CN108411026B

CN108411026B - 一种菊花托桂花型分子标记辅助选择的方法

Info

Publication number: CN108411026B
Application number: CN201810483506.0A
Authority: CN
Inventors: 张飞; 仰小东; 苏江硕; 王海滨; 房伟民; 陈素梅; 陈发棣
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN108411026A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开一种菊花托桂花型分子标记辅助选择方法，所述的分子标记为SRAP分子标记或/和SCAR标记，本发明以托桂型切花小菊品种‘南农雪峰’为母本和非托桂型品种‘QX096’为父本杂交获得的80株F₁分离群体为试材。用SRAP分子标记来筛选与控制托桂花型基因相连锁的特异位点。其中SRAP分子标记引物组合M11E1在托桂型菊花材料中扩增得到一条272bp的特异片段，通过设计特异SCAR分子标记引物在托桂材料中扩增出单一的168bp的条带，进一步在‘南农雪峰’×‘QX096’和‘南农雪峰’×‘蒙白’两个群体中验证，准确率分别高达92.5％和84.3％。说明上述标记已成功转化成SCAR分子标记。该发明提高了托桂花型的选择效率，加快托桂花型菊花新品种的选育进程。

Description

一种菊花托桂花型分子标记辅助选择的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种菊花托桂花型分子标记辅助选择的方法。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)原产我国，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，在花卉产业中占据重要地位(戴思兰，2004)。托桂是菊花重要花型之一，其主要特征为：中央的管状花特别发达，管状小花伸长，顶端花冠筒开裂犹如托起的桂花(Chen等，2009)。因托桂型菊花花型奇特，且管状花和舌状花均可呈现不同颜色，具有极高的观赏价值和经济价值，且广受好评。近年来，托桂花型菊花新品种的选育已成为菊花育种的重要方向之一。

随着分子生物学、分子标记技术的迅速发展，分子标记辅助选择(molecularmarker assisted selection，MAS)在植物育种中得以广泛应用。分子标记为植物遗传图谱构建、农艺性状关联分析、遗传多样性研究、基因定位、和杂种优势利用等方面提供了重要的技术手段。SRAP等标记因操作步骤繁琐，需要较高的试验技能，且成本较高，很难直接应用于图位克隆和分子辅助选择。相关序列特异性扩增区域(SCAR)标记是根据其他遗传标记的片段序列，合成一对特异性引物，对基因组进行扩增。SCAR标记是一种十分稳定的分子标记，具有迅速、简便、低成本的特点。该方法在枣椰树(Dhawan等，2013)、芹菜(Han等，2012)、洋葱(Yang等，2013)、木薯(Olasanmi等，2014)等作物中也有相关报道，能快速鉴定农艺性状和进行抗性评价，大大提高育种效率。

目前，关于菊花观赏性状相关的分子标记多有报道。赵静媛等(2009a，2009b)等通过集团分离分析(bulked segregant analysis，BSA)开发了地被小菊匍匐性状的RAPD-SCAR分子标记。近年，陈素梅等(2015)通过连锁作图的方法筛选获得了一些托桂型菊花花器性状关联的分子标记，但是该标记受环境筛选到了4对受环境影响较小贡献率较大的主效QTL及其相关分子标记，该标记对托桂相关花器性状表型变异的贡献率较小，且易受环境影响，暂时难以直接用于托桂花型的分子标记辅助选择。因此，国内外暂无关于直接用于菊花托桂花型分子标记辅助选择的分子标记。本发明将通过BSA方法获得与控制托桂花型的基因相连锁的分子标记转化为更稳定有效的SCAR标记，进一步为菊花托桂花型分子标记辅助选择和新品种培育提供重要技术支持。

主要参考文献：

Chen FD,Li FT,Chen SM,et al.Meiosis and pollen germinability insmall-flowered anemone type chrysanthemum cultivars[J].Plant Systematics andEvolution,2009,280(3):143-151

Dhawan C,Kharb P,Sharma R,et al.Development of male-specific SCARmarker in date palm (Phoenix dactylifera,L.)[J].Tree Genetics and Genomes,2013,9(5):1143-1150.

