BR112020006195A2 - plantas de maís com melhor resistência a doenças - Google Patents

Abstract

A presente divulgação fornece plantas de maís que exibem resistência de amplo espectro à helmintosporiose do norte (NLB). São fornecidas plantas de maís com múltiplos locais de resistência a NLB localizados na ligação cis no cromossomo 8. São ainda fornecidas composições incluindo marcadores polimórficos inovadores, e métodos para produzir, melhorar, identificar e selecionar plantas ou germoplasma com um fenótipo de resistência a doenças.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTAS DE MAÍS COM MELHOR RESISTÊNCIA A DOENÇAS".

REFERÊNCIA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório US nº 62/566.305, depositado em 29 de setembro de 2017, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] Uma listagem de sequências que contém o arquivo nomea- do "SEMBO26WO ST25.txt", que tem 8,0 kilobytes (medidos em MS- WindowsO), e criada em 28 de setembro de 2018, e compreende 20 se- quências, está incorporada ao presente documento a título de referên- cia em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se ao campo de melhoramento de plantas e, mais especificamente, a métodos e composições para produzir plantas de maís que exibem melhor resistência a doenças e a um segmento cromossômico recombinante para resistência.

FUNDAMENTOS

[0004] Resistência a doenças é um traço importante na agricultura, particularmente para a produção de culturas de alimentos. Embora ale- los de resistência a doenças tenham sido identificados em plantas de mais, esforços para combinar diversos traços de resistência a doenças numa única linhagem de planta foram dificultados por locais fortemen- te ligados ou até mesmo alélicos que conferem resistência a diferentes patógenos. Isto é ainda mais complicado pelas altas densidades de sequências repetidas nas regiões de genomas de planta que contro- lam a resistência a doenças, o que pode reduzir bastante a possibili- dade de desenvolver marcadores genéticos úteis. Portanto, permane- ce uma necessidade de segmentos cromossômicos recombinantes e plantas que compreendem tais segmentos cromossômicos para a im- plantação heterozigótica de um ou mais dos alelos de resistência.

SUMÁRIO

[0005] Num aspecto, um segmento cromossômico recombinante é fornecido para conferir resistência à helmintosporiose do norte (NLB) no maís. O segmento cromossômico recombinante compreende um pri- meiro alelo que compreende um local Ht2 e um segundo alelo que com- preende um local HtN, sendo que o referido primeiro alelo e o referido segundo alelo estão em ligação cis no cromossomo 8. Num aspecto, a divulgação fornece plantas de maís de uma variedade de planta de maís cultivada que compreende o segmento cromossômico que compreende um primeiro alelo que compreende um local Ht2 que confere resistência a NLB e um segundo alelo que compreende um local HtN que confere resistência a NLB, sendo que o referido primeiro alelo e o referido segun- do alelo são configurados na ligação cis no cromossomo 8. Em algumas modalidades, a referida planta compreende, ainda, um terceiro alelo que confere resistência a NLB, por exemplo, um local selecionado a partir do grupo que consiste em Ht1, Ht3 e HtM no cromossomo 2. Por exemplo, a referida planta pode compreender, ainda, um local Ht1 no cromossomo 2. Em modalidades adicionais, o referido segmento cromossômico é flan- queado pelos locais de marcador Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e Q-NZMAYO09430172 (SEQ ID NO: 16) no cromossomo 8. Em ainda outras modalidades, o referido segmento cromossômico é flanqueado pelos locais de marcador Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) e Q- NZMAYO009238970 (SEQ ID NO: 11) no cromossomo 8. Plantas forne- cidas no presente documento podem compreender um segmento cro- mossômico recombinante que compreende um local Ht2 de uma plan- ta progenitora resistente a NLB, por exemplo, A619HT2, num local ge- neticamente ligado ao local de marcador Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) ou Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) no cromossomo 8. Plantas forne- cidas no presente documento também podem compreender um segmen- to cromossômico recombinante que compreende um local HtN de uma planta progenitora resistente a NLB, por exemplo, B6SHTN, num local geneticamente ligado ao local de marcador Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) ou Q-NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16) no cromossomo

