CN109762928B - 一种与甜瓜蔓长相关的分子标记及其在鉴定甜瓜蔓长性状中的应用 - Google Patents

一种与甜瓜蔓长相关的分子标记及其在鉴定甜瓜蔓长性状中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与甜瓜蔓长相关的分子标记及其在鉴定甜瓜蔓长性状中的应用。本发明公开的与甜瓜蔓长相关的分子标记为序列表中序列1的第65‑71位的核苷酸，甜瓜基因组DNA中对应于序列表中序列1所示的DNA片段含有序列表中序列1的第65‑71位的核苷酸或不含有序列表中序列1的第65‑71位的核苷酸。实验证明，本发明的分子标记与甜瓜的蔓长性状相关，利用本发明的分子标记鉴定甜瓜蔓长的准确性可达100％，进一步可用于甜瓜分子标记辅助育种，在甜瓜生长的任意阶段进行筛选、鉴定，效率高、特异性好、准确度高，大大节约时间和成本，对加速甜瓜短蔓育种具有重要意义。

Description

一种与甜瓜蔓长相关的分子标记及其在鉴定甜瓜蔓长性状中 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种与甜瓜蔓长相关的分子标记及其在鉴定甜瓜蔓长性状中的应用。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)甜瓜种一年生草本植物，是世界范围内广泛种植的一种重要经济作物。甜瓜的株型对于甜瓜的生产栽培具有重要意义，“高产、优质、高效”始终是甜瓜露地与保护地栽培追求的共同目标，合理密植是实现这一目标的关键措施之一。甜瓜的种植密度依赖于品种类型、熟性、种植方式以及气候、土壤肥力等条件。目前，西北甜瓜主产区以露地匍匐栽培为主，现有的推广品种瓜蔓长达2.5m以上，栽培上株距、行距较大，生育前期土地与光热资源无法充分利用；东部地区保护地栽培，一般采用直立吊蔓栽培，与匍匐栽培相比，利用了空间资源，使种植密度以及土地与光热资源利用效率有所提高，但生育前期需要不间断绑蔓、吊蔓，生育后期基部叶片相互遮蔽，光和效率有所降低。利用短蔓基因，培育株型紧凑、适应密植、充分利用土地与光热资源而且早熟的品种，可节约劳力、降低成本、提高了生产效率。因此，深入挖掘、利用甜瓜短蔓资源，克隆短蔓(短节间)基因不仅有助于揭示甜瓜节间长度生长发育的分子机制，而且通过开发基因的特异分子标记，进行短蔓基因的分子标记辅助选择，势必加快短蔓甜瓜新品种的培育进程，进而解决甜瓜栽培上的密植问题，对促进甜瓜产业化发展具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种与甜瓜蔓长相关的特异分子标记及其应用。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了甜瓜蔓长分子标记或检测所述甜瓜蔓长分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状中的应用；所述甜瓜蔓长分子标记为序列表中序列1的第65-71位的核苷酸，甜瓜基因组DNA中对应于序列表中序列1所示的DNA片段含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸或不含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸。
上述应用中，所述检测所述甜瓜蔓长分子标记的物质可为引物对，所述引物对由名称分别为dm1-F和dm1-R的单链DNA组成，所述dm1-F为在甜瓜基因组中与序列1的第65位上游特异结合的单链DNA，所述dm1-R为在甜瓜基因组中与序列1的第71位下游特异结合的单链DNA。
所述引物对满足：以甜瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增得到的DNA片段含有所述甜瓜分子标记。
上述应用中，所述dm1-F可为序列表中序列1的第1-25位所示的单链DNA；所述dm1-R可为与序列表中序列1的第74-95位反向互补的单链DNA。
本发明中还提供了检测甜瓜基因型的方法，所述基因型为A1A1基因型、A1A2基因型和A2A2基因型，所述方法包括：检测待测甜瓜染色体中对应于序列表中序列1的第65-71位的核苷酸，如所述待测甜瓜两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述待测甜瓜两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述待测甜瓜两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜；
g1)含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸；
g2)不含序列表中序列1的第65-71位的核苷酸。
上述方法中，检测待测甜瓜染色体中对应于序列表中序列1的第65-71位的核苷酸可采用所述引物对进行，所述方法包括L1)和L2)：
L1)以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增得到PCR产物；
L2)下述L21)或L22)：
L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物序列确定甜瓜基因型：如所述PCR产物中含有序列1所示的DNA片段、且不含有序列表中序列2所示的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有序列2所示的DNA片段、且不含有序列表中序列1所示的DNA片段，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有序列1和2所示的两种DNA片段，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜；