Han Q,Wang S,Yang W,et al.Inheritance of white petiole in celery anddevelopment of a tightly linked SCAR marker[J].Plant Breeding,2012,131(2):340–344.

Olasanmi B,Akoroda M O,Okogbenin E,et al.Bulked segregant analysisidentifies molecular markers associated with early bulking in cassava(Manihotesculenta Crantz)[J].Euphytica,2014,195(2):235-244.

Yang Y Y,Huo Y M,Miao J,et al.Identification of two SCAR markers co-segregated with the dominant Ms and recessive ms alleles in onion(Allium cepaL.)[J].Euphytica,2013,190(2):267-277.

陈素梅,唐海强,种昕冉,等.一种托桂型菊花花器性状关联分子标记筛选方法及应用,CN104313155A[P].2015.

戴思兰.中国菊花与世界园艺(综述)[J].河北科技师范学院学报,2004,18(2):1-5.

赵静媛,陈发棣,滕年军,等.地被菊匍匐性的遗传分析与RAPD标记研究[J].中国农业科学,2009a,42(2):734-741.

赵静媛,陈素梅,陈发棣.与地被菊株型匍匐性连锁RAPD标记的SCAR转化[J].林业科学,2009b,45(9):147-150.

发明内容

本发明的目的是筛选出与控制菊花托桂花型基因紧密连锁的分子标记及其应用，建立托桂花型的分子标记辅助选择技术，为在菊花育种过程中快速准确选择托桂花型提供新方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种与控制菊花托桂花型基因相连锁的分子标记，该分子标记为SRAP分子标记或/和SCAR标记，其中，

所述SRAP分子标记的引物组合M11E1序列为：

正向引物序列为：5’-TGAGTCCAAACCGGACA-3’

反向引物序列为：5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’；

所述SCAR标记的引物SCAR₁₆₈序列为：

上游引物序列：5’-GCAAGTTGGAAACACCTAA-3’

下游引物序列：5’-AAGATGAAGGTACATGCA-3’。

一种与控制菊花托桂花型基因相连锁分子标记的引物，所述的分子标记为SRAP分子标记或/和SCAR标记，其中，

所述SRAP分子标记的引物组合M11E1序列为：

正向引物序列为：5’-TGAGTCCAAACCGGACA-3’

反向引物序列为：5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’；

所述SCAR标记的引物SCAR₁₆₈序列为：

上游引物序列：5’-GCAAGTTGGAAACACCTAA-3’

下游引物序列：5’-AAGATGAAGGTACATGCA-3’。

上述的分子标记及上述的引物在菊花托桂花型分子标记辅助选择或托桂花型菊花育种中的应用。

一种菊花托桂花型分子标记辅助选择方法，采用上述的引物扩增菊花育种材料的基因组DNA，如能扩增出一条262bp或/和168bp的特异片段，则表明菊花育种材料为托桂花型。

一种与控制菊花托桂花型基因相连锁分子标记的筛选方法，该方法包括如下步骤：

用SRAP分子标记的引物，

正向引物序列为：5’-TGAGTCCAAACCGGACA-3’

反向引物序列为：5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’

扩增托桂花型切花小菊或育种材料，如能扩增出一条262bp的特异片段，则表明该标记可能与控制菊花托桂性状的基因相连锁；

或者用SCAR标记的引物，

上游引物序列：5’-GCAAGTTGGAAACACCTAA-3’

下游引物序列：5’-AAGATGAAGGTACATGCA-3’

扩增托桂花型切花小菊或育种材料，如能扩增出一条168bp的特异片段，则表明该标记可能与控制菊花托桂花型的基因相连锁。

作为一种优选技术方案，所述SRAP分子标记的引物组合M11E1和SCAR标记的引物是通过以下方法筛选获得的：

1)全基因组DNA提取：

以托桂花型切花小菊作母本，非托桂花型切花小菊作父本进行杂交获得F₁杂交后代，观察并记录双亲与F₁代植株的花型性状，进行分子标记的筛选及连锁分析；提取亲本及其F₁杂交后代的基因组DNA稀释后保存备用；

