CN107619875B

CN107619875B - 一种用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点、引物及应用

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Publication number: CN107619875B
Application number: CN201710943458.4A
Authority: CN
Inventors: 刘文革; 赵胜杰; 路绪强; 何楠; 豆峻岭
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2037-10-11
Also published as: CN107619875A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点、引物及应用，属于生物技术领域。所述的插入缺失位点位于西瓜基因组97103的第3号染色体的第26847023位核苷酸到第26847181位核苷酸共计159bp的区域，插入缺失区域的序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明还公开了一种用于鉴定西瓜果实形状的PCR扩增引物对，一种鉴定西瓜果实形状的方法及其应用。本发明的插入缺失标记位点，是基于候选基因开发出来的与果实长圆紧密连锁的插入缺失分子标记，利用该插入缺失标记能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜果实形状，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

Description

一种用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点、引物及应用

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点、引物及应用，属于生物技术领域。

背景技术

选择是育种中最重要的环节之一，它是指在一个群体中选择符合要求的基因型来进行后续的培育。然而在传统的育种过程中，由于很难获知后代的基因型，因此选择的依据通常是植株的表现型而非基因型。这种选择往往耗时较长且可能与基因型有偏差，造成选择的不准确性和效率低下。而利用分子标记辅助育种可以快速检测到目标基因或者与目标性状基因紧密连锁的位点，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。可作为鉴别亲本亲缘关系，回交育种中数量性状和隐性性状的转移、杂种后代的选择、杂种优势的预测及品种纯度鉴定等各个育种环节的辅助手段。

西瓜是世界十大水果之一，而我国是世界第一西瓜生产大国，然而现阶段我国西瓜育种主要仍是以传统育种为主，分子标记辅助育种应用较少。早在上世纪四十年代Weetman等人通过分离群体试验认为西瓜果实长圆受单基因控制。Yao Cheng等人通过构建西瓜遗传连锁图谱，将西瓜长圆定位到第5号连锁群，但遗传图谱和物理图谱有一定差异，因此未得到控制果实长圆的候选基因，也未开发出紧密连锁的标记(详见：Yao Cheng，etal.Construction of a genetic linkage map of watermelon(Citr ullus lanatus)using CAPS and SSR markers and QTL analys is for fruit qualitytraits.Scientia Horticulturae[J]，2016,202:25-31)。若得到相关性状的候选基因，基于候选基因开发的分子标记将大大提高分子标记辅助选择的准去性和有效性。因为分子标记辅助选择有两个重要的前提，首先必须得到与目标性转紧密连锁的标记，其次检测要求自动化，由于分子标记辅助选择要求对大规模群体进行，因此检测应当快速、低成本、准确性高。

目前，园艺作物中关于果实形状的研究大多都是定位到某一个位点，未能得到候选基因，而西瓜中关于果实长圆的研究鲜有报道。西瓜果实形状的选育大多还是通过传统的杂交育种来进行表型鉴定，选育效率低下。因此开展西瓜果实长圆的研究，确定控制西瓜果实长圆的候选基因，基于候选基因开发紧密连锁的标记可以为西瓜分子辅助育种提供有效的帮助，同时大大缩短育种进程并提高选择的准确性。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点。本发明的插入缺失标记位点，是基于候选基因开发出来的与果实长圆紧密连锁的插入缺失分子标记，利用该插入缺失标记能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜果实形状，通过其在育种进程中的运用可以大大加快西瓜果实形状选择育种的进程，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点，所述的插入缺失位点位于西瓜基因组97103的第3号染色体的第26847023位核苷酸到第26847181位核苷酸共计159bp的区域，插入缺失区域的序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本发明的插入缺失标记位点能够对西瓜果实形状进行大规模鉴定，不仅快速有效，而且在苗期就可以进行鉴定，大大缩短了育种的周期，可以在生产中大规模应用。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述插入缺失区域在长形西瓜中缺失，在圆形西瓜中插入。

本发明的目的之二，是提供一种用于鉴定西瓜果实形状的PCR扩增引物对。本发明的PCR扩增引物对，特异性强，只能够用于鉴定西瓜果实形状，并且在鉴定过程中灵敏度高，不受环境因素的影响，可广泛应用于西瓜果实形状的鉴定，并且可在育种过程中广泛应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于鉴定西瓜果实形状的PCR引物对，所述引物对中的上游引物是根据西瓜基因组97103的第3号染色体的第26847023位核苷酸及其上游序列进行设计，所述引物对中的下游引物是根据西瓜基因组97103的第3号染色体的第26847181位核苷酸的下游序列进行设计。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述引物对由如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的两条单链DNA组成。

本发明的目的之三，是提供一种用于鉴定西瓜果实形状的方法。本发明的用于鉴定西瓜果实形状的方法，采用上述PCR扩增引物对，对需要鉴定的植株DNA进行PCR扩增，通过扩增片段的大小就能鉴定出西瓜果实的大小，该方法适用于西瓜各个时期对西瓜果实形状的鉴定，并且准确性高，方便快捷。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种鉴定西瓜果实形状的方法，包括如下步骤：

