CN105483281A - 一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的snp分子标记及其鉴定方法 - Google Patents

一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的snp分子标记及其鉴定方法 Download PDF

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Abstract

一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的SNP分子标记及其鉴定方法，该鉴定方法利用糯玉米沪五彩花糯1号2b-RAD简并基因组测序而获得的9个SNP位点序列，并基于SNP位点序列设计9对AC-PCR引物，再通过PCR扩增技术，经琼脂糖凝胶电泳，对获得的指纹图谱进行分析，根据9个SNP位点的电泳带型鉴定是否为糯玉米沪五彩花糯1号。本发明需用的检测样品量少，方法简便快捷，鉴定结果准确，有很好的应用推广前景。

Description

一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的SNP分子标记及其鉴定方法
技术领域
本发明属于生物鉴别技术领域，具体涉及一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的SNP分子标记及其鉴定方法。
背景技术
糯玉米(ZeamaysL.certainakulesh)是玉米胚乳wx基因发生隐性突变而形成的一个具有丰富营养价值的特用玉米类型。我国是糯玉米的起源地，地方种质资源丰富，据统计中国国家种质库收录糯玉米种质超过900多份。糯玉米品种鉴定不仅有助于玉米种质资源的高效利用，同样对玉米品系的遗传多样性研究也具有重要意义。
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP在玉米基因组中分布广泛，在非编码区平均31bp存在1个SNP，而编码区则为124bp存在1个SNP。SNP分子标记具有分布广泛、遗传稳定、具代表性、易于实现自动化分析等优势。但由于测序成本高、分析技术要求高等原因，目前人们对地方种质资源进行全基因组水平的SNP等分子标记分析的研究仍然较少。
近年来兴起的限制性酶切位点相关DNA(Restriction-siteassociatedDNA,RAD)测序(RAD-seq)是一种利用限制性内切酶降低测序物种基因组复杂程度，反映部分基因组序列结构信息的测序技术。与单酶切RAD测序技术和双酶切RAD(DoubledigestRAD,ddRAD)测序技术相比，基于IIB型限制性内切酶的RAD(IIBdigestRAD,2b-RAD)测序技术具有酶切DNA片段大小一致、文库构建简单快速、标签密度易于调节、成本低廉、准确性高等优势。该技术已成功用于基因分型、高精度连锁图谱构建、群体遗传结构分析、动植物重要经济性状的QTL定位、系统演化分析和分子流行病学研究等领域。
沪五彩花糯1号是由上海市农业科学院和上海农科种子种苗有限公司以申W48为母本、申W93为父本选育而成的五彩鲜食糯玉米，具有重要的农业价值和商业价值。沪五彩花糯1号产量表现为单穗重240～260g，亩产去苞叶鲜穗净重880kg，比对照苏玉糯5号增产16.2％；其主要特征为株型半紧凑，株高210cm，穗位高90cm，花丝粉红色，果穗长锥型，穗长18.1cm，穗粗4.82cm，穗行数15行，行粒数30个，籽粒呈紫、白、黑、红、黄五色，从春播出苗至采收约81天，采收期比对照苏玉糯5号早3天，生育后期保绿度好，籽粒较大，排列整齐，皮薄，糯性好，口感柔软，鲜食适口性好。然而，目前关于沪五彩花糯1号品种鉴定、遗传多样性分子基础等研究尚未展开。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定沪糯玉米五彩花糯1号的SNP分子标记及其鉴定方法，该鉴定方法可快速鉴定某糯玉米品种是否为沪五彩花糯1号，简单、快速、高效，对研究沪五彩花糯1号的遗传多样性提供技术支持。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的SNP分子标记，所述SNP分子标记为利用沪五彩花糯1号2b-RAD简并基因组测序结果分析而获得，包括9个沪五彩花糯1号的SNP位点序列SNP1-SNP9，分子标记SNP1-SNP9的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-9所示，具体序列见表1。
表1
本发明所述分子标记SNP1上有SNP位点：2号染色体第174210522位，碱基为T；所述分子标记SNP2上有SNP位点：3号染色体第23901997位，碱基为A；所述分子标记SNP3上有SNP位点：4号染色体第174872548位，碱基为C；所述分子标记SNP4上有SNP位点：7号染色体第118919985位，碱基为A；所述分子标记SNP5上有SNP位点：8号染色体第36687100位，碱基为A；所述分子标记SNP6上有SNP位点：8号染色体第90708317位，碱基为T；所述分子标记SNP7上有SNP位点：9号染色体第7175034位，碱基为T；所述分子标记SNP8上有SNP位点：10号染色体第37080947位，碱基为A；所述分子标记SNP9上有SNP位点：10号染色体第89678307位，碱基为C。
本发明所述基于SNP分子标记的糯玉米沪五彩花糯1号的鉴定方法，其包括如下步骤：
1)根据上述SNP分子标记SNP1-SNP9分别设计引物对组合1-9，每个引物对组合包括两个引物对，具体核苷酸序列参见表2；
2)提取待鉴定样品的基因组DNA；
3)根据所述引物对组合1-9对待鉴定品种的基因组DNA进行PCR扩增；
4)对PCR扩增产物进行多态性鉴定
