CN105624277B - 与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，建立一种获得烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的新方法，包括烟草株高性状的表型获得；基于连锁分析的烟草主效QTL定位；以及基于关联分析的烟草株高QTL定位。本发明建立了一种烟草株高形态发育紧密连锁分子标记发掘的方法，同时在国际上首次在烟草12号连锁群上定位到一个新的影响株高发育的主效QTL，发现一个与之紧密连锁的分子标记PT55174。建立的数量性状主效QTL发掘方法和鉴定的分子标记对烟草株高主效基因的克隆和新品种选育具有重要意义。

Description

与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法

技术领域

本发明公开了一种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，属于烟草育种和分子遗传学领域，适用于烟草重要数量性状主效基因定位、克隆及烟草新品种辅助选择育种。

背景技术

烟草株高是烟草形态建成的最重要性状，同时烟草的株高也和产量、品质以及非生物胁迫有密切关系，所以一直是烟草育种改良的重要目标性状之一。但是烟草株高的遗传呈现数量性状遗传特征，容易受环境、不同遗传背景等因素的影响，利用传统的常规育种手段来改良烟草株高耗时、费工且选择不准确，具有一定的局限性。而与传统方法相比，利用分子标记可以从DNA水平直接筛选目标材料，弥补传统育种的局限性，大大缩短育种过程，因此，通过定位数量性状位点，发掘与之紧密连锁的分子标记，进而利用分子标记辅助选择来进行烟草形态建成目标性状改良是一种行之有效的手段。

随着分子标记技术的不断发展，各种不同的分子标记已经在数量性状基因座(QTL)定位和遗传图谱构建中被广泛利用。简单重复序列(SSR)标记与随机扩增多态性(RAPD)、限制性长度差异多态性(RFLP)等分子标记相比具备几个优势，它们具有更高的多态性、更高的密度，而且特别适合烟草这样的多倍体植物，因此，近几年，SSR标记已经逐渐被应用于烟草遗传图谱构建和QTL定位研究。

基于连锁分析的QTL定位是研究数量性状的重要方法之一，其基本原理是利用分子标记位点与引起表型差异的位点(QTL)之间的重组进行定位。该方法已经在很多重要作物如水稻、小麦和玉米上广泛利用，其中，基于连锁分析理论的极端池分离分析方法(BSA)是一种快速、高效的方法。其基本原理是根据目标性状的表型对分离群体进行分组混合DNA构建极端池，然后在极端池和亲本间筛选与目标性状连锁的分子标记。

关联分析作图是另一种研究数量性状的重要方法，其基本原理是利用引起表型差异的位点与分子标记间的连锁不平衡来定位QTL。与连锁分析相比，在定位QTL方面关联分析作图具有以下优势：首先，因为关联分析使用的是自然群体，所以不需要花费时间来构建人工群体；其次，可以一次检测多个等位基因变异；最后，精度大，可以达到单基因水平。但是，关联分析作图也存在假阳性较高等缺点。

因此，将连锁分析和关联分析两种方法联合起来进行QTL定位是最理想的研究数量性状遗传的策略，但是，到目前为止，在烟草上利用连锁分析和关联分析联合发掘株高性状QTL的方法还未见报道。本发明联合基于连锁分析的BSA分析法和关联分析方法定位与烟草株高性状相关的QTL，发掘与主效QTL紧密连锁的分子标记，为烟草株高发育性状相关基因克隆、分子标记开发和新品种培育奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，针对烟草株高发育性状相关基因精细定位、克隆及分子辅助育种研究在国内外几乎空白的现状，利用基于BSA连锁分析和关联分析的方法筛选出烟草株高性状相关的主效QTL一个或多个，获得与之紧密关联的分子标记，为烟草形态发育相关基因精细定位、克隆及新品种选育奠定基础，同时也为烟草株高性状分子辅助选择提供可用标记。。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，建立一种获得烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的新方法，包括以下步骤：