(1)提取西瓜组织的DNA；

(2)PCR扩增：利用权利要求3所述的PCR扩增引物对，对待测样品进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，在525bp有条带，即为长形西瓜；在684bp有条带，即为圆形西瓜。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：DNA 2μL、2×PCR Mix 12.5μL、上游引物1.25μL、下游引物1.25μL、灭菌蒸馏水8μL，总体积25μL。

进一步，步骤(2)所述PCR扩增的条件为：95℃、5min；94℃、30s,57℃、30s,72℃、50s,共35个循环；72℃、10min；4℃保存。

本发明的目的之四，是提供上述用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点的应用。本发明的用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点，可以应用于西瓜果实形状分子标记辅助选择育种中，用于鉴定西瓜果实长形或圆形。在西瓜果实形状选择育种过程中，往往要产生大量的分离群体，采用该插入缺失标记，可以在苗期中鉴定出所需要的植株，不仅减少了育种过程中的占地面积，通过也减少果实成熟期鉴定所需的人力物力，大大提高育种的效率。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点在西瓜果实形状分子标记辅助选择育种中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明的插入缺失标记位点，是基于候选基因开发出来的与果实长圆紧密连锁的插入缺失分子标记，利用该插入缺失标记能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜果实形状，通过其在育种进程中的运用可以大大加快西瓜果实形状选择育种的进程，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

(2)本发明的PCR扩增引物对，特异性强，只能够用于鉴定西瓜果实形状，并且在鉴定过程中灵敏度高，不受环境因素的影响，可广泛应用于西瓜果实形状的鉴定，并且可在育种过程中广泛应用。

(3)本发明的用于鉴定西瓜果实形状的方法，采用上述PCR扩增引物对，对需要鉴定的植株DNA进行PCR扩增，通过扩增片段的大小就能鉴定出西瓜果实的大小，该方法适用于西瓜各个时期对西瓜果实形状的鉴定，并且准确性高，方便快捷。

(4)本发明的用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点，可以应用于西瓜果实形状分子标记辅助选择育种中，用于鉴定西瓜果实长形或圆形。在西瓜果实形状选择育种过程中，往往要产生大量的分离群体，采用该插入缺失标记，可以在苗期中鉴定出所需要的植株，不仅减少了育种过程中的占地面积，通过也减少果实成熟期鉴定所需的人力物力，大大提高育种的效率。

附图说明

图1为根据插入缺失位点设计的引物在长形西瓜和圆形西瓜亲本中的PCR扩增电泳图。M为DL2000Marker，从上到下的条带依次代表2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1为圆形西瓜PCR扩增电泳条带；2为长形西瓜PCR扩增电泳条带。

图2为部分F2群体的PCR扩增电泳图。M为DL2000Marker；Y为圆形西瓜亲本PCR扩增电泳条带；2为长形西瓜亲本PCR扩增电泳条带；F2为部分F2群体的PCR扩增电泳条带，两条带的为杂合植株(椭圆形西瓜)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1插入缺失位点的获得

1、全基因组重测序

本发明以中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜种质资源中期库挑选的315份西瓜种质资源为样品，采用常规CTAB法提取样品的DNA，并通过Illumina Hi Seq 2000测序仪对315份西瓜种质进行重测序，得到2.3T数据，平均覆盖西瓜基因组85.42％，平均测序深度9.24X。根据测序得到的50-150reads，与西瓜参考基因组97103(http://cucurbitgenomics.org/organism/1)进行比对，鉴定出4661625个SNP位点，利用这些SNPs对这315份西瓜种质进行GWAS(全基因组关联分析)，得到了和西瓜果实形状相关的候选区间位于西瓜基因组第3号染色体的第25662738位核苷酸和第27943020位核苷酸之间。

2、杂交群体的BSA(混池重测序)

本发明还利用一个长形西瓜和一个圆形西瓜纯合亲本进行杂交，配制出一个包含长形西瓜和圆形西瓜的F2分离群体，从F2代分离群体中挑选出长形西瓜和圆形西瓜各30株，分别提取DNA后将30株长形西瓜DNA混合在一起，30株圆形西瓜DNA混合在一起。利用Illumina Hi Seq 2000测序仪对其进行测序，得到25G数据，与西瓜参考基因组97103(http://cucurbitgenomics.org/organism/1)进行比对。鉴定出300266个SNP位点，利用这些SNPs进行生物信息学分析计算SNP-index值，得到了和西瓜果实形状相关的候选区间位于西瓜基因组3号染色体的23085963位核苷酸和28827894位核苷酸之间。