L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物大小确定甜瓜基因型：如所述PCR产物中含有95bp的DNA片段、且不含有88bp的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有88bp的DNA片段、且不含有95bp的DNA片段，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有95bp和88bp两种大小的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜。
利用所述引物对进行PCR扩增，所述P1和所述P2在反应体系中的浓度均可为0.5μmol/L。具体可采用如下反应体系进行PCR扩增：0.8μL Buffer、0.8μL dNTPs(四种dNTP每种的浓度均为2mmol/L)、所述dm1-F和所述dm1-R、1μL所述待测甜瓜基因组DNA(50ng/μL)、0.1μ
Figure BDA0002005565120000021
DNA Polymerase for PAGE，ddH2O补至10μL。Buffer和
Figure BDA0002005565120000031
DNAPolymerase for PAGE均可为北京全式金生物技术有限公司产品。
利用所述引物对进行PCR扩增时的退火温度可为59℃。利用所述引物对进行PCR扩增具体可采用如下反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
检测所述PCR产物的大小可通过电泳进行，也可通过测序进行。
本发明还提供了下述X1)或X2)或X3)的方法：
X1)鉴定甜瓜蔓长性状的方法，包括：按照所述检测甜瓜基因型的方法检测待测甜瓜的基因型，A1A1基因型甜瓜蔓长长于或候选长于A2A2基因型甜瓜蔓长，A1A2基因型甜瓜蔓长长于或候选长于A2A2基因型甜瓜蔓长，A1A1基因型甜瓜蔓长与A1A2基因型甜瓜蔓长无差异或候选无差异；
X2)鉴定甜瓜蔓长性状的方法，包括：按照所述检测甜瓜基因型的方法检测待测甜瓜的基因型，A1A1基因型甜瓜为或候选为长蔓长甜瓜，A1A2基因型甜瓜为或候选为长蔓长甜瓜，A2A2基因型甜瓜为或候选为短蔓长甜瓜；
X3)甜瓜育种方法，包括：按照所述检测甜瓜基因型的方法检测甜瓜的基因型，选择A2A2基因型甜瓜或A1A2基因型甜瓜作为亲本进行育种。
所述甜瓜蔓长分子标记，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，所述物质包括所述引物对：
Y1)检测甜瓜蔓长分子标记；
Y2)制备检测甜瓜蔓长分子标记的产品；
Y3)鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状；
Y4)制备鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状产品。
所述检测甜瓜蔓长分子标记的物质可为所述引物对。
本发明还提供了下述任一应用：
H1)所述甜瓜蔓长分子标记在甜瓜育种中的应用；
H2)检测所述甜瓜蔓长分子标记的物质在甜瓜育种中的应用；
H3)检测所述甜瓜蔓长分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状产品中的应用；
H4)所述检测甜瓜基因型的方法在鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状的应用。
上述应用中，检测所述甜瓜蔓长分子标记的物质可为所述引物对。
本发明中，所述甜瓜可为短蔓品种Z8或短蔓品种Z8的后代。
所述短蔓品种Z8的后代包括以短蔓品种Z8为亲本与其他甜瓜进行杂交和/或或回交得到的各世代。
在本发明的以实施例中，所述短蔓品种Z8的后代为短蔓品种Z8与正常蔓品种B15的杂交后代。
所述蔓长可为主蔓长度，即甜瓜最长蔓的长度。
实验证明，本发明的甜瓜蔓长分子标记(dm1)与甜瓜的蔓长相关，两条染色体均含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸的A1A1基因型甜瓜和只有一条染色体含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸的A1A2基因型甜瓜的蔓长长于两条染色体均不含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸的A2A2基因型甜瓜。利用本发明的甜瓜蔓长分子标记鉴定甜瓜蔓长的准确性可达100％，本发明的甜瓜蔓长分子标记进一步可用于甜瓜分子标记辅助育种，在甜瓜生长的任意阶段进行筛选、鉴定，效率高、特异性好、准确度高，大大节约时间和成本，对加速甜瓜短蔓育种具有重要意义。
附图说明
图1为甜瓜正常蔓品种B15和短蔓品种Z8的表型。A：子叶期；B：伸蔓期。
图2为部分植株的电泳结果。M为DNA分子量标准，100bp DNA ladder；P1为正常蔓品种B15；P2为短蔓品种Z8；F1为B15和Z8的杂交后代；F2中编号为32和34的单株为A1A1基因型，编号为29、30、31、33、35和36的单株为A1A2基因型，编号为1-28的单株为A2A2基因型。
图3为实施例2中各甜瓜PCR产物的电泳结果。其中1-10分别为Z8、花脆蜜、红道边、特大白沙蜜、三西黄、精选红城脆、超早甜如蜜、甜掉牙、八棱脆、五月酥；M为100bp DNAladder。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的正常蔓品种B15：记载于“马建，王建设.甜瓜全雌系调控基因g的分子标记开发与应[J].植物遗传资源学报，2019,20”一文，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的短蔓品种Z8为京研益农(北京)种业科技有限公司产品，也保存于国家蔬菜工程技术研究中心蔬菜种质资源圃，编号为3030137。