A)烟草株高性状的表型获得，供试材料为保存于中国农业科学院烟草研究所″国家烟草种质库″中的种质，其中NC82和抗88用作连锁分析的亲本材料，96份烟草种质资源，包括86份烤烟类型种质、2份白肋烟类型种质、1份雪茄烟类型种质和7份晒晾烟类型种质作为关联分析的自然群体，在不同年份和不同地点在始花期调查株高性状；

B)基于连锁分析的烟草主效QTL定位，其中包括：

1)采用CTAB方法提取亲本和群体基因组DNA，

2)根据表型鉴定结果，从F₂群体中各选取极端高和极端低的10个单株个体，等量混合DNA，构建两个极端池，进而在双亲及两个极端池间筛选与目标性状连锁的SSR分子标记，鉴定出的标记进一步在整个F₂群体(193个单株)中分析基因型，

3)主效QTL定位分析，利用F₂群体SSR基因型，结合F₂和F_2∶3两年表型数据，进行QTL定位，利用的分析软件为Icimapping3.2，LOD阈值设为2.5，当某一位点的LOD值大于2.5时即认为该处存在一个显著QTL位点，采用的统计学方法为完备区间作图法，并估算相关遗传参数，相关遗传参数包括QTL位置、加性效应、对表型变异的加性贡献率和显性贡献率；

C)基于关联分析的烟草株高QTL定位，根据连锁分析定位结果，在所在区间加密SSR标记，利用加密的SSR标记分析自然群体，结合连续两年不同地点的表型数据，进行关联分析作图，首先利用structure2.2对自然群体进行群体结构分析，估算最佳群体组群数K值，取值范围2-10；将MCMC开始时的不作数迭代设为100000，迭代次数设为100000，采用定位软件Tassel4.0一般线性模型(GLM)开展标记与性状的关联分析。GLM分析中以Q矩阵作为协变量进行回归分析。利用上述方法，首先对相关QTL位点进行关联分析验证，同时进一步缩小QTL所在标记区间位置，发掘影响烟草株高性状的主效QTL紧密连锁的分子标记。

进一步的，还包括发掘一个影响烟草株高发育性状的主效QTL，命名为qPH-12，与SSR标记PT55174紧密连锁，位于烟草12号连锁群区间PT53703-PT60823之间，在F₂群体中可以解释12.9％的表型遗传变异，在F_2∶3群体中可以解释13.8％的表型遗传变异，在自然群体中两年分别解释的表型遗传变异为13.9％和14.4％。

进一步的，所述与烟草株高发育性状QTL紧密连锁的分子标记PT55174，该标记的上游序列为SEQ ID NO.1(TGCTTCCTGCTTCATACGTG)，下游引物序列为SEQ ID NO.2(GGCTTGACTTCCATTTAATTTCC)。

本发明的有益效果是：

本发明建立了一种烟草株高形态发育紧密连锁分子标记发掘的方法，同时在国际上首次在烟草12号连锁群上定位到一个新的影响株高发育的主效QTL，发现一个与之紧密连锁的分子标记PT55174。建立的数量性状主效QTL发掘方法和鉴定的分子标记对烟草株高主效基因的克隆和新品种选育具有重要意义。

1、建立了一种联合连锁分析和关联分析发掘烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的方法。

2、首次定位到一个和烟草株高性状相关的主效QTL，为进一步精细定位和克隆相关基因奠定了很好的基础。

3、获得一个与烟草株高发育性状紧密连锁的分子标记PT55174。在不同群体和不同环境条件下，该标记与烟草株高发育性状都存在显著性关联，在育种实践中有很好的应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为联合连锁分析和关联分析方法确定的烟草株高发育主效QTL位置及与之紧密连锁的分子标记。

图中，A表示连锁分析方法QTL定位结果；B表示关联分析对主效QTL位点进一步验证及与之紧密连锁的分子标记；″＊″表示与烟草株高发育性状主效QTL紧密连锁的分子标记。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