对步骤3)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据指纹图谱结果判定：若扩增产物的9个SNP位点的指纹图谱结果与下述结果完全一致，则待鉴定品种为糯玉米沪五彩花糯1号：
引物对组合1：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现124bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现143bp条带；
引物对组合2：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现130bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现149bp条带；
引物对组合3：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现294bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现313bp条带；
引物对组合4：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现323bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现342bp条带；
引物对组合5：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现101bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现120bp条带；
引物对组合6：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现134bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现153bp条带；
引物对组合7：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现207bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现226bp条带；
引物对组合8：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现131bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现150bp条带；
和引物对组合9：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现220bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现239bp条带。
表2
本发明还提供了所述SNP分子标记在鉴定糯玉米沪五彩花糯1号中的应用。
本发明使用的聚合酶链式(PCR)扩增体系为常规PCR体系，不需要特殊的PCR仪和特殊的反应试剂，任何公司生产的PCR仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可使用并达到试验目的。
本发明基于玉米基因组SNP位点序列设计9对AC-PCR引物组合(包括引物对组合1-9)，用以鉴定糯玉米沪五彩花糯1号，旨在快速鉴定某糯玉米品种是否为沪五彩花糯1号，具体是对待鉴定品种进行基因组DNA的提取，使用本发明设计的9对AC-PCR引物对组合对基因组DNA进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶系统成像拍摄，当天即可得到品种的鉴定结果，该方法高效、准确、可靠。
本发明利用9对引物组合，对基于聚合酶链式反应和琼脂糖凝胶电泳获得的指纹图谱进行分析，根据9个SNP位点的电泳带型，进而确定是否是沪五彩花糯1号。
本发明的有益效果：
本发明利用沪五彩花糯1号简并基因组测序获得SNP杂合位点，再基于该SNP杂合位点设计AC-PCR引物组合，通过常规PCR扩增技术，经琼脂糖凝胶电泳，即可将单碱基水平的突变转换成扩增片段的大小差异，从而达到鉴定的目的，样品用量少，周期短，鉴定结果准确，可重复性好。
本发明基于常规PCR扩增反应，利用将单碱基水平的突变转换成扩增片段的大小差异，可快速高效地在短时间内精确鉴定沪五彩花糯1号，方法简便、快捷，有很好的应用推广前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中引物对组合1扩增产物的PCR电泳图。
图2为本发明实施例2中引物对组合2扩增产物的PCR电泳图。
图3为本发明实施例2中引物对组合3扩增产物的PCR电泳图。
图4为本发明实施例2中引物对组合4扩增产物的PCR电泳图。
图5为本发明实施例2中引物对组合5扩增产物的PCR电泳图。
图6为本发明实施例2中引物对组合6扩增产物的PCR电泳图。
图7为本发明实施例2中引物对组合7扩增产物的PCR电泳图。
图8为本发明实施例2中引物对组合8扩增产物的PCR电泳图。
图9为本发明实施例2中引物对组合9扩增产物的PCR电泳图。
图1-图9中，泳道1、2为样品1(沪五彩花糯1号)，泳道3、4为样品2(申W48)，泳道5、6为样品3(申W93)，泳道7、8为样品4(沪紫黑糯1号)，泳道9、10为样品5(沪彩糯1号)，泳道11、12为样品6(沪玉糯3号)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Smbrook等分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中所用试剂均可从商业途径获得。所述凝胶电泳分析所用Marker为50bpDNAladder。
实施例1确定SNP分子标记