8. AS19HT2 e BESHTN são endocruzamentos de milho maduro dispo- níveis junto à U.S. National Plant Germplasm System. Em algumas modalidades, plantas fornecidas no presente documento compreen- dem um segmento cromossômico recombinante que compreende um local Ht2 de uma planta progenitora resistente a NLB no local de mar- cador Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) ou Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) no cromossomo 8 e um segmento cromossômico recombinante que compreende um local HtN de uma planta progenitora resistente a NLB no local de marcador Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) ou Q- NZMAYO009430172 (SEQ ID NO:16) no cromossomo 8. Por exemplo, plantas fornecidas no presente documento podem compreender um segmento cromossômico recombinante de A619HT2 num local geneti- camente ligado ao local de marcador Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) ou Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) no cromossomo 8 e um segmento cromossômico recombinante de B6SHTN num local geneticamente |i- gado ao local de marcador Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) ou Q-NZMAY009430172 (SEQ ID NO: 16) no cromossomo 8. Em certas modalidades, são fornecidas plantas em que uma amostra representa- tiva de semente que compreende o referido segmento cromossômico foi depositada sob o nº de registro PTA-124466. Em outras modalida- des, plantas fornecidas no presente documento podem ser definidas como plantas endocruzadas ou híbridas. Em modalidades adicionais, plantas fornecidas no presente documento podem ser da subespécie Zea mays L. ssp. indentata, Zea mays L. ssp. indurata ou Zea mays L. ssp. saccharata. São descritas, ainda, partes de planta das plantas fornecidas no presente documento que incluem células, sementes, raí- zes, caules, folhas, espigas, flores e pólen.

[0006] Num outro aspecto, a invenção fornece um segmento de DNA recombinante que compreende um primeiro alelo que compreen- de um local Ht? e confere resistência a NLB e um segundo alelo que compreende um local HtN e confere resistência a NLB. Em certas mo- dalidades, o referido primeiro alelo é derivado de uma planta da linha- gem A619HT?2 e o referido segundo alelo é derivado de uma planta de linhagem B68HTN. Em modalidades adicionais, o referido segmento cromossômico compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 7, 12 e 12. Numa modalidade adicional, o referido segmento cromossômico é derivado da semente do material identificado como 17 9Y 1, conforme depositado sob o nº de registro ATCC PTA-124466. Modalidades adicionais incluem o refe- rido segmento de DNA recombinante compreendido numa célula, se- mente ou planta. Em ainda outras modalidades, o referido segmento recombinante confere resistência de amplo espectro a NLB à referida planta.

[0007] Num outro aspecto, a presente divulgação fornece métodos para produzir plantas de maís que exibem resistência de amplo espec- tro a NLB, sendo que o referido método compreende: a) cruzar uma planta de maís fornecida no presente documento consigo mesmo ou com uma segunda planta de maís de um genótipo diferente para pro- duzir uma ou mais plantas de progênie; e b) selecionar uma planta de progênie que compreende os segmentos cromossômicos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, a seleção da referida planta de progênie compreende seleção auxiliada por marcador. Em modalidades adicionais, a seleção auxiliada por marcador compreende a detecção de pelo menos um alelo num local genômico flanqueado pelos locais de marcador Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e Q- NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16) no cromossomo 8. A seleção au- xiliada por marcador pode compreender, ainda, a detecção de pelo menos um alelo num local genômico flanqueado pelos locais de mar- cador Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) e Q-NZMAYO009238970 (SEQ ID NO: 11) no cromossomo 8. Em modalidades adicionais, a seleção auxiliada por marcador compreende a detecção de pelo menos um alelo num local geneticamente ligado a um local de marcador selecionado a partir do grupo que consiste em Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1), Q- ZMHt2 (SEQ ID NO: 6), Q-NZMAYO009238970 (SEQ ID NO: 11) e Q- NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16). Por exemplo, a seleção auxiliada por marcador pode compreender a detecção de pelo menos um alelo num local geneticamente ligado a cada um dos locais de marcador se- lecionados a partir do grupo que consiste em Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e Q-NZMAYO009238970 (SEQ ID NO: 11). Em modali- dades dos métodos descritos no presente documento, a planta de pro- gênie é uma planta de progênie F2-Feg. A produção da progênie pode compreender retrocruzamento, por exemplo, de 2 a 7 gerações de re- trocruzamento.