(一)基于连锁分析的烟草株高性状主效QTL发掘

1.供试材料

以美国引进优质烤烟品种NC82为母本，中国病毒病抗性品种抗88为父本构建F₁、F₂和F_2∶3人工群体为实验材料，两个品种之间在株高发育上存在明显差异，品种NC82在营养生长期和生殖生长期株高正常伸长，但是抗88在营养生长期节距几乎不伸长，呈″莲花″状，在生殖生长期恢复正常；群体构建过程如下：将NC82与抗88配置杂交种F₁，F₁自交获得F₂，分别收获F₂单株，构建F_2∶3株系。

2.田间表型鉴定与分析

试验在中国农业科学院即墨试验基地进行(纬度35.4，经度119.3)。第一年，以NC82为母本，抗88为父本配置杂交组合，收获F₁种子，同期种植F₁，进而收获F₂种子。第二年，在大田条件下种植亲本、F₁和F₂群体。亲本和每分种植2行，每行25株，3次重复，株距0.5米，行距1.2米；F₂群体大小为193个单株，按每行25株，株距和行距同亲本，在始花期调查亲本、F₁及F₂单株株高表型。第三年，在中国农业科学院即墨试验农场种植亲本、F₁及F_2∶3群体，F_2∶3群体大小143个株系，每个株系种2行，每行10株，2个重复，调查每个F_2∶3株系所有单株株高表型，以株系平均值代表该株系表型值。

3.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

参考Chen(1999)等的CTAB法提取亲本及F₂群体每个单株的全基因组DNA。根据表型鉴定结果，从F₂群体中各选取极端高和极端低的10个单株个体，等量混合DNA，构建两个极端池，选取Bindler等(2011)公布的1238对SSR标记，合成引物。以双亲、F₁和两个极端池基因组DNA为模板，聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，genefinder染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代株系的带型进行判别记录。从1238对SSR标记中筛选出122对在亲本间表现多态的标记，进而筛选到17对在两个极端池间表现差异的SSR。同时，17对多态性SSR标记被用于分析193个F₂个体，获得相应基因型。

实验用Taq DNA聚合酶、dNTP及染料genefinder有北京天跟生化科技有限公司提供。所用SSR序列来源于网上公开数据(Bindler et al.，2011)。SSR引物合成有上海生工生物工程有限责任公司合成。

SSR-PCR合成体系为：1×的PCR Buffer，1.5mmol/L MgCl2，150μmol/L dNTPs，150pmol/L引物，1.0U Taq酶，40ng DNA，加ddH2O补足20μl。PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，运行35个循环；最后72℃延伸5min。

PCR产物电泳及染色：扩增产物中加入6×l Loading Buffer，94℃变性5min，取出后置于冰水中迅速冷却。用8％变性聚丙烯酰胺胶(7M尿素，丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝19∶1)对扩增产物进行分离。电泳时，首先在恒功率60W条件下，预电泳20分钟，然后恒定功率(P＝100W)条件下对扩增产物进行分离。电泳产物用genefinder染色。

4.烟草株高发育性状主效QTL定位

根据F₂单株个体扩增条带所表示的基因型，将其对应的株高(包括F₂单株表型和相对应的F_2∶3株系株高平均值)调查结果作为表型值，进而利用完备区间作图软件Icimapping3.2进行数据分析，LOD的阈值设为2.5，其中，permutation times设为1000次。

在不同群体不同环境条件下一个影响烟草株高发育性状的主效QTL，命名为qPH-12，位于烟草12号连锁群区间PT53703-PT60823之间，在F₂群体中可以解释12.9％的表型遗传变异，在F_2∶3群体中可以解释13.8％的表型遗传变异(表1)，该基因座位上来自抗88等位基因降低株高性状。