实施例1、甜瓜蔓长分子标记可以用来检测甜瓜蔓长
一、甜瓜蔓长分子标记
本发明发现在甜瓜基因组中发现了一个与甜瓜蔓长相关的分子标记，将该分子标记记为dm1，dm1为甜瓜基因组中对应于序列表中序列1的第65-71位的核苷酸，dm1在正常蔓品种B15中为序列1的第65-71位，在短蔓品种Z8中缺失序列1的第65-71位。正常蔓品种B15和短蔓品种Z8的表型如图1所示。
将基因组DNA中两条染色体对应于序列表中序列1的第65-71位的核苷酸均为CAATCGT的甜瓜记为A1A1基因型甜瓜，将基因组DNA中两条染色体均缺失序列表中序列1的第65-71位核苷酸的甜瓜记为A2A2基因型甜瓜，将基因组DNA中一条染色体对应于序列表中序列1的第65-71位的核苷酸为CAATCGT、另一条染色体缺失序列表中序列1的第65-71位核苷酸的甜瓜记为A1A2基因型甜瓜。
二、dm1与甜瓜主蔓长度相关
在dm1上下游设计并合成引物dm1-F和dm1-R，dm1-F为序列表中序列1的第1-25位所示的单链DNA，dm1-R为与序列1的第74-95位反向互补的单链DNA。
将正常蔓品种B15与短蔓品种Z8杂交得到F1代，将F1代自交得到465株F2代单株，将F1代和465株F2代单株作为待测植株利用dm1-F和dm1-R检测基因型，并利用两亲本作为对照。
在相同的时间和条件下种植各待测甜瓜，然后提取各待测植株的基因组DNA，并利用dm1-F和dm1-R进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系如下：0.8μL Buffer(北京全式金生物技术有限公司)、0.8μLdNTPs(四种dNTP每种的浓度均为2mmol/L)、dm1-F和dm1-R(两种引物在反应体系中的浓度均为0.5μmol/L)、1μL基因组DNA(50ng/μL)、0.1μ
Figure BDA0002005565120000051
DNA Polymerase for PAGE(北京全式金生物技术有限公司)，ddH2O补至10μL。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min。
采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，并利用测序检测PCR扩增产物的序列，确定各待测甜瓜的基因型：PCR扩增产物含有序列表中序列1所示的DNA片段、不含有序列表中序列2所示的DNA片段的甜瓜为A1A1基因型甜瓜；PCR扩增产物含有序列表中序列2所示的DNA片段、不含有序列表中序列1所示的DNA片段的甜瓜为A2A2基因型甜瓜；PCR扩增产物含有序列表中序列1和序列2所示的两种DNA片段的甜瓜为A1A2基因型甜瓜。正常蔓品种B15与短蔓品种Z8分别为A1A1基因型和A2A2基因型，F1代为A1A2基因型，F2代中共有120株A1A1基因型单株，105株A2A2基因型单株和240株A1A2基因型单株。部分植株的电泳结果如图2所示。
在甜瓜定植后第75天(即成株期)测量各待测甜瓜的主蔓长度(即最长蔓的长度)。
正常蔓品种B15与短蔓品种Z8的主蔓长度分别为363.3±77.7cm和181±13.9cm。
F1代的主蔓长度为358.4±82.5cm。
F2代中A1A1基因型植株的主蔓长度为360.5±45.5cm，A2A2基因型植株的主蔓长度为175.6±20.9cm，A1A2基因型植株的主蔓长度为350.4±75.6cm。
结果显示，A1A1基因型植株的主蔓长度显著长于A2A2基因型植株，A1A2基因型植株的主蔓长度显著长于A2A2基因型植株，A1A1基因型植株的主蔓长度与A1A2基因型植株无显著差异。
F1代、F2代中A1A1基因型植株以及正常蔓品种B15的主蔓长度无显著差异，均显著长于短蔓品种Z8；F2代中A2A2基因型植株的主蔓长度与短蔓品种Z8无显著差异。
以上实验结果表明，本发明的dm1与甜瓜蔓长相关，可以用来检测甜瓜蔓长。
实施例2、dm1在甜瓜蔓长分子标记辅助选择种中的应用
利用实施例1中的dm1分子标记及引物dm1-F和dm1-R对花脆蜜、红道边、特大白沙蜜、三西黄、精选红城脆、超早甜如蜜、甜掉牙、八棱脆和五月酥(均为郑州邢源种业有限公司产品)共9份正常蔓甜瓜材料的基因组DNA进行了PCR扩增鉴定基因型，结果发现这9份正常蔓甜瓜材料基因型均为A1A1基因型，方法同实施例1步骤二。PCR产物的电泳结果如图2所示。
在甜瓜定植后第75天(即成株期)花脆蜜、红道边、特大白沙蜜、三西黄、精选红城脆、超早甜如蜜、甜掉牙、八棱脆和五月酥的主蔓长度分别为340.5±24.5cm、368.4±35.5cm、330.5±15.6cm、330.5±20.5cm、360.5±15.5cm、370.6±33.5cm、380.5±20.6cm、320.5±33.5cm、340.5±21.5cm，均显著长于短蔓品种Z8。表明，利用本发明的dm1分子标记及引物dm1-F和dm1-R检测蔓长的准确率为100％，可以在甜瓜生长早期鉴定其蔓长，用于育种的分子标记辅助选择，可以快速培育出短蔓甜瓜新品种，大大提高育种效率。
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种与甜瓜蔓长相关的分子标记及其在鉴定甜瓜蔓长性状中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 甜瓜（Cucumis melo L.）
<400> 1
caacttcaaa atcttctctc cttgtaagtt ctgaaactga aacttttttg gtaaaatttt 60
ccgtcaatcg ttctttcctt cctgctgcat gttta 95
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 甜瓜（Cucumis melo L.）
<400> 2