[0008] Num outro aspecto, a invenção fornece uma planta produ- zida por meio dos métodos descritos no presente documento ou uma parte de uma planta produzida por meio dos métodos descritos no presente documento, tal como uma célula, uma semente, uma raiz, um caule, uma folha, uma espiga, uma flor e pólen.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0009] Figura 1: Relação entre distância genética e física no agru- pamento de genes NLB 8.1 no cromossomo 8.

[0010] Figura 2: Probabilidade estimada de recuperação de n re- combinantes desejados entre Ht2 e HtN com base numa taxa teórica de recombinação local de 2Mb/cM.

[0011] Figura 3: Resultados de experiências de validação com isolados da Raça 2 e da Raça N.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0012] Helmintosporiose do norte (NLB) é uma doença foliar cau- sada por Exserohilum turcicum, que também é conhecido como Se- tosphaeria turcica, e resulta em perdas de produtividade em culturas de mais. A resistência a NLB no maís é conferida tanto pela resistên- cia qualitativa (monogênica) como pela resistência quantitativa (poli- gênica). Genes qualitativos para resistência a NLB no maís que foram caracterizados são Ht1, Ht2, Ht3, HtN e HtM. Entretanto, são conheci- dos isolados de NLB que podem superar cada gene de resistência qualitativa. Ht2 e HtN são encontrados num agrupamento de genes de resistência a NLB no cromossomo 8. Esforços para combinar vários traços de resistência a doenças conhecidas numa única linhagem de planta não foram bem-sucedidos devido à forte ligação destes locais. Além disto, a alta densidade da sequência repetida no agrupamento de genes de resistência a NLB no cromossomo 8 tornou o desenvol- vimento de marcadores genéticos que poderiam auxiliar com sucesso o melhoramento auxiliado por marcador extremamente difícil. Antes da presente divulgação, acreditava-se que locais de resistência no cro- mossomo 8 do genoma de maís eram tão fortemente ligados que a implantação de um alelo favorável num primeiro local poderia inviabili- zar a implantação de um segundo alelo favorável no mesmo cromos- somo. A forte ligação entre estes locais de resistência a doenças é problemática, visto que são necessários múltiplos alelos direcionados a diferentes isolados de NLB para se obter resistência de amplo es- pectro a NLB. A incapacidade de implantar múltiplos alelos de resis- tência a NLB direcionados às combinações de isolados de NLB resulta em plantas de maís inaceitavelmente suscetíveis a um ou mais isola- dos de NLB.

[0013] Ao contrário do que se acreditava anteriormente na técnica, em que os locais de resistência a NLB eram tão fortemente ligados que eram alélicos, os presentes inventores produziram com sucesso um segmento cromossômico recombinante que compreende os alelos de resistência a NLB Ht2 e HtN numa configuração cis no cromossomo

8. Este segmento cromossômico é incorporado em plantas de maís para obter resistência de amplo espectro a NLB. Os inventores mostra- ram que estes locais de resistência a NLB não são alélicos, permitindo o empilhamento destes traços, enquanto simultaneamente implantam alelos favoráveis adicionais. A invenção também fornece um segmento cromossômico recombinante e plantas de maís que compreendem os alelos de resistência a NLB Ht2 e HtN numa configuração cis. Métodos para produzir plantas de maís que exibem resistência de amplo espec- tro a NLB, bem como marcadores inovadores para rastrear alelos de resistência a doenças durante o melhoramento de plantas são adicio- nalmente fornecidos. A invenção, portanto, representa um avanço sig- nificativo na técnica, combinando-se estes traços de resistência a do- enças em linhagens de planta com capacidade para atuar como pro- genitores doadores para a introgressão de resistência a doenças em qualquer genótipo de maís desejado.

[0014] A invenção fornece adicionalmente plantas de maís que compreendem os alelos de resistência a NLB Ht2 e HtN numa configu- ração cis no cromossomo 8 e que compreendem, ainda, alelos de re- sistência a NLB adicionais em trans, de modo que as plantas exibam resistência de amplo espectro a NLB. Em modalidades adicionais, a invenção fornece plantas de maís que compreendem um segmento cromossômico recombinante que compreende um local Ht2 de uma planta progenitora resistente a NLB no local de marcador Q- NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) ou Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) no cromossomo 8 e um segmento cromossômico recombinante que com- preende um local HtN de uma planta progenitora resistente a NLB no local de marcador Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) ou Q-

NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16) no cromossomo 8. A invenção fornece, ainda, um segmento cromossômico e plantas que compreen- dem alelos de resistência a NLB numa configuração cis como um re- sultado de um evento de recombinação que ocorre entre o local de marcador Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e o local de marcador Q-NZMAY009430172 (SEQ ID NO: 16). Em certas modalidades, as plantas de maís da invenção compreendem alelos de resistência a NLB numa configuração cis como um resultado de um evento de re- combinação que ocorre entre o local de marcador Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) e o local de marcador Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11).