利用沪五彩花糯1号2b-RAD简并基因组测序获得SNP位点序列，包括9个沪五彩花糯1号的SNP位点序列SNP1-SNP9，每个SNP分子标记序列中均含有1个沪五彩花糯1号的SNP位点。分子标记SNP1-SNP9的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-9所示，具体SNP分子标记信息参见表3。
实施例2玉米沪五彩花糯1号的品种鉴定
利用该发明所设计的引物对组合对糯米品种沪五彩花糯1号、申W48、申W93、沪紫黑糯1号、沪彩糯1号、沪玉糯3号等基因组DNA样品进行品种鉴定及种质资源鉴定。
(1)设计引物
根据实施例1确定的如表3所示的SNP分子标记设计成对AC-PCR引物，所述AC-PCR引物包括引物对组合1-9，每个引物对组合均包括两个引物对，具体引物序列参见表2；
(2)提取基因组DNA
采用CTAB法提取待鉴定样品：样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6的任何器官或组织基因组DNA。
(3)PCR扩增
分别根据9对引物对组合1-9对待鉴定样品的基因组DNA进行PCR扩增，具体PCR扩增体系为：50-100ng基因组DNA模板，0.25μL5UrTaqDNA聚合酶，2.0μL的10×PCRBuffer(Mg2+)，2μL的2.0mMdNTPs，1.0μL的二甲基亚砜，0.5μL的10mM引物F，0.5μL的10mM引物R，无菌蒸馏水补至25μL。
所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
(4)鉴定
电泳检测：加入4μL上样缓冲液于步骤(3)得到的扩增产物中，在180V恒定电压强度下，经2％琼脂糖凝胶电泳15～20min，凝胶成像系统成像拍摄，具体结果如图1-9所示。图1-9中的泳道1、3、5、7、9和11中条带依次为引物对组合1-9中第1引物对的扩增片段电泳指纹图谱，泳道2、4、6、8、10和12中条带依次为引物对组合1-9中第2引物对的扩增片段电泳指纹图谱，不同玉米品种样品1-6在不同位点的扩增指纹图谱如下：
样品1的DNA样品扩增的电泳产物的指纹图谱结果如下(具体引物对扩增片段大小见表2)：
引物对组合1：如图1所示，第1引物对的扩增产物指纹图谱(泳道1)：出现124bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱(泳道2)：出现143bp条带；
引物对组合2：如图2所示，泳道1中出现130bp条带；泳道2中出现149bp条带；
引物对组合3：如图3所示，泳道1中出现294bp条带；泳道2中出现313bp条带；
引物对组合4：如图4所示，泳道1中出现323bp条带；泳道2中出现342bp条带；
引物对组合5：如图5所示，泳道1中出现101bp条带；泳道2中出现120bp条带；
引物对组合6：如图6所示，泳道1中出现134bp条带；泳道2中出现153bp条带；
引物对组合7：如图7所示，泳道1中出现207bp条带；泳道2中出现226bp条带；
引物对组合8：如图8所示，泳道1中出现131bp条带；泳道2中出现150bp条带；
引物对组合9：如图9所示，泳道1中出现220bp条带；泳道2中出现239bp条带。
样品2(申W48)的DNA样品扩增的电泳产物如下：
1)8个引物对组合：均有如表2所示的片段条带，这8个引物对组合分别为引物对组合1、2、4-9，如图1、2、4-9所示；2)引物对组合3：泳道3中未有条带，泳道4中存在条带，如图3所示。
样品3(申W93)的DNA样品扩增的电泳产物如下：
1)4个引物对组合：均有如表2所示的片段条带，这4个引物对组合分别为引物对组合2、6-8，如图2、6-8所示；2)引物对组合3：泳道6中未有条带，泳道5中存在条带，如图3所示；3)引物对组合1、4、5：泳道5和泳道6中均未有条带，如图1、4、5所示；5)引物对组合9：泳道5和6中存在非特异性条带，如图9所示。
样品4(沪紫黑糯1号)DNA样品扩增电泳产物为：
1)7个引物对组合：在泳道7和8中均有如表2所示的片段条带，这7个引物对组合分别为引物对组合1-3、6-9，如图1、2、3、6-9所示；2)引物对组合4、5：泳道7和8中均未有条带，如图4-5所示。
样品5(沪彩糯1号)的DNA样品扩增电泳产物为：
1)8个引物对组合：在泳道9和10中均有如表2所示的片段条带，这8个引物对组合分别为引物对组合1-6、8、9，如图1-6、8、9所示；2)引物对组合7：泳道9中存在条带，泳道10中未有条带，如图7所示。
样品6(沪玉糯3号)的DNA样品扩增电泳产物为：
1)8个引物对组合：在泳道11和12中均有如表2所示的片段条带，这8个引物对组合分别为引物对组合1-6、8-9，如图1-6、8-9所示；2)引物对组合7：泳道12中未有条带，泳道11中存在条带，如图7所示。
可见，样品1扩增的电泳产物与表2中指纹图谱结果完全一致，则样品1为沪五彩花糯1号。
同时，由图1-9可知，在上述9对引物对组合扩增时，沪五彩花糯1号的DNA样品均能在不同位点上扩增出预期产物大小差异带型，各引物对组合中第1引物对的扩增产物指纹图谱中条带位置比第1引物对中条带位置小19bp，可见，沪五彩花糯1号在9个位点均为杂合基因型，因此，本发明确定的SNP1-9分子标记，具有明显的品种特异性，可以将沪五彩花糯1号与其亲本及其他玉米材料进行品种区分，也为其遗传组成多样性和优质形成的分子基础研究提供了基本数据。
由上述结果可知，同一玉米品种在9个SNP位点上表现出的基因型是不一样的，沪五彩花糯1号会出现预期大小(如表2所示)的片段条带，通过对所有SNP位点带型的读取记录和统计，可以确定样品是否为沪五彩花糯1号。且利用本发明的9对引物对组合可以对沪五彩花糯1号进行准确的鉴定，若仅单独某个引物对进行鉴定，则鉴定结果不具有说服力。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
*SNP位点是指测序序列与玉米B73参考基因组相比的多态性位点。