2)基因池构建：

根据集团分离分析法原理，分别从F₁分离群体中选择极端托桂花型和非托桂花型株系各10株，将稀释的基因组DNA分别等量混合构成托桂花型基因池和非托桂花型基因池；

3)特异SRAP分子标记引物的筛选：

以双亲、托桂花型基因池和非托桂花型基因池的DNA为模板，设计多对SRAP分子标记引物进行SRAP-PCR反应筛选得到特异引物组合M11E1(该特异性引物仅能在托桂花型亲本品种和托桂花型基因池中扩增获得清晰、单一的特异条带)；SRAP-PCR产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得与控制菊花托桂花型基因相连锁的特异SRAP分子标记；

4)将SRAP分子标记转化为SCAR标记：

从聚丙烯酰胺凝胶上切取特异条带作模板进行PCR扩增，引物组合和扩增程序与步骤(3)相同，扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳；采用DNA琼脂糖凝胶提取试剂盒回收并纯化扩增产物，在pMD19-T载体中进行克隆，最后，重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α，选择阳性单克隆DNA片段进行生物测序，根据SRAP标记特异片段序列，设计1对SCAR引物，其中上游引物序列为5′-GCAAGTTGGAAACACCTAA-3′，下游引物序列为5′-AAGATGAAGGTACATGCA-3′，利用设计的特异引物进行SCAR扩增，SCAR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，得到特异性片段168bp，从而获得一个与菊花托桂花型控制基因相连锁的SCAR标记，并命名为SCAR₁₆₈。

步骤(3)中，设计的多对SRAP分子标记引物的上游引物和下游引物的序列如下表所示：

以表中的25条正向引物和20条反向引物组成500对SRAP分子标记引物。

步骤(3)中所述SRAP-PCR反应的混合液总体积为10μl，其中包括10×PCR Buffer1.0μl，3mM Mg²⁺，200μM dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，10μM SRAP引物和25ng模板DNA；所述SRAP-PCR反应的程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，12℃保存。

步骤(4)中所述SCAR扩增的25μl反应体系中含有50ng模板DNA，上下游引物分别为0.3μmol·L^-1和0.25mmol·L^-1，1U Taq DNA聚合酶和2.5μl 10×PCR buffer，余下用ddH₂O补足；所述SCAR扩增的反应程序为：94℃5min预变性；然后94℃1min，57℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min；12℃保温。

步骤(4)中所述阳性单克隆DNA片段的序列为：

TGAGTCCAAACCGGACACCCCTTAGGAATTTACAATCACTAGGAAGTATATATATGCAAGTTGGAAAC ACCTAAATAAACCAACAATGAGGATGAAGAATAGTTTTAAGCAAAACTGAAGAAAAAAAAAAAAAAAGAACTAGCTAAATGTAGATAAACCAAAATTCCCCATATGCCATGATCACTTTTTTCCCCTACTGCATGTACCTTCATCTTCAGCACCTGAAATGCATTTTATTCAGTAAGCTTGGTAACATTAATTCGTACGCAGTC(272bp)。

本发明的有益效果：

本发明以托桂花型切花小菊品种‘南农雪峰’和非托桂花型切花小菊品种‘QX096’及其80个杂交F₁代单株作为实验材料，构建极端托桂花型和非托桂花型基因池，筛选菊花托桂花型分子标记，建立相关分子标记辅助选择体系。与目前技术相比，其优点是：

(1)标记稳定。本研究以分离F₁为材料，分别选取10个极端株系，构建托桂花型和非托桂花型基因池，鉴定出4个SRAP位点与菊花托桂花型相关基因连锁，并将其中一个转化为更稳定的SCAR标记，用该标记对全部80个不同托桂花型的F₁株系(基因型)进行检测，表明该标记表现稳定，不受环境条件的影响。