[0015] A invenção fornece, ainda, um segmento de DNA recombi- nante que compreende um alelo Ht2 de uma primeira fonte genética e um alelo HtN de uma segunda fonte genética. Um segmento cromos- sômico recombinante fornecido no presente documento pode compre- ender um alelo Ht2 de uma planta progenitora AG19HT2 e um alelo HtN de uma planta progenitora BS&SHTN. Em certas modalidades, defi- ne-se um segmento cromossômico recombinante como compreenden- do DNA de uma primeira fonte genética no local de marcador Q- NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e DNA de uma segunda fonte ge- nética no local de marcador Q-NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16). Em modalidades adicionais, um segmento cromossômico recombinan- te compreende DNA de uma primeira fonte genética no local de mar- cador Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) e DNA de uma segunda fonte genéti- ca no local de marcador Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) no cromossomo 8. Numa modalidade adicional, o referido segmento cro- mossômico é derivado da semente do material identificado como 17 9Y 10, conforme depositado sob o nº de registro ATOC PTA-124466. Numa outra modalidade, um segmento cromossômico recombinante fornecido pela invenção confere resistência de amplo espectro a NLB a uma planta que compreende o segmento cromossômico recombi-

nante. Numa modalidade, o segmento de DNA é definido, ainda, como compreendido numa célula. Numa outra modalidade, o segmento de DNA é definido, ainda, como compreendido numa semente. Em ainda uma outra modalidade, o segmento de DNA é definido, ainda, com compreendido numa planta.

[0016] A invenção fornece, ainda, marcadores ligados a traços inovadores que podem ser usados para produzir, detectar ou rastrear plantas que compreendem alelos de resistência a NLB durante o me- lhoramento de plantas. Em modalidades específicas, a invenção for- nece os marcadores mostrados na Tabela 2, incluindo marcadores numa região genômica flanqueada pelos marcadores Q- NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e Q-NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16). Outras modalidades da invenção fornecem marcadores ino- vadores Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1), Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6), Q-NZMAYO009238970 (SEQ ID NO: 11) e Q-NZMAYO09430172 (SEQ ID NO: 16) que são úteis na detecção e no rastreamento de plantas que compreendem resistência a NLB durante o melhoramento de plantas. A situação do marcador para os doadores de resistência a NLB A619HT2 e B6SHTN é mostrada na Tabela 3.

[0017] Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para produzir plantas de maís que compreendem os alelos de resistência a NLB Ht2 e HtN numa configuração cis no cromossomo 8 selecionando- se ou melhorando-se plantas que têm alelos favoráveis nos marcadores nos segmentos cromossômicos divulgados no presente documento ou geneticamente ligados aos mesmos. Em algumas modalidades, a inven- ção fornece métodos para selecionar ou melhorar plantas que compre- endem a detecção de pelo menos um alelo num local num segmento genômico flanqueado pelos marcadores Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e Q-NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16). Em certas modali- dades, os métodos da invenção compreendem a detecção de um mar-

cador numa região genômica flanqueada pelos locais de marcador Q- ZMHt2 (SEQ ID NO:6) e Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11). Em cer- tos exemplos, as plantas podem ser selecionadas detectando-se um ou mais locais de marcador selecionados a partir do grupo que consis- te em Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1), Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6), Q-NZMAYO009238970 (SEQ ID NO: 11) e Q-NZMAYO09430172 (SEQ ID NO: 16). |. REGIÕES GENÔMICAS, ALELOS E POLIMORFISMOS ASSOCI-