表1在F₂和F_2∶3群体中检测到的烟草株高相关主效QTL定位

a.下划线标记表示更靠近QTL的一侧标记

b.加性效应系指抗88等位基因被NC82等位基因代替的效应。

(二)基于关联分析的烟草株高发育性状主效QTL验证和紧密连锁分子标记发掘

1.供试材料及田间表型鉴定

用作关联分析的自然群体由96份种质资源组成，包括86份烤烟类型种质、2份白肋烟类型种质、1份雪茄烟类型种质和7份晒晾烟类型种质作为关联分析的自然群体。自然群体分别在两个山东即墨(纬度35.4，经度119.3)和四川凉山(纬度27.3，经度101.5)两个环境条件下种植，每个品种种质2行，每行25株，3次重复，株距0.5米，行距1.2米，每份材料选择10株有代表性的植株在始花期调查株高性状。利用SAS 8.0软件进行表型性状基本统计量的分析。

2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

DNA提取、SSR产物扩增及电泳同连锁分析方法中描述；

3.基于关联分析的烟草株高发育性状主效QTL定位及紧密连锁分子标记发掘

首先利用均与分布在烟草24条连锁群上的SSR标记对96份自然群体进行基因型分析，然后利用structure2.2对自然群体进行群体结果分析，结果表明96份材料可分成两个次级群体(K＝2)；相应的Q矩阵作为协变量进行关联分析。然后在主效QTL位点qPh-12所在12号连锁群上加密标记，共利用46个SSR标记进行关联分析，SSR标记列表见表2，标记引物序列已经被Bindler等(20110)公布。

表2用于关联分析的SSR分子标记

采用定位软件Tassel4.0一般线性模型(GLM)开展标记与性状的关联分析，GLM分析中以Q矩阵作为协变量进行回归分析。结果表明，在两种不同环境条件下，总共有3个标记与株高性状显著关联(P＜0.01)，其中标记PT55174在两种环境下都表现为与烟草主效性状显著关联(表3)。

表3基于关联分析的烟草株高性状主效QTL定位及紧密连锁分子标记发掘

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，其特征在于，建立一种获得烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的新方法，包括以下步骤：

A)获得烟草株高性状的表型，在不同年份和不同地点在始花期调查株高性状；

B)基于连锁分析的烟草主效QTL定位，其中包括：

1)采用CTAB方法提取亲本和群体基因组DNA，

2)根据表型鉴定结果，从杂交二代群体中各选取极端高和极端低的10个单株个体，等量混合DNA，构建两个极端池，进而在双亲及两个极端池间筛选与目标性状连锁的SSR分子标记，鉴定出的标记进步在整个杂交二代群体中分析基因型，

3)主效QTL定位分析，利用杂交二代群体SSR基因型，结合杂交二代和杂交三代两年表型数据，进行QTL定位，利用的分析软件为lcimapping3.2，LOD阈值设为2.5，当某一位点的LOD值大于2.5时即认为该处存在一个显著QTL位点，采用的统计学方法为完备区间作图法，并估算相关遗传参数，相关遗传参数包括QTL位置、加性效应、对表型变异的加性贡献率和显性贡献率；

C)基于关联分析的烟草株高QTL定位，根据连锁分析定位结果，在所在区间加密SSR标记，利用加密的SSR标记分析自然群体，结合连续两年不同地点的表型数据，进行关联分析作图，对相关QTL位点进行关联分析验证，同时进一步缩小QTL所在标记区间位置，发掘影响烟草株高性状的主效QTL紧密连锁的分子标记；

发掘的烟草株高发育性状QTL紧密连锁的分子标记为PT55174，该标记的前引物序列为TGCTTCCTGCTTCATACGTG，后引物序列为GGCTTGACTTCCATTTAATTTCC；

所述与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法具体包括：

(一)基于连锁分析的烟草株高性状主效QTL发掘

1)供试材料

以引进优质烤烟品种NC82为母本，病毒病抗性品种抗88为父本构建杂交一代、杂交二代和杂交三代人工群体为实验材料，两个品种之间在株高发育上存在明显差异，品种NC82在营养生长期和生殖生长期株高正常伸长，但是抗88在营养生长期节距不伸长，呈″莲花″状，在生殖生长期恢复正常；群体构建过程如下：将NC82与抗88配置杂交种杂交一代，杂交一代自交获得杂交二代，分别收获杂交二代单株，构建杂交三代株系；