(2)分子标记辅助选择体系操作方便，能够克服菊花托桂花型鉴定的困难，选择范围更广，强度更大。托桂花型菊花新品种常规选育方法周期长，费时又费力。通过本发明探索出了简易、快速筛选出与托桂花型控制基因紧密连锁的1个SRAP标记位点及1个SCAR标记用于辅助选择。建立的分子标记辅助选择方法可以实现苗期提早选择，减少工作量，大大提高托桂花型菊花的选择效率，从而加快育种进程。

附图说明

图1为托桂花型切花小菊‘南农雪峰’和非托桂花型切花小菊‘QX096’的花部形态。

其中，a、d：花序形态；b、c、e：管状花形态；Lo：羽裂长；Ov：子房；St：花柱；An：花药。

图2为SRAP引物组合M11E1在双亲、托桂花型基因池、非托桂花型基因池及F₁单株中扩增结果。

其中，P1：托桂花型亲本；P2：非托桂花型亲本；A：托桂花型基因池；N：非托桂花型基因池；A1-A10：托桂花型株系；N1-10：非托桂花型株系。

图3为SCAR标记SCAR₁₆₈在F₁代中的扩增结果。

图4为SCAR₁₆₈在‘南农雪峰’×‘蒙白’群体中验证部分结果。

其中A：托桂花型株系；N：非托桂花型株系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

(一)材料与方法

本试验材料以托桂花型切花小菊‘南农雪峰’作母本，非托桂花型切花小菊‘QX096’作父本(如图1所示)。于2014年秋进行杂交试验，获得80粒F₁杂交种子用于后续研究，以上材料保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”。次年3月初经穴盘点播，连同亲本扦插苗分别于2015和2016年4月中下旬各株系标号定植于菊花圃地，常规管理同大田。于2015和2016年秋季观察并记录双亲与F₁代植株的花型性状，进行分子标记的筛选及连锁分析。重组率计算公式为：重组率＝重组型植株数/总株数×100％。利用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(centimorgan，cM)。

(二)特异分子标记筛选

1)参照改良后的CTAB微量法，取菊花幼嫩叶片提取亲本及其F₁杂交后代基因组DNA，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，用核酸仪检测DNA的浓度和纯度，样品的A260/A280在1.8-2.0之间，说明DNA纯度较高，蛋白质或酚的污染较少。读取样品浓度并用ddH₂O稀释至50ng·μl^-1，置于-20℃冰箱保存备用。

2)根据集团分离法(bulked segrgant analysis，BSA)原理，分别从F₁分离群体株中选择极端托桂花型和非托桂花型株系各10株，将稀释的基因组DNA分别等量混合构成托桂基因池和非托桂基因池。

3)以双亲和托桂、非托桂基因池的基因组DNA为模板，共计500对SRAP引物组合(表1)用于特异位点的扩增筛选。

SRAP-PCR反应混合液总体积为10μl，其中包括10×PCR Buffer 1.0μl，3mM Mg²⁺，200μM dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，10μM SRAP引物和25ng模板DNA。SRAP-PCR反应程序：预变性94℃/5min；5个循环(变性94℃/1min，退火复性35℃/1min，延伸72℃/1min)；35个循环(变性94℃/1min,，退火复性50℃/1min，延伸72℃/1min)；延伸72℃/7min；结束反应，12℃保存。扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后拍照保存。实验用的Taq DNA聚合酶、dNTPs以及2000bpDNA marker、SRAP引物等，均由上海捷瑞生物工程有限公司提供；实验中使用的主要仪器有Eppendorf 5810R型高速冷冻离心机、DYY-6C型电泳仪、北京君意JY-SC26型垂直电泳槽、PTC-100TM型PCR仪、JS-380型凝胶成像分析仪。

其中，引物组合M11E1能在托桂花型亲本品种和托桂花型基因池中扩增获得清晰、单一的特异条带。经重复实验，这些特异条带表现稳定，大小范围约为250bp，且这些特异条带仅在托桂花型亲本和托桂花型DNA池中出现，说明这些特异条带可能与托桂花型发生连锁(如图2所示)。