ADOS À RESISTÊNCIA A DOENÇAS NO MAÍS

[0018] A helmintosporiose do norte (NLB) é uma doença foliar causada por Exserohilum turcicum, também conhecido como Setos- bhaeria turcica, que causa perdas de produtividade significativas em culturas de maís. Locais de resistência a NLB foram identificados, in- cluindo Ht1, Ht2, Ht3, HIN e HtM. Tanto Ht2 como HtN residem num agrupamento de genes de resistência a NLB no cromossomo 8 (NLB 8.1), enquanto Ht1 reside no cromossomo 2. Cada um destes genes confere resistência a certos isolados de NLB (Tabela 1). A fim de produzir uma planta de maís com resistência de amplo espectro e durável a NLB, diversos diferentes locais de resistência e alelos são combinados numa única linhagem de maís. Combinando-se os dife- rentes locais, a planta terá resistência de amplo espectro e durável. É provável que a resistência seja durável, visto que é improvável que os patógenos evoluam de modo a superar os múltiplos modos de resistên- cia. Os segmentos cromossômicos recombinantes, as plantas e os mar- cadores da presente invenção fornecem a capacidade para empilhar múltiplos locais numa planta de maís e superar muitos dos obstáculos na técnica com relação ao empilhamento de genes de resistência.

[0019] Anteriormente, acreditava-se que os locais de resistência Ht2 e HtN no maís eram tão fortemente ligados que a geração de eventos de recombinação entre os dois locais não fosse viável. Entre-

tanto, surpreendentemente, os presentes inventores tiveram sucesso na produção de plantas que compreendem intervalos cromossômicos recombinantes com os alelos de resistência Ht2 e HtN acoplado numa configuração cis. Dada a divulgação no presente documento dos seg- mentos cromossômicos recombinantes e marcadores inovadores as- sociados aos mesmos, segmentos cromossômicos recombinantes adi- cionais poderiam ser gerados com o uso dos métodos e informações descritos nos Exemplos. Por exemplo, um cruzamento entre uma plan- ta de maís que compreende o gene HItN (tal como B6ESHTN) e uma planta que compreende o gene HT?2 (tal como A619HT2) poderia ser rea- lizado, seguido pela seleção de uma planta de progênie que compreende um segmento cromossômico recombinante com o uso dos marcadores fornecidos no presente documento. A taxa de recombinação estimada e as probabilidades de amostragem binomial são usadas para determinar o número de plantas a serem geradas. Em certos exemplos, a seleção de plantas de progênie poderia ser realizada detectando-se pelo menos um alelo num local geneticamente ligado a um local de marcador seleciona- do a partir do grupo que consiste em Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1), Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6), Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) e QO-NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16). Il. INTROGRESSÃO DE REGIÕES GENÔMICAS ASSOCIADAS À

RESISTÊNCIA A DOENÇAS

[0020] A introgressão auxiliada por marcador envolve a transfe- rência de uma região cromossômica definida por um ou mais marcado- res de um primeiro fundo genético para um segundo A progenitura de um cruzamento que contém a região genômica introgredida pode ser identificada pela combinação de marcadores característicos da região genômica introgredida desejada de um primeiro fundo genético e de marcadores tanto ligados como não ligados característicos do segundo fundo genético.

[0021] A presente invenção fornece marcados precisos inovadores para identificar e rastrear a introgressão dos segmentos cromossômi- cos recombinantes recém-fornecidos que compreendem os locais de resistência a NLB divulgados no presente documento em linhagens cultivadas. Em certas modalidades, a invenção fornece os marcadores apresentados nas Tabelas 2 e 3. Modalidades adicionais da invenção fornecem os marcadores inovadores Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1), Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6), Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) e Q-NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16), que podem ser úteis na identificação ou rastreamento de plantas que compreendem resistên- cia de amplo espectro a NLB, incluindo plantas que compreendem os alelos de resistência a NLB Ht2 e HtN numa configuração cis no cro- mossomo 8.

[0022] Marcadores nos intervalos genômicos ou ligados a qualquer um dos mesmos da presente invenção podem ser úteis numa varieda- de de esforços de melhoramento que incluem a introgressão de regi- ões genômicas associadas à resistência a doenças num fundo genéti- co desejado. Por exemplo, um marcador dentro de 40 cM, 20 cM, 15 CM, 10 cM, 5 cM, 2 cM ou 1 cM de um marcador associado à resistên- cia a doenças descrito no presente documento pode ser usado para a introgressão auxiliada por marcador de regiões genômicas associadas a um fenótipo resistente a doenças.