caacttcaaa atcttctctc cttgtaagtt ctgaaactga aacttttttg gtaaaatttt 60
ccgttctttc cttcctgctg catgttta 88

Claims (9)

1.甜瓜蔓长分子标记或检测所述甜瓜蔓长分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状中的应用；所述甜瓜蔓长分子标记为序列表中序列1的第65-71位的核苷酸，甜瓜基因组DNA中对应于序列表中序列1所示的DNA片段含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸或不含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测所述甜瓜蔓长分子标记的物质为引物对，所述引物对由名称分别为dm1-F和dm1-R的单链DNA组成，所述dm1-F为在甜瓜基因组中与序列1的第65位上游特异结合的单链DNA，所述dm1-R为在甜瓜基因组中与序列1的第71位下游特异结合的单链DNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述dm1-F为序列表中序列1的第1-25位所示的单链DNA；所述dm1-R为与序列表中序列1的第74-95位反向互补的单链DNA。
4.检测甜瓜基因型的方法，所述基因型为A1A1基因型、A1A2基因型和A2A2基因型，所述方法包括：检测待测甜瓜染色体中对应于序列表中序列1的第65-71位的核苷酸，如所述待测甜瓜两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述待测甜瓜两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述待测甜瓜两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜；
g1)含有序列表中序列1的第65-71位的核苷酸；
g2)不含序列表中序列1的第65-71位的核苷酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：检测待测甜瓜染色体中对应于序列表中序列1的第65-71位的核苷酸采用权利要求3中所述引物对进行，所述方法包括L1)和L2)：
L1)以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用权利要求3中所述引物对进行PCR扩增得到PCR产物；
L2)下述L21)或L22)：
L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物序列确定甜瓜基因型：如所述PCR产物中含有序列1所示的DNA片段、且不含有序列表中序列2所示的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有序列2所示的DNA片段、且不含有序列表中序列1所示的DNA片段，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有序列1和2所示的两种DNA片段，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜；
L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物大小确定甜瓜基因型：如所述PCR产物中含有95bp的DNA片段、且不含有88bp的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有88bp的DNA片段、且不含有95bp的DNA片段，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有95bp和88bp两种大小的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜。
6.下述X1)或X2)或X3)的方法：
X1)鉴定甜瓜蔓长性状的方法，包括：按照权利要求4或5所述的方法检测待测甜瓜的基因型，A1A1基因型甜瓜蔓长长于或候选长于A2A2基因型甜瓜蔓长，A1A2基因型甜瓜蔓长长于或候选长于A2A2基因型甜瓜蔓长，A1A1基因型甜瓜蔓长与A1A2基因型甜瓜蔓长无差异或候选无差异；
X2)鉴定甜瓜蔓长性状的方法，包括：按照权利要求4或5所述的方法检测待测甜瓜的基因型，A1A1基因型甜瓜为或候选为长蔓长甜瓜，A1A2基因型甜瓜为或候选为长蔓长甜瓜，A2A2基因型甜瓜为或候选为短蔓长甜瓜；
X3)甜瓜育种方法，包括：按照权利要求4或5所述的方法检测甜瓜的基因型，选择A2A2基因型甜瓜作为亲本进行育种。
7.具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，包括权利要求2或3中所述引物对：
Y1)检测甜瓜蔓长分子标记；
Y2)制备检测甜瓜蔓长分子标记的产品；
Y3)鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状；
Y4)制备鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状产品。
8.下述任一应用：
H1)检测权利要求1中所述甜瓜蔓长分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状产品中的应用；
H2)权利要求4或5所述的方法在鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓长性状的应用。
9.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求8所述的应用，其特征在于：所述甜瓜为短蔓品种Z8或短蔓品种Z8的后代。
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