3、获得插入缺失位点

根据上述所得的SNPs自主开发CAPS标记，结合果实形状在上述F2分离群体中进行候选基因的定位，最终得到控制西瓜果实形状的候选基因位于西瓜基因组3号染色体的26817672位核苷酸和26863814位核苷酸之间。该区间包含四个功能基因，在此区间中鉴定出26847023位核苷酸到26847181位核苷酸之间有一个159bp的插入缺失区域。

实施例2利用该插入缺失位点鉴定西瓜果实形状的方法

1、提取西瓜组织的DNA

采用常规CTAB法提取西瓜样品组织的DNA，去除RNA，DNA样品体积不低于50μL。用紫外分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量以及OD260/280的比值。DNA样品纯度OD260/280值应在1.8-2.0，浓度稀释至100ng/μL。

2、引物设计

根据西瓜基因组3号染色体第26847023位核苷酸上游300bp序列设计上游引物，第26847181位核苷酸下游300bp序列设计下游引物。序列信息详见序列表。

引物由生物技术公司合成后，稀释至10μM后备用。引物序列见表1。

表1 引物序列

3、PCR反应体系

按照标准流程进行PCR反应程序，PCR反应体系如表2所示。

表2 PCR反应体系

PCR扩增程序为：95℃、5min；94℃、30s,57℃、30s,72℃、50s,共35个循环；72℃、10min；4℃保存。

4、回收

配制1％的琼脂糖凝胶，对PCR扩增产物进行电泳检测，将图1中的电泳条带进行胶回收。

5、连接

将回收的PCR产物连接到ptopo载体上，进行连接，连接体系如表3所示。

表3 连接体系

样品混匀后，室温放置5min进行连接反应。

6、转化

将连接产物转化至TOP 10感受态细胞，涂板在100mg·L^-1Amp培养基上，然后37℃过夜培养，将长出的菌落放在LB培养基上进行培养，经过菌液测序得到PCR扩增的完整序列。在525bp有条带，即为长形西瓜；在684bp有条带，即为圆形西瓜。

经过和西瓜全基因组序列比对，长形西瓜在第3号染色体的第26847023位核苷酸到第26847181位核苷酸之间有一个159bp的缺失区域，而圆形西瓜在此区域没有缺失，因此该区域可以作为鉴定西瓜果实长或圆的标记位点。

实施例3利用该插入缺失标记位点对2个杂交群体进行果实形状表型鉴定的验证

1、实验材料的选择

以中国农业科学院郑州果树研究所多倍体西瓜育种课题多年育种配制的两个杂交组合的F2群体共778个单株为实验材料，具体如表4所示。

表4 杂交群体的名称及群体大小信息

2、利用该插入缺失标记位点对这两个群体进行鉴定

以本发明得到的西瓜3号染色体上和西瓜果实形状相关的插入缺失位点标记对778个F2单株的果实形状进行鉴定，具体鉴定方法参照实施例2中的方法。琼脂糖凝胶电泳检测的部分结果见图2。鉴定结果表明，F2群体的表型和由该插入缺失鉴定的结果相一致，准确性达到100％。

实施例4利用该插入缺失标记位点对105份不同西瓜种质资源进行果实形状鉴定的验证

1、实验材料的选择

以中国农业科学院郑州果树研究所国家西甜瓜种质资源中期库随机挑选的105份西瓜种质资源为实验材料，其中圆形西瓜95份，长形或椭圆形西瓜10份，具体品种以及表型见表5。

表5 105份西瓜种质资源的名称以及表型

2、利用该插入缺失标记位点对这105份西瓜种质资源进行鉴定

以本发明得到的西瓜3号染色体上和西瓜果实形状相关的插入缺失位点标记对105份西瓜种质资源的果实形状进行鉴定，具体鉴定方法参照实施例2中的方法。鉴定结果表明，该标记对圆形西瓜鉴定的准确率为100％，对长形西瓜瓜鉴定的准确率为80％。

综上所述，本发明的插入缺失标记位点能够对西瓜果实形状进行大规模鉴定，不仅快速有效，而且在苗期就可以进行过鉴定，大大缩短了育种的周期，可以在生产中大规模应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于鉴定西瓜果实形状的PCR扩增引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物是根据西瓜基因组97103的第3号染色体的第26847023位核苷酸及其上游序列进行设计，所述引物对中的下游引物是根据西瓜基因组97103的第3号染色体的第26847181位核苷酸的下游序列进行设计，所述引物对由如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的两条单链DNA组成。

2.一种鉴定西瓜果实形状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取西瓜组织的DNA；

(2)PCR扩增：利用权利要求1所述的PCR扩增引物对，对待测样品进行PCR扩增；

3.根据权利要求2所述的一种鉴定西瓜果实形状的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：DNA 2μL、2×PCR Mix 12.5μL、上游引物1.25μL、下游引物1.25μL、灭菌蒸馏水8μL，总体积25μL。

4.根据权利要求2所述的一种鉴定西瓜果实形状的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的条件为：95℃、5min；94℃、30s,57℃、30s,72℃、50s,共35个循环；72℃、10min；4℃保存。