2)田间表型鉴定与分析

第一年，以NC82为母本，抗88为父本配置杂交组合，收获杂交一代种子，同期种植杂交一代，进而收获杂交二代种子；第二年，在大田条件下种植亲本、杂交一代和杂交二代群体；亲本和每分种植2行，每行25株，3次重复，株距0.5米，行距1.2米；杂交二代群体大小为193个单株，按每行25株，株距和行距同亲本，在始花期调查亲本、杂交一代及杂交二代单株株高表型；第三年，种植亲本、杂交一代及杂交三代群体，杂交三代群体大小143个株系，每个株系种2行，每行10株，2个重复，调查每个杂交三代株系所有单株株高表型，以株系平均值代表该株系表型值；

3)DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

从杂交二代群体中各选取极端高和极端低的10个单株个体，等量混合DNA，构建两个极端池，选取SSR标记，合成引物；以双亲、杂交一代和两个极端池基因组DNA为模板，进行聚合酶链式(PCR)反应，筛选获得多态性标记，进而获得分离群体的基因型，PCR反应的产物通过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，genefinder染色后，在凝胶成像系统下成像；

SSR-PCR合成体系为：1×的PCR缓冲液，1.5mmol/L Mg²⁺，150μmol/L dNTPs，150pmol/L引物，1.0 UTaq酶，40ng DNA，加ddH2O补足20μl；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，运行35个循环；最后72℃延伸5min；

PCR产物电泳及染色：20μl的扩增产物中加入1μl 6×上样缓冲液，94℃变性5min，取出后置于冰水中迅速冷却；用8％变性聚丙烯酰胺胶对扩增产物进行分离；电泳时，首先在恒功率60W条件下，预电泳20分钟，然后恒定功率条件下对扩增产物进行分离；电泳产物用genefinder染色；

4)烟草株高发育性状主效QTL定位

根据杂交二代单株个体扩增条带所表示的基因型，将其对应的株高调查结果作为表型值，对应的株高调查结果包括杂交二代单株表型和相对应的杂交三代株系株高平均值，进而利用完备区间作图软件Icimapping3.2进行数据分析，LOD的阈值设为2.5，其中，permutationtimes设为1000次；

在不同群体不同环境条件下一个影响烟草株高发育性状的主效QTL，命名为qPh-12，位于烟草12号连锁群区间PT53703-PT60823之间，在杂交二代群体中可以解释12.9％的表型遗传变异，在杂交三代群体中解释13.8％的表型遗传变异；

(二)基于关联分析的烟草株高发育性状主效QTL验证和紧密连锁分子标记发掘：

1)供试材料及田间表型鉴定

用作关联分析的自然群体由96份种质资源组成，包括86份烤烟类型种质、2份白肋烟类型种质、1份雪茄烟类型种质和7份晒晾烟类型种质作为关联分析的自然群体；每个品种种质2行，每行25株，3次重复，株距0.5米，行距1.2米，每份材料选择10株有代表性的植株在始花期调查株高性状；利用SAS8.0软件进行表型性状基本统计量的分析；

2)DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳；

3)基于关联分析的烟草株高发育性状主效QTL定位及紧密连锁分子标记发掘：

首先利用均与分布在烟草24条连锁群上的SSR标记对96份自然群体进行基因型分析，然后利用structure2.2对自然群体进行群体结果分析，表明96份材料可分成两个次级群体；相应的Q矩阵作为协变量进行关联分析；然后在主效QTL位点qPh-12所在12号连锁群上加密标记，共利用46个SSR标记进行关联分析，所述46个SSR标记信息如下：

；

采用定位软件Tassel4.0一般线性模型开展标记与性状的关联分析，GLM分析中以Q矩阵作为协变量进行回归分析；表明，在两种不同环境条件下，总共有3个标记与株高性状显著关联，其中标记PT55174在两种环境下都表现为与烟草主效性状显著关联。

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