电泳30min后上样，在120V稳压下电泳2.5～3.0 h，电泳结束后，凝胶采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定液固定12～20min；用0.2% AgNO₃溶液染色10～15 min；洗涤后于显影液中显影，拍照，显影液中包括1.5%NaOH、0.4%甲醛和0.002%Na₂S₂O₃。

5、种子遗传纯度鉴定

对花椰菜品种‘东方白雪100天’F1杂种幼苗基因组DNA 扩增产物进行电泳分析。只有同时具有父、母本特异性标记条带的幼苗单株判定为真正的杂交种，只要缺失其中任何一个特异标记的幼苗单株均判定为假杂种。

如图1所示，利用SRAP引物组合SREM8-1/SRodd58进行PCR扩增，在杂交种中产生大小为110bp的母本特异性标记条带和80bp父本特异性标记条带的幼苗单株判定为真正的杂交种。

根据SRAP分子标记特异性引物分析结果，计算种子遗传纯度（%）

供检种子遗传纯度（%）=[（供检种子粒数– 假杂种粒数）/供检种子粒数×100%。其中，供检种子粒数、假杂种粒数和供检种子粒数可以通过检测幼苗数。

其中 SRAP引物代号SREM8-1/SRodd5，其含义为；“SR”代表SRAP引物，“EM8-1/odd58”代表实验室SRAP引物编号。

序列表

<110>温州市农业科学研究院

<120>一种基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法

<160>2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<223> SREM8-1引物

<400> 1

GACTGCGTACGAATTCAC 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<223> SRodd58引物

<400> 2

TTCTAGGTAATCCAACAACA 20

Claims

1.一种基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法，其特征在在于包括以下步骤：

（2）采用特异引物组合SREM8-1/ SRodd58：

正向引物SREM8-1：GACTGCGTACGAATTCAC和

反向引物SRodd58：TTCTAGGTAATCCAACAACA，

以基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

2.根据权利要求1所述的基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法，其特征在于所述的PCR扩增反应包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的基于PCR技术的花椰菜遗传纯度快速检测方法，其特征在于所述的凝胶电泳检测方法包括以下步骤：

所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶中含有：Arc：Bis 6.65ml、5×TBE 5ml、TEMED 20μl、10%AP 0.3ml；

将PCR扩增产物在浓度为6.0%的聚丙烯酰胺凝胶上分离，在50～60V预电泳30min后上样，在120V稳压下电泳2.5～3.0 h，电泳结束后，凝胶采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定液固定12～20min；用0.2% AgNO₃溶液染色10～15 min；洗涤后于显影液中显影，拍照，所述的显影液中包括1.5%NaOH、0.4%甲醛和0.002%Na₂S₂O₃。