(三)SRAP标记转化为SCAR标记

用消毒的刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切取特异的标记位点，置于1.5ml离心管并加入20μlddH₂O后充分捣碎。100℃水浴15分钟后，室温下12000r离心5分钟。取5.0μl上层清液用作模板进行PCR扩增，引物组合和扩增程序与之前一致。扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳。采用DNA琼脂糖凝胶提取试剂盒回收并纯化，在pMD19-T(TAKALA)载体中进行克隆。最后，重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α，选择阳性单克隆DNA片段通过ABI 3730XL测序仪进行生物测序(南京思普金生物科技有限公司)，所得序列经NCBI的BLAST比对，尚未发现与之相似的同源片段。结果如下(双下划线序列为SRAP引物序列，加粗、下划线和斜体的为SCAR标记引物)：

根据SRAP标记特异片段序列，利用Primer 5.0和BioXM 2.6软件在该区域内设计1对SCAR引物。其中上游引物序列为5′-GCAAGTTGGAAACACCTAA-3′，下游引物序列为5′-AAGATGAAGGTACATGCA-3′。利用设计的特异引物进行SCAR扩增，25μl的反应体系中含有50ng模板DNA，前后引物分别为0.3μmol·L^-1和0.25mmol·L^-1，1U Taq聚合酶和2.5μl10×PCRbuffer，余下的用ddH₂O补足。PCR反应程序为94℃5min预变性；然后94℃1min，57℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min；12℃保温。取7μl扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，检测SCAR标记是否转化成功。

表1用于菊花F₁群体进行多态性分析的SRAP引物名称及其序列

(四)SCAR标记验证

通过合成的SCAR₁₆₈引物对上述80个F₁单株扩增验证，扩增结果如图3所示，发现标记SCAR₁₆₈在44个托桂后代中有3个并未扩增出相应片段，相反，在36个非桂后代中，其中3个扩增出单一的目的片段，这说明有6个后代单株发生了交换。标记与目的基因存在连锁关系，重组率为7.5％，据Kosambi函数计算，两者连锁距离为7.5cM。

此外，选择本实验室构建的作图群体‘南农雪峰’×‘蒙白’群体用于进一步的验证，如图4所示，在140个F₁分离株系中，其中22个株系存在交换现象，准确率达84.3％。

在‘南农雪峰’×‘QX096’群体中验证，准确率高达92.5％，这些结果表明该标记已成功转化为更为稳定和便于应用的SCAR标记。

建立的分子标记辅助选择方法能够克服切花小菊托桂性状基因型鉴定的困难。选择范围更广，强度更大。可以实现苗期提早选择，减少工作量，大大提高托桂型切花小菊的选择效率，从而加快育种进程。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种菊花托桂花型分子标记辅助选择的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgagtccaaa ccggaca 17

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gactgcgtac gaattaat 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaagttgga aacacctaa 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagatgaagg tacatgca 18

<210> 3

<211> 272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagtccaaa ccggacaccc cttaggaatt tacaatcact aggaagtata tatatgcaag 60

ttggaaacac ctaaataaac caacaatgag gatgaagaat agttttaagc aaaactgaag 120

aaaaaaaaaa aaaaagaact agctaaatgt agataaacca aaattcccca tatgccatga 180

tcactttttt cccctactgc atgtaccttc atcttcagca cctgaaatgc attttattca 240

gtaagcttgg taacattaat tcgtacgcag tc 272

Claims

1.一种菊花托桂花型分子标记辅助选择方法，其特征在于：采用引物扩增菊花育种材料的基因组DNA，如能扩增出一条168bp的特异片段，则表明菊花育种材料为托桂花型；

所述引物的上游序列：5’-GCAAGTTGGAAACACCTAA-3’ ；下游序列：5’-AAGATGAAGGTACATGCA-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩增的25 µl反应体系中含有50 ng模板DNA，上下游引物分别为0.3 μmol·L^-1和0.25 mmol·L^-1，1 U Taq DNA聚合酶和10 ×PCR buffer，余下用ddH₂O补足；所述扩增的反应程序为：94℃ 5 min 预变性；然后94℃1min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；最后72℃ 延伸10 min；12 ℃保温。