CN102586459B - 采用复合est-ssr标记进行大白菜品种鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法。该方法以12份大白菜杂交种的基因组DNA为模板，通过对大白菜EST序列的分析，合成了30对核心EST-SSR引物。经过筛选，得到2套标记组合完全鉴别了12份大白菜品种的差异，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，确认了这套技术和组合可以表达大白菜品种间的多态性，能够高效准确的对大白菜品种进行鉴定。本发明的检测方法在4h之内即可完成种子品种鉴定工作，具有高效、准确、低成本、操作方便等优势。可以有效的对大白菜种子真伪进行监控，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供了有力的技术手段。

Description

采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法

技术领域

本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及12份大白菜杂交种品种鉴定方法，是一种基于复合EST-SSR标记的高效进行大白菜品种鉴定的方法。

背景技术

随着植物育种和种子产业的发展，植物新品种保护（Protection of New Varieties of Plant，简称PVP）作为知识产权的10种内容之一，其重要性越来越突出。培育和推广新的优良品种是我国蔬菜育种发展的重要方向，因此新品种的准确鉴定不仅是新品种审定和保护的前提，也为辨别假冒伪劣种子，保护自身知识产权，维护育种家的切身利益提供保障和科学依据。因此，开发高效、准确的种子品种鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。

大白菜是原产于我国并广受欢迎的蔬菜，栽培面积极广，品种的差异直接影响这类蔬菜的生产和使用性能，因此对商用种子品种的鉴别尤为重要，同时新品种的登记测试以及资源种质遗传性分析都需要有别于传统的形态标记田间检测的更加高效、准确、低成本以及操作方便的分子水平品种鉴定方法。

近年来随着分子生物学的发展，各种分子标记技术在杂交种品种鉴定中得到了大量应用。遗传标记经过形态标记、细胞学标记、蛋白质标记发展到DNA标记。DNA标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映， 表现为核苷酸序列上的差异，因此标记在数量上几乎是无限的。与以往遗传标记相比，DNA标记还具有无表型效应，不受环境影响等优点， 广泛应用到种质资源研究、 遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等方面，成为理想的快速进行种子品种鉴定的检测方法之一，其中 RAPD、RFLP、AFLP、SSR 及ISSR 标记等在杂交种品种鉴定中都有应用。

简单重复序列 ( Simple sequence repeat，SSR)也叫微卫星 ( Microsatellites ) 。与其它分子标记技术相比，SSR 标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，已被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。根据建立 SSR 标记的序列性质不同，SSR 标记可分为基因组 SSR ( Genomic SSR，gSSR)和表达序列标签 SSR ( Expressed sequence tag SSR，EST-SSR)等。  

常规SSR分子标记开发需要构建基因组文库、制备探针和分子杂交等过程，极大地制约了其发展和应用。随着功能基因组学的迅速发展， Gen Bank 中积累了许多重要物种的大量 EST（expressed sequence tag）序列，这些序列已经成为发展 SSR 标记 （EST-SSR）的重要来源。与来自基因组中 SSR 标记相比，不仅具有基因组 SSR 标记的多态性高、共显性、重复性好的特点，而且开发成本相对低廉。同时EST-SSR 标记位于基因的转录部分， 因而与功能基因紧密连锁。目前 EST-SSR 标记已经应用于水稻 （Cho et al．，2000）、葡萄 ( Scott et al．，2000 )、小麦 (Gupta et al．，2003；Gao et al．，2004； Nicot et al．，2004 )、黑麦(Hackauf et al．，2002)、大麦( Thiel et al．，2003)和扁桃( Xu et al．，2004) 、玉米(Wang and Bowen, 1998) 、甘蔗(Cordeiro et al., 2001)等植物进行分子连锁图谱构建和遗传多样性分析。

发明内容

本发明的目的在于在分子标记最新研究成果的基础上，发展EST-SSR多重标记组合及其检测技术，扩大SSR标记的多态信息量，弥补其位点少的缺陷，一次扩增反应可以得到多个多态标记同时对大白菜多个品种进行鉴别。公开了一种采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

用于大白菜品种鉴定的EST-SSR引物, 其特征在于，包括Ⅰ套或Ⅱ套EST-SSR复合引物，其中的Ⅰ套EST-SSR复合引物包括:

BC1上游引物序列：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物序列： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；BC19上游引物序列：5’- TTGAAACTTGGTTGACGACG -3’，BC19下游引物序列： 5’- TTCTTCTTTGCGGCTGATTT -3’；BC26上游引物序列：5’- ATAACAACAACCTGCCCGAG -3’，BC26下游引物序列： 5’- GAAGCACAAGAACAGGGCTC -3’；

Ⅱ套EST-SSR复合引物，包括BC1上游引物序列：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物序列： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；BC9上游引物序列：5’- ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT -3’，BC9下游引物序列： 5’- TTTTGAACGAGGTGGAGGAC -3’；BC10上游引物序列：5’- GAATCCTTTGGAAACGACGA -3’，BC10下游引物序列： 5’- GGGGACACAATTCTCCTGAA -3’；BC16上游引物序列：5’- CTTGCAAATGACCTGCTTGA -3’，BC16下游引物序列： 5’- GGGAGTTGGAGATGAGGTGA -3’；BC27上游引物序列：5’- ATCCAAAAGGAAGAATCCCG -3’，BC27下游引物序列： 5’- AAACGAGAATTTTCCTGCGA -3’  。

本发明进一步公开了采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法，其特征在于按如下步骤的步骤进行：

（1）采用权利要求1所述的复合EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种大白菜杂交种基因组DNA模板，浓度50 ng/μL，1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为94℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 1 min，53.5℃ 45 sec，72℃ 45 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；

（2）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE 3 mL，40% PAG 6 mL，TMED 30 μL，10% 过流酰胺 300 μL；设定电压 250 V，电泳 1 h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；

（3）通过分析EST-SSR结果，比较12份大白菜品种间多态性位点的差异，确定2套复合引物的多态率及多态信息量；在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建12份大白菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析复合引物是否可对12份大白菜品种进行完全的区分，同时构建12份大白菜品种的指纹图谱；

其中所述的上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，指的是Ⅰ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物0.25μL、BC1下游引物0.25μL，BC19上游引物0.25μL、BC19下游引物0.25μL，BC26上游引物0.25μL、BC26下游引物0.25μL，或Ⅱ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物0.25μL、BC1下游引物0.25μL，BC9上游引物0.25μL、BC9下游引物0.25μL，BC10上游引物0.25μL、BC10下游引物0.25μL，BC16上游引物0.25μL、BC16下游引物0.25μL，BC27上游引物0.25μL、BC27下游引物0.25μL。

本方法通过对12份供试大白菜杂交种进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析，确认了这套技术和组合可以表达大白菜品种间的多态性，能够高效准确的对大白菜品种进行鉴定。用于对大白菜品种进行鉴定的2套复合EST-SSR引物组合如表1所示。

表1 引物序列表如下：

12份供试大白菜杂交种取样及DNA提取方法为：对基地农户进行随机取样，每个品种取单株10株，取靠近根部的嫩叶部分50～100 mg混合为一个样本，液氮冷冻研磨（Retsch MM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1 ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

供试大白菜杂交种PCR方法为：

(1)用于12份大白菜品种鉴定的Ⅰ套EST-SSR引物（BC1+BC19+BC26），包括BC1上游引物序列：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物序列： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；BC19上游引物序列：5’- TTGAAACTTGGTTGACGACG -3’，BC19下游引物序列： 5’- TTCTTCTTTGCGGCTGATTT -3’；BC26上游引物序列：5’- ATAACAACAACCTGCCCGAG -3’，BC26下游引物序列： 5’- GAAGCACAAGAACAGGGCTC -3’；

(2)用于12份大白菜品种鉴定的Ⅱ套EST-SSR引物（BC1+BC9+BC10+BC16+BC27），包括BC1上游引物序列：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物序列： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；BC9上游引物序列：5’- ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT -3’，BC9下游引物序列： 5’- TTTTGAACGAGGTGGAGGAC -3’；BC10上游引物序列：5’- GAATCCTTTGGAAACGACGA -3’，BC10下游引物序列： 5’- GGGGACACAATTCTCCTGAA -3’；BC16上游引物序列：5’- CTTGCAAATGACCTGCTTGA -3’，BC16下游引物序列： 5’- GGGAGTTGGAGATGAGGTGA -3’；BC27上游引物序列：5’- ATCCAAAAGGAAGAATCCCG -3’，BC27下游引物序列： 5’- AAACGAGAATTTTCCTGCGA -3’；

 (3) 采用上述SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL（Ⅰ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC19上游引物、BC19下游引物、BC26上游引物、BC26下游引物均等量混合各0.25μL；或Ⅱ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC9上游引物、BC9下游引物、BC10上游引物、BC10下游引物、BC16上游引物、BC16下游引物、BC27上游引物、BC27下游引物均等量混合各0.25μL），供试大白菜杂交种基因组DNA模板（50 ng/μL）1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为94℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 1 min，53.5℃ 45 sec，72℃ 45 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；

供试大白菜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40%（重量百分数） PAG 6 mL，TMED 30 μL，10% 过流酰胺 300 μL；设定电压 250 V，电泳 1 h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；

供试大白菜杂交种EST-SSR结果分析，比较12份大白菜品种间多态性位点的差异，确定2套复合引物的多态率及多态信息量。在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建12份大白菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析复合引物是否可对12份大白菜品种进行完全的区分，同时构建12份大白菜的指纹图谱。

本发明的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时2h，EST-SSR分析60-90min，所以本发明的检测方法在4h之内即可完成对大白菜品种的鉴定工作，同时采用复合标记扩大了SSR标记的多态信息量，弥补其位点少的缺陷，通过一次扩增反应就可以得到多个多态标记同时对大白菜多个品种进行鉴别，省去了非复合标记需要通过多个引物的多次扩增综合结果统计分析的过程，无论是在时间上还是成本上都充分提高了试验效率，具有快速、准确、低成本、操作方便等优势。同时本发明的检测方法可以有效的对大白菜种子真伪进行监控，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供了有力的技术手段。

为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

1、原理

本方法应用一种新型的核酸分析方法其原理是：EST-SSR是以1～6个碱基为重复单元，是存在于EST中的SSR。EST ( Expressed sequence tag，表达序列标签) 是将mRNA在体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其5’端或3’端进行测序后获得的长约150～500bp的表达序列片段。EST序列来自实验室构建的cDNA文库或从美国国家生物信息中心（NCBI）的Genbank中下载。采用相关软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，确定是否可对12份大白菜品种进行完全的区分。

2、引物设计

通过对大白菜EST序列的分析，合成了30对核心EST-SSR引物，由上海生工合成。经筛选获得了2套复合EST-SSR引物组合能够高效准确的对大白菜品种进行鉴定。

引物由上海生物工程公司合成。

表1 引物序列表如下：

3、取样及DNA提取

对基地农户进行随机取样，每个品种取单株10株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg混合为一个样本，液氮冷冻研磨（Retsch MM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1 ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

4、PCR反应

采用(1)用于12份大白菜品种鉴定的Ⅰ套EST-SSR引物（BC1+BC19+BC26），包括BC1上游引物序列：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物序列： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；BC19上游引物序列：5’- TTGAAACTTGGTTGACGACG -3’，BC19下游引物序列： 5’- TTCTTCTTTGCGGCTGATTT -3’；BC26上游引物序列：5’- ATAACAACAACCTGCCCGAG -3’，BC26下游引物序列： 5’- GAAGCACAAGAACAGGGCTC -3’；

(2)用于12份大白菜品种鉴定的Ⅱ套EST-SSR引物（BC1+BC9+BC10+BC16+BC27），包括BC1上游引物序列：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物序列： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；BC9上游引物序列：5’- ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT -3’，BC9下游引物序列： 5’- TTTTGAACGAGGTGGAGGAC -3’；BC10上游引物序列：5’- GAATCCTTTGGAAACGACGA -3’，BC10下游引物序列： 5’- GGGGACACAATTCTCCTGAA -3’；BC16上游引物序列：5’- CTTGCAAATGACCTGCTTGA -3’，BC16下游引物序列： 5’- GGGAGTTGGAGATGAGGTGA -3’；BC27上游引物序列：5’- ATCCAAAAGGAAGAATCCCG -3’，BC27下游引物序列： 5’- AAACGAGAATTTTCCTGCGA -3’；

SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增（仪器为AB Veriti PCR），其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试大白菜杂交种基因组DNA模板（50 ng/μL）1μL，双蒸水补足10 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 1 min，53.5℃ 45 sec，72℃ 45 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存。

5、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

供试大白菜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳（仪器为BIO-RAD电泳仪），非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40 % PAG 6 mL，TMED 30 μL，10% 过流酰胺 300 μL；上样1～2 μL，设定电压 250 V，电泳 1 h，关闭电源，进行染色；

染色过程（仪器为ORBITAL脱色摇床）：于600 mL超纯水中加入6 mL 10 %的硝酸银溶液，银染8～10 min；于600 mL超纯水中迅速水洗；于600 mL超纯水中加入9 g氢氧化钠粉末，溶解后加入3 mL 甲醛，显色数分钟，直至条带清晰即可；600 mL超纯水中再次水洗。

6、EST-SSR谱带分析

通过分析EST-SSR结果，比较12份大白菜品种间多态性位点的差异，确定2套复合引物的多态率及多态信息量。在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建12份大白菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析复合引物是否可对12份大白菜品种进行完全的区分，同时构建12份大白菜的指纹图谱。

本发明公开的采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种进行鉴定以现有技术相比所具有的积极效果在于：扩大了SSR标记的多态信息量，弥补其位点少的缺陷，通过一次扩增反应就可以得到多个多态标记同时对大白菜多个品种进行鉴别，省去了非复合标记需要通过多个引物的多次扩增综合结果统计分析的过程，无论是在时间上还是成本上都充分提高了试验效率，具有快速、准确、低成本、操作方便等优势。

附图说明:

图1为Ⅰ套复合EST-SSR引物用于12份大白菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为大白菜品种1～12；

图2为Ⅱ套复合EST-SSR引物用于12份大白菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为大白菜品种1～12；

图3为Ⅰ套复合EST-SSR引物用于12份大白菜品种扩增后EST-SSR谱带分析指纹图谱；

图4为Ⅱ套复合EST-SSR引物用于12份大白菜品种扩增后EST-SSR谱带分析指纹图谱。

具体实施方式

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1，其它用到的试剂均有市售。

实施例1

（1）样品包括4份供试大白菜品种杂交种1号～4号，产地天津。

（2）试剂：Promega公司生产的GoTaq? Master Mixes溶液；上海生工合成的Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物；

（3）Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物序列表如下：

（4）取样及DNA提取

对基地农户进行随机取样，每个品种取单株10株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg混合为一个样本，液氮冷冻研磨（Retsch MM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1 ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

（5）PCR反应

按上表所述的PCR扩增引物对供试品种模板DNA进行PCR扩增（仪器为AB Veriti PCR），其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL（Ⅰ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC19上游引物、BC19下游引物、BC26上游引物、BC26下游引物均等量混合各0.25μL；或Ⅱ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC9上游引物、BC9下游引物、BC10上游引物、BC10下游引物、BC16上游引物、BC16下游引物、BC27上游引物、BC27下游引物均等量混合各0.25μL），供试品种基因组DNA模板（50 ng/μL）1μL，双蒸水补足10 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 1 min，53.5℃ 45 sec，72℃ 45 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存。

（5）凝胶电泳及银染

    供试品种PCR产物上样1～2 μL，设定电压 250 V，电泳 1 h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；

（6）EST-SSR结果分析

利用Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物对4份大白菜品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物4份大白菜品种的SSR分析谱带数据。从所得的数据可以看出，Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物可以把这4份大白菜品种完全区分开，利用这样一套高效、低成本、操作方便的大白菜品种鉴别方法，可以有效的对大白菜种子真伪进行监控，为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供有力的技术手段。

实施例2

（1）样品包括4份供试大白菜品种杂交种5号～8号，产地天津。

（2）试剂：Promega公司生产的GoTaq? Master Mixes溶液；上海生工合成的Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物；

（3）Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物序列表如下：

（4）取样及DNA提取

对基地农户进行随机取样，每个品种取单株10株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg混合为一个样本，液氮冷冻研磨（Retsch MM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1 ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

（5）PCR反应

按上表所述的PCR扩增引物对供试品种模板DNA进行PCR扩增（仪器为AB Veriti PCR），其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL（Ⅰ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC19上游引物、BC19下游引物、BC26上游引物、BC26下游引物均等量混合各0.25μL；或Ⅱ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC9上游引物、BC9下游引物、BC10上游引物、BC10下游引物、BC16上游引物、BC16下游引物、BC27上游引物、BC27下游引物均等量混合各0.25μL），供试品种基因组DNA模板（50 ng/μL）1μL，双蒸水补足10 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 1 min，53.5℃ 45 sec，72℃ 45 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存。

（5）凝胶电泳及银染

    供试品种PCR产物上样1～2 μL，设定电压 250 V，电泳 1 h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；

（6）EST-SSR结果分析

利用Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物对4份大白菜品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物4份大白菜品种的SSR分析谱带数据。从所得的数据可以看出，Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物可以把这4份大白菜品种完全区分开，利用这样一套高效、低成本、操作方便的大白菜品种鉴别方法，可以有效的对大白菜种子真伪进行监控，为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供有力的技术手段。

实施例3

（1）样品包括4份供试大白菜品种杂交种9号～12号，产地天津。

（2）试剂：Promega公司生产的GoTaq? Master Mixes溶液；上海生工合成的Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物；

（3）Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物序列表如下：

（4）取样及DNA提取

对基地农户进行随机取样，每个品种取单株10株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg混合为一个样本，液氮冷冻研磨（Retsch MM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1 ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

（5）PCR反应

按上表所述的PCR扩增引物对供试品种模板DNA进行PCR扩增（仪器为AB Veriti PCR），其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL（Ⅰ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC19上游引物、BC19下游引物、BC26上游引物、BC26下游引物均等量混合各0.25μL；或Ⅱ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC9上游引物、BC9下游引物、BC10上游引物、BC10下游引物、BC16上游引物、BC16下游引物、BC27上游引物、BC27下游引物均等量混合各0.25μL），供试品种基因组DNA模板（50 ng/μL）1μL，双蒸水补足10 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 1 min，53.5℃ 45 sec，72℃ 45 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存。

（5）凝胶电泳及银染

    供试品种PCR产物上样1～2 μL，设定电压 250 V，电泳 1 h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；

（6）EST-SSR结果分析

利用Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物对4份大白菜品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物4份大白菜品种的SSR分析谱带数据。从所得的数据可以看出，Ⅰ套或Ⅱ套复合EST-SSR引物可以把这4份大白菜品种完全区分开，利用这样一套高效、低成本、操作方便的大白菜品种鉴别方法，可以有效的对大白菜种子真伪进行监控，为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供有力的技术手段。

SEQUENCE LISTING

 

<110> 天津市农业科学院中心实验室

 

<120> 采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法

 

<160>  16   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  1

tttgtcccta ttgctcaggg                                20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工学列

 

<400>  2

ccgagaacgt cttctccttg                                 20

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  3

ttgaaacttg gttgacgacg                                20

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  4

ttcttctttg cggctgattt                               20

  

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  5

ataacaacaa cctgcccgag                            20

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  6

gaagcacaag aacagggctc                           20

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  7

tttgtcccta ttgctcaggg                               20

 

 

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  8

ccgagaacgt cttctccttg                                 20

 

 

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  9

accttccgtc tctgggtctt                                20

 

 

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  10

ttttgaacga ggtggaggac                                20

 

 

<210>  11

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  11

gaatcctttg gaaacgacga                               20

 

 

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  12

ggggacacaa ttctcctgaa                            20

 

 

<210>  13

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  13

cttgcaaatg acctgcttga                              20

 

 

<210>  14

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  14

gggagttgga gatgaggtga                            20

 

 

<210>  15

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  15

atccaaaagg aagaatcccg                               20

 

 

<210>  16

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  16

aaacgagaat tttcctgcga                              20

 

Claims (2)

1.用于大白菜品种鉴定的EST-SSR引物, 其特征在于，它是由Ⅰ套或Ⅱ套EST-SSR复合引物组成，其中Ⅰ套EST-SSR复合引物为:

BC1上游引物：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；

BC19上游引物：5’- TTGAAACTTGGTTGACGACG -3’，BC19下游引物： 5’- TTCTTCTTTGCGGCTGATTT -3’；

BC26上游引物：5’- ATAACAACAACCTGCCCGAG -3’，BC26下游引物： 5’- GAAGCACAAGAACAGGGCTC -3’；

Ⅱ套EST-SSR复合引物为BC1上游引物：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；

BC9上游引物：5’- ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT -3’，BC9下游引物： 5’- TTTTGAACGAGGTGGAGGAC -3’；

BC10上游引物：5’- GAATCCTTTGGAAACGACGA -3’，BC10下游引物： 5’- GGGGACACAATTCTCCTGAA -3’；

BC16上游引物：5’- CTTGCAAATGACCTGCTTGA -3’，BC16下游引物： 5’- GGGAGTTGGAGATGAGGTGA -3’；

BC27上游引物：5’- ATCCAAAAGGAAGAATCCCG -3’，BC27下游引物： 5’- AAACGAGAATTTTCCTGCGA -3。

2.一种采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法，其特征在于按如下步骤的步骤进行：

（1）采用权利要求1所述的复合EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种大白菜杂交种基因组DNA模板，浓度50ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为94℃预变性5 min；35个扩增循环：94℃ 1 min，53.5℃ 45 sec，72℃ 45 sec；72℃延伸7 min；4℃保存；

（2）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE 3 mL，40%丙烯酰胺溶液6mL， TEMED30μL，10% 过硫酰胺 300μL；设定电压 250 V，电泳 1 h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；

（3）通过分析EST-SSR结果，比较12份大白菜品种间多态性位点的差异，确定2套复合引物的多态率及多态信息量；在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建12份大白菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析复合引物是否可对12份大白菜品种进行完全的区分，同时构建12份大白菜品种的指纹图谱；

其中所述的上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，指的是Ⅰ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物0.25μL、BC1下游引物0.25μL，BC19上游引物0.25μL、BC19下游引物0.25μL，BC26上游引物0.25μL、BC26下游引物0.25μL，或Ⅱ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物0.25μL、BC1下游引物0.25μL，BC9上游引物0.25μL、BC9下游引物0.25μL，BC10上游引物0.25μL、BC10下游引物0.25μL，BC16上游引物0.25μL、BC16下游引物0.25μL，BC27上游引物0.25μL、BC27下游引物0.25μL。

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