CN104419762A - 采用est-ssr标记进行花椰菜品种鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法。该方法以13份花椰菜杂交种的基因组DNA为模板，通过对花椰菜EST序列的分析，合成了66对核心EST-SSR引物。经过筛选，利用5对引物组成的标记组合可完全鉴别13份花椰菜品种的差异，该技术和标记组合能够高效准确地表达花椰菜品种间的多态性，并对花椰菜品种进行鉴定。本发明的检测方法在4h之内即可完成种子品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、低成本、操作简便等优势。同时本发明的检测方法可以有效的对花椰菜种子真伪进行监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为花椰菜品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术参考。

Description

采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法
技术领域
本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及13份花椰菜杂交种品种鉴定方法，是一种基于EST-SSR标记的高效、简便进行花椰菜品种鉴定的方法。
背景技术
花椰菜属于甘蓝的变种，为十字花科植物，是一种很受人们欢迎的蔬菜，味道鲜美，营养丰富，同时具有很高的药用价值，目前我国南北各地均有种植。中国市场花椰菜品种为常规种与杂交种并存状态，同名异物及同物异名现象比较普遍，而花椰菜品种田间形态学上的鉴别易受环境和人为因素的影响，再加上生长期长，因此进行花椰菜优良性状早期鉴定和遗传关系研究十分必要。
随着分子生物学技术的发展，遗传多样性不仅是表现在表型性状上的差异，更重要的是表现在DNA水平上的差异。分子标记的发展为从DNA水平上检测品种及品系间的遗传多样性提供了有利的工具。EST(Expressed sequence tags)即表达序列标签，是指通过对cDNA文库随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA的5’或3’端序列，长度一般为150～500bp。EST计划由美国科学家Venter于1989年首次提出，并首先应用于人类基因组的研究，之后被广泛用于植物基因组的研究。随着EST计划在不同物种间的不断扩展和深入研究，数据库中已积累了大量的EST，为SSR标记的开发带来了新的契机，已成为SSR标记的重要来源。为了区别于传统的gSSR，一般将来源于EST库的SSR标记称为EST-SSR标记，该标记的显著特点是来自基因组的转录区域，同时信息量较高，开发过程既简单又快捷，费用低、通用性好，而且效率也高。因此，EST-SSR作为共显性标记与其他分子标记相比具有诸多优点。
目前EST-SSR标记已经应用于水稻(Cho et al.，2000)、葡萄(Scott et al.，2000)、小麦(Gupta et al.，2003；Gao et al.，2004；Nicot et al.，2004)、黑麦(Hackaufet al.，2002)、大麦(Thiel et al.，2003)和扁桃(Xu et al.，2004)、玉米(Wang and Bowen，1998)、甘蔗(Cordeiro et al.，2001)等植物进行分子连锁图谱构建和遗传多样性分析。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
用于花椰菜品种鉴定的EST-SSR引物，其特征在于，包括5对EST-SSR引物：
HYC33上游引物序列：5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3’，HYC33下游引物序列：5’-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3’；BC5上游引物序列：5’-CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3’，BC5下游引物序列：5’-CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3’；HYC10上游引物序列：5’-CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3’，HYC10下游引物序列：5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3’；BC20上游引物序列：5'-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3’，BC20下游引物序列：5’-GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3’；BC28上游引物序列：5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3’，BC28下游引物序列：5’-GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3’。
本发明进一步公开了采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)采用权利要求1所述的EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种花椰菜杂交种基因组DNA模板，浓度100ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存；
(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40％PAG6mL，TEMED30μL，10％过流酰胺300μL；设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(3)通过分析EST-SSR结果，比较13份花椰菜品种间多态性位点的差异，确定引物的多态率及多态信息量；在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析5对引物是否可对13份花椰菜品种进行完全的区分，同时构建13份花椰菜品种的指纹图谱；
本方法通过对13份供试花椰菜杂交种进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析，确认了这套技术和标记组合可以表达花椰菜品种间的多态性，能够高效准确的对花椰菜品种进行鉴定。用于对花椰菜品种进行鉴定的5对EST-SSR引物如表1所示。
表1引物序列表如下：
13份供试花椰菜杂交种取样及DNA提取方法为：对不同花椰菜品种进行随机取样，每个品种取单粒种子20颗，混合成为一个样本，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mMNa2EDTA)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50+1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
供试花椰菜杂交种PCR方法为：
(1)用于13份花椰菜品种鉴定的5对EST-SSR引物，包括HYC33上游引物序列：5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3’，HYC33下游引物序列：5’-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3’BC5上游引物序列：5'-CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3’，BC5下游引物序列：5'-CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3’HYC10上游引物序列：5'-CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3’，HYC10下游引物序列：5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3’；BC20上游引物序列：5'-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3’，BC20下游引物序列：5'-GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3’；BC28上游引物序列：5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3’，BC28下游引物序列：5'-GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3’。
(2)采用上述SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试花椰菜杂交种基因组DNA模板(100ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存；
供试花椰菜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40％(重量百分数)PAG6mL，TEMED30μL，10％过流酰胺300μL；设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
供试花椰菜杂交种EST-SSR结果分析，比较13份花椰菜品种间多态性位点的差异，确定引物的多态率及多态信息量。在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析5对引物是否可对13份花椰菜品种进行完全的区分，同时构建13份花椰菜的指纹图谱。
本发明的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时2h，EST-SSR分析60-90min，所以本发明的检测方法在4h之内即可完成对花椰菜品种的鉴定工作，无论是在时间上还是成本上都充分提高了试验效率，具有快速、准确、低成本、操作简便等优势。同时本发明的检测方法可以有效的对花椰菜种子真伪进行监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为花椰菜品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术参考。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理
本方法应用一种新型的核酸分析方法其原理是：EST-SSR是以1～6个碱基为重复单元，是存在于EST中的SSR。EST(Expressed sequence tag，表达序列标签)是将mRNA在体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其5’端或3’端进行测序后获得的长约150～500bp的表达序列片段。EST序列来自实验室构建的cDNA文库或从美国国家生物信息中心(NCBI)的Genbank中下载。采用相关软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，确定是否可对13份花椰菜品种进行完全的区分。
2、引物设计
通过对花椰菜EST序列的分析，合成了66对核心EST-SSR引物，由上海生工合成。经筛选利用5对EST-SSR引物组成的标记组合能够高效、准确的对花椰菜品种进行鉴定。
引物由上海生物工程公司合成。
表1引物序列表如下：
3、取样及DNA提取
对不同花椰菜品种进行随机取样，每个品种取单粒种子20颗，混合成为一个样本，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na2EDTA)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
4、PCR反应
采用(1)用于13份花椰菜品种鉴定的5对EST-SSR引物，包括HYC33上游引物序列：5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3’，HYC33下游引物序列：5’-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3’BC5上游引物序列：5’-CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3’，BC5下游引物序列：5’-CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3’；HYC10上游引物序列：5'-CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3’，HYC10下游引物序列：5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3’BC20上游引物序列：5'-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3’，BC20下游引物序列：5’-GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3’BC28上游引物序列：5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3’，BC28下游引物序列：5'-GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3’；
SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增(仪器为AB Veriti PCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μtL，扩增反应体系为：2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试花椰菜杂交种基因组DNA模板(100ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存；
5、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
供试花椰菜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳(仪器为BIO-RAD电泳仪)，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40％PAG6mL，TEMED30μL，10％过流酰胺300μL；上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；
染色过程(仪器为ORBITAL脱色摇床)：于600mL超纯水中加入6mL10％的硝酸银溶液，银染8～10min；于600mL超纯水中迅速水洗；于600mL超纯水中加入9g氢氧化钠粉末，溶解后加入3mL甲醛，显色数分钟，直至条带清晰即可；600mL超纯水中再次水洗。
6、EST-SSR谱带分析
通过分析EST-SSR结果，比较13份花椰菜品种间多态性位点的差异，确定引物的多态率及多态信息量。在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析5对引物是否可对13份花椰菜品种进行完全的区分，同时构建13份花椰菜的指纹图谱。
本发明公开的采用EST-SSR标记进行花椰菜品种进行鉴定以现有技术相比所具有的积极效果在于：EST-SSR标记的开发过程简单，成本较低；保守性、转移比率和通用性高；高质量标记比率高；在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时2h，EST-SSR分析60-90min，所以本发明的检测方法在4h之内即可完成对花椰菜品种的鉴定工作，无论是在时间上还是成本上都充分提高了试验效率，具有快速、准确、低成本、操作简便等优势。
附图说明：
图1为EST-SSR引物HYC33用于13份花椰菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为花椰菜品种1～13；
图2为EST-SSR引物BC5用于13份花椰菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为花椰菜品种1～13；
图3为EST-SSR引物HYC10用于13份花椰菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为花椰菜品种1～13；
图4为EST-SSR引物BC20用于13份花椰菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为花椰菜品种1～13；
图5为EST-SSR引物BC28用于13份花椰菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为花椰菜品种1～13；
图6为5对EST-SSR引物用于13份花椰菜品种扩增后EST-SSR谱带分析指纹图谱；
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1，其它用到的试剂均有市售。
实施例1
(1)样品包括13份供试花椰菜品种杂交种。
(2)试剂：Promega公司生产的Master Mixes溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
(3)EST-SSR引物序列表如下：
(4)取样及DNA提取
对不同花椰菜品种进行随机取样，每个品种取单粒种子20颗，混合成为一个样本，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na2EDTA)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
(5)PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试品种模板DNA进行PCR扩增(仪器为AB VeritiPCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×MasterMixes5μL，HYC33上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种基因组DNA模板(100ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存。
(6)凝胶电泳及银染
供试品种PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(7)EST-SSR结果分析
利用EST-SSR引物HYC33对13份花椰菜品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出EST-SSR引物HYC33对13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据。
实施例2
(1)样品包括13份供试花椰菜品种杂交种。
(2)试剂：Promega公司生产的Master Mixes溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
(3)EST-SSR引物序列表如下：
(4)取样及DNA提取
对不同花椰菜品种进行随机取样，每个品种取单粒种子20颗，混合成为一个样本，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na2EDTA)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
(5)PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试品种模板DNA进行PCR扩增(仪器为AB VeritiPCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×MasterMixes5μL，BC5上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种基因组DNA模板(100ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存。
(6)凝胶电泳及银染
供试品种PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(7)EST-SSR结果分析
利用EST-SSR引物BC5对13份花椰菜品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出EST-SSR引物BC5对13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据。
实施例3
(1)样品包括13份供试花椰菜品种杂交种。
(2)试剂：Promega公司生产的Master Mixes溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
(3)EST-SSR引物序列表如下：
(4)取样及DNA提取
对不同花椰菜品种进行随机取样，每个品种取单粒种子20颗，混合成为一个样本，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na2EDTA)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
(5)PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试品种模板DNA进行PCR扩增(仪器为AB VeritiPCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×MasterMixes5μL，HYC10上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种基因组DNA模板(100ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存。
(6)凝胶电泳及银染
供试品种PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(7)EST-SSR结果分析
利用EST-SSR引物HYC10对13份花椰菜品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出EST-SSR引物HYC10对13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据。
实施例4
(1)样品包括13份供试花椰菜品种杂交种。
(2)试剂：Promega公司生产的Master Mixes溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
(3)EST-SSR引物序列表如下：
(4)取样及DNA提取
对不同花椰菜品种进行随机取样，每个品种取单粒种子20颗，混合成为一个样本，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na2EDTA)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
(5)PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试品种模板DNA进行PCR扩增(仪器为AB VeritiPCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×MasterMixes5μL，BC20上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种基因组DNA模板(100ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存。
(6)凝胶电泳及银染
供试品种PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(7)EST-SSR结果分析
利用EST-SSR引物BC20对13份花椰菜品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出EST-SSR引物BC20对13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据。
实施例5
(1)样品包括13份供试花椰菜品种杂交种。
(2)试剂：Promega公司生产的Master Mixes溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
(3)EST-SSR引物序列表如下：
(4)取样及DNA提取
对不同花椰菜品种进行随机取样，每个品种取单粒种子20颗，混合成为一个样本，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na2EDTA)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
(5)PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试品种模板DNA进行PCR扩增(仪器为AB VeritiPCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×MasterMixes5μL，BC28上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种基因组DNA模板(100ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存。
(6)凝胶电泳及银染
供试品种PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(7)EST-SSR结果分析
利用EST-SSR引物BC28对13份花椰菜品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出EST-SSR引物BC28对13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据。
从所得的数据可以看出，利用5对EST-SSR引物组成的组合标记可以将13份花椰菜品种完全区分开，利用这样一套高效、低成本、操作方便的花椰菜品种鉴别方法，可以有效的对花椰菜种子真伪进行监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为花椰菜品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术参考。

Claims (2)

1.用于花椰菜品种鉴定的EST-SSR引物，其特征在于，包括5对EST-SSR引物：
HYC33上游引物序列：5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3’，HYC33下游引物序列：5'-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3’BC5上游引物序列：5'-CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3’，BC5下游引物序列：5’-CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3’；HYC10上游引物序列：5’-CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3’，HYC10下游引物序列：5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3’；BC20上游引物序列：5’-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3’，BC20下游引物序列：5'-GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3’；BC28上游引物序列：5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3’，BC28下游引物序列：5'-GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3’。
2.一种采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)采用权利要求1所述的EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种花椰菜杂交种基因组DNA模板，浓度100ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性2min；32个扩增循环，94℃40sec，56℃45sec，72℃1min；72℃延伸7min，4℃保存；
(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40％PAG6mL，TEMED30μL，10％过流酰胺300μL；设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(3)通过分析EST-SSR结果，比较13份花椰菜品种间多态性位点的差异，确定引物的多态率及多态信息量；在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建13份花椰菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析5对引物是否可对13份花椰菜品种进行完全的区分，同时构建13份花椰菜品种的指纹图谱。
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