[0023] Plantas de maís que compreendem uma ou mais regiões introgredidas associadas a um fenótipo desejado, em que pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90% ou 99% das sequências genômicas res- tantes portam marcadores cujos alelos correspondem ao genótipo progenitor recorrente fora da região tida como alvo para a introgressão de resistência a doenças, são também fornecidas. Plantas de maís que compreendem uma região introgredida intimamente ligada ou ad- jacente às regiões genômicas e marcadores fornecidos no presente documento e associados a um fenótipo de resistência a doenças são também fornecidas. Ill. DESENVOLVIMENTO DE VARIEDADES DE MAÍS RESISTENTES

A DOENÇAS

[0024] Para a maioria dos objetivos de melhoramento, os melhoris- tas comerciais trabalham no germoplasma que é "cultivado", "tipo cul- tivado" ou "elite". Conforme usado no presente documento, variedade "elite" ou "cultivado" significa uma variedade que resultou do melhora- mento e da seleção para desempenho agronômico superior para uso na agricultura. Isto inclui os progenitores de uma variedade híbrida que pode ser cultivada, bem como a variedade que é cultivada em si. Este germoplasma é mais fácil de melhorar, visto que geralmente apresenta bom desempenho quando avaliado quanto ao desempenho hortícola. Foram desenvolvidos vários tipos de maís cultivados que são agrono- micamente de elite e adequados para cultivo comercial. Entretanto, a vantagem de desempenho que um germoplasma cultivado fornece po- de ser compensada por uma carência de diversidade alélica. Melhoris- tas geralmente aceitam esta troca, visto que o progresso é mais rápido quando se trabalha com material cultivado do que quando se melhora com fontes geneticamente diversas.

[0025] Em contrapartida, quando o germoplasma cultivado é cru- zado com germoplasma não cultivado, um melhorista pode obter acesso a alelos inovadores do tipo não cultivado. Entretanto, esta abordagem pode apresentar dificuldades significativas devido a pro- blemas de fertilidade associados a cruzamentos entre diversas linha- gens e impedimento negativo de ligação do progenitor não cultivado. Em plantas de maís, tipos de planta não cultivados podem fornecer alelos associados a resistência a doenças. Entretanto, estes tipos não cultivados podem ter qualidades hortícolas insatisfatórias, tais como vulnerabilidade a certos traços ou doenças prejudiciais.

[0026] Uma planta de maís, conforme mencionado no presente documento, se refere a qualquer planta selecionado dentre o gênero Zea, incluindo, porém sem limitação, qualquer planta selecionada den- tre a espécie Zea mays L. Em modalidades adicionais, a planta pode ser selecionada dentre a subespécie Zea mays L. ssp. mays, por exemplo, Zea mays L. ssp. indentata, conhecida de outro como como milho maduro; Zea mays L. ssp. indurata, conhecida de outro como como milho sílex; Zea mays L. ssp. saccharata, conhecida de outro como como milho doce; Zea mays L. ssp. amylacea, conhecida de ou- tro como como milho-mole; ou Zea mays L. ssp. everta, conhecida de outro como como milho-cedovém. Plantas Zea incluem híbridas, endo- cruzadas, parcialmente endocruzadas ou membros de populações de- finidas ou indefinidas.

[0027] O processo de introgredir genes de resistência desejáveis de linhagens não cultivadas em linhagens cultivadas de elite, enquanto se evita problemas com impedimento de ligação ou baixa hereditarie- dade, é um processo longo e muitas vezes árduo. O sucesso na im- plantação de alelos derivados de parentes selvagens, portanto, de- pende fortemente de introgressões mínimas ou truncadas que care- cem de efeitos prejudiciais e ensaios confiáveis de marcador que substituem triagens fenotípicas. O sucesso é ainda definido simplifi- cando-se a genética de atributos-chave para permitir o enfoque no ga- nho genético para traços quantitativos, tais como resistência a doen- ças. O processo de introgredir regiões genômicas de linhagens não cultivadas pode ser amplamente facilitado pela disponibilidade de mar- cadores precisos para a seleção auxiliada por marcador (MAS).