Claims (4)

1.一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括分子标记SNP1-SNP9，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-9所示，具体如下：
2.一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的特异引物对，其特征在于，所述特异引物对包括引物对组合1-9，每个引物对组合均含有两个引物对，其核苷酸序列如下：
3.一种基于SNP分子标记的糯玉米沪五彩花糯1号的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)根据权利要求1所述的SNP分子标记分别设计如权利要求2所述的引物对组合1-9；
2)提取待鉴定品种的基因组DNA；
3)根据所述引物对组合1-9分别对待鉴定品种的基因组DNA进行PCR扩增；
4)对PCR扩增产物进行多态性鉴定
对步骤3)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据指纹图谱结果判定：若扩增产物的指纹图谱结果与下述结果完全一致，则待鉴定品种为糯玉米沪五彩花糯1号：
引物对组合1：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现124bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现143bp条带；
引物对组合2：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现130bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现149bp条带；
引物对组合3：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现294bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现313bp条带；
引物对组合4：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现323bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现342bp条带；
引物对组合5：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现101bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现120bp条带；
引物对组合6：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现134bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现153bp条带；
引物对组合7：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现207bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现226bp条带；
引物对组合8：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现131bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现150bp条带；
和引物对组合9：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现220bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现239bp条带。
4.如权利要求1所述SNP分子标记在鉴定糯玉米沪五彩花糯1号中的应用。
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