[0028] Um versado na técnica compreenderia, portanto, que os alelos, polimorfismos e os marcadores fornecidos pela invenção permi- tem o rastreamento e a introdução de qualquer uma das regiões ge- nômicas identificadas no presente documento em qualquer fundo ge-

nético. Além disto, as regiões genômicas associadas à resistência a doenças divulgadas no presente documento podem ser introgredidas de um genótipo para outro e rastreadas com o uso de MAS. Assim, a descoberta do depositante de marcadores precisos associados à resis- tência a doenças facilita o desenvolvimento de plantas de maís que têm fenótipos benéficos. Por exemplo, a semente pode ser genotipada com o uso dos marcadores da presente invenção a fim de selecionar plantas que compreendem regiões genômicas desejadas associadas à resistência a doenças, sem a necessidade de cultivar plantas até a maturidade para avaliar o fenótipo. Ademais, MAS permite a identifica- ção de plantas homozigotas ou heterozigotas para uma introgressão desejada.

[0029] A avaliação fenotípica de grandes populações é demorada, consome muitos recursos e não é reproduzível em todos os ambien- tes. A seleção auxiliada por marcador oferece uma alternativa viável. Ensaios moleculares projetados para detectar polimorfismos exclusi- vos, tais como SNPs, são versáteis. Entretanto, os mesmos podem falhar em discriminar alelos em — espécies de maís ou entre as mes- mas num único ensaio. Reorganizações estruturais de cromossomos, tais como deleções, prejudicam a hibridização e a extensão de oligo- nucleotídeos sinteticamente marcados. No caso de eventos de dupli- cação, múltiplas cópias são amplificadas numa única reação sem dis- tinção. O desenvolvimento e a validação de marcadores precisos e altamente preditivos são, portanto, essenciais para o sucesso de pro- gramas de melhoramento MAS.

[0030] Uma planta, semente ou célula de milho fornecida no pre- sente documento pode ser geneticamente transformada. Vários méto- dos para transformação de plantas foram desenvolvidos, incluindo pro- tocolos de transformação biológica e física de plantas. Consultar, por exemplo, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into

Plants" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick e Thompson Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-88 (1993). Além disto, vetores de expressão e métodos de cultura in vitro para transformação de célula ou tecido de planta e regeneração de plantas estão disponíveis. Consultar, por exemplo, Gruber et a/., "Vec- tors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick e Thompson Eds., CRC Press, Inc., Boca Ra- ton, páginas 89-119 (1993).

[0031] Um método para introduzir um vetor de expressão em plan- tas se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Consultar, por exemplo, Horsch et al/., A Simple and General Method for Transferring Genes into Plants. Science, 227:1229-1231 (1985). A. tume- faciens e A. rhizogenes são bactérias de solo patogênicas de plantas que transformam geneticamente células de plantas. Descrições de sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência de genes medi- ada por Agrobacterium são fornecidos, por exemplo, pela patente U.S. nº 5.563.055, incorporada ao presente documento a título de referên- cia em sua totalidade.

[0032] Diversos métodos de transformação de planta, coletivamen- te denominados transferência de gene direta, foram desenvolvidos como uma alternativa à transformação mediada por Agrobacterium. Um método geralmente aplicável de transformação de planta é trans- formação mediada por microprojétil em que o DNA é transportado na superfície de microprojéteis. O vetor de expressão é introduzido em tecidos de planta com um dispositivo biolístico que acelera os micro- projéteis a velocidades de 300 a 600 m/s, o que é suficiente para pe- netrar paredes e membranas de célula vegetal.

[0033] Outro método para entrega física de DNA para plantas é a sonicação de células-alvo. Alternativamente, fusão de lipossoma e es- feroplastos foi usada para introduzir vetores de expressão em plantas.

Eletroporação de protoplasto e células e tecidos inteiros também pode ser usada.

[0034] Após a transformação de tecidos-alvo de milho, a expres- são dos genes marcadores selecionáveis descritos acima permite a seleção preferencial de células, tecidos e/ou plantas transformadas, com o uso de métodos de regeneração e seleção bem conhecidos na técnica.

[0035] Os métodos supracitados para transformação seriam tipi- camente usados para produzir uma variedade transgênica. A varieda- de transgênica poderia ser, então, cruzada com uma outra variedade (não transformada ou transformada), a fim de produzir uma nova vari- edade transgênica. Alternativamente, um traço genético que foi geneti- camente modificado numa linhagem de milho específica usando as técnicas de transformação supracitadas poderia ser movido para uma outra linhagem usando as técnicas de retrocruzamento tradicionais que são bem conhecidas na arte de melhoramento de plantas. Por exemplo, uma abordagem de retrocruzamento poderia ser usada para mover um traço geneticamente modificado de uma variedade não de elite pública numa variedade de elite, ou de uma variedade contendo um gene estranho em seu genoma numa variedade ou variedades que não contêm este gene.

[0036] Muitos traços desejáveis, tais como aqueles aqui descritos, que podem ser introduzidos através da introgressão ou transformação também podem ser introduzidos diretamente numa planta com o uso de técnicas moleculares de edição de genoma. Um aspecto da inven- ção inclui plantas com um genoma que foi alterado por técnicas de modificação de genoma sítio-específica.

[0037] Uma planta, semente ou célula de milho fornecida no pre- sente documento também pode ser produzida por uma ou mais técni- cas de modificação genética do genoma ou submetida à outra edição genômica. Por exemplo, um ou mais alelos de resistência a NLB po- dem ser introduzidos num fundo suscetível a NLB. Técnicas de modifi- cação genética do genoma exemplificativas incluem meganucleases, nucleases de dedo de zinco, TALENs e sistemas CRISPR/Cas9. Con- sultar, por exemplo, Gaj et al., ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31:397-405 (2013). Técnicas de modificação genética do genoma adicionais co- nhecidas por aqueles versados na arte também são idealizadas. Téc- nicas de modificação de genoma sítio-específica incluem o uso de en- zimas, tais como endonucleases, recombinases, transposases, helica- ses e qualquer combinação das mesmas. Num aspecto, uma endonu- clease é selecionada dentre uma meganuclease, uma nuclease de de- do de zinco (ZFN), uma nuclease efetora do tipo ativador de transcri- ção (TALEN), um Argonauta e uma nuclease orientada por RNA, tal como uma nuclease associada a CRISPR. Num outro aspecto, a en- donuclease é Cas9 ou Cpf1.

[0038] Enzimas de modificação de genoma sítio-específica indu- zem uma modificação do genoma, tal como uma ruptura do DNA de fita dupla (DSB) ou uma ruptura do DNA de fita simples no sítio-alvo de uma sequência genômica que é, então, reparada pelos processos naturais de recombinação homóloga (HR) ou junção de extremidades não homólogas (NHEJ). Modificações de sequência ocorrem, então, nos sítios clivados, que podem incluir deleções ou inserções que resul- tam em interrupção de gene no caso de NHEJ, ou integração de se- quências exógenas por recombinação homóloga. Estas técnicas po- dem, por exemplo, ser usadas para alterar um outro local numa planta que contém o evento de acoplamento desta invenção, para alterar o evento de acoplamento desta invenção ou para recriar o evento de acoplamento desta invenção num fundo de planta diferente.

IV. TÉCNICAS DE MELHORAMENTO MOLECULAR ASSISTIDO

[0039] Marcadores genéticos que podem ser usados na prática da presente invenção incluem, porém sem limitação, polimorfismos de com- primento de fragmento de restrição (RFLPs), polimorfismos de compri- mento de fragmento amplificado (AFLPs), repetições de sequência sim- ples (SSRs), polimorfismos de comprimento de sequência simples (SSLPs), polimorfismos de nucleotídeo único (SNP's), polimorfismos de inserção/deleção (Indels), repetições em tandem de número variável (VNTRs) e DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPD), isozimas e outros marcadores conhecidos por aqueles versados na técnica. À descoberta e o desenvolvimento de marcadores em plantas de cultura fornecem a estrutura inicial para aplicações em atividades de melho- ramento auxiliado por marcador (publicações de patente U.S. nº: 2005/0204780, 2005/0216545, 2005/0218305 e 2006/00504538). O "ma- pa genético" resultante é a representação da posição relativa de locais caracterizados (marcadores de ácido nucleico polimórficos ou qualquer outro local para o qual alelos podem ser identificados) entre si.

[0040] Polimorfismos que compreendem apenas uma única altera- ção de nucleotídeo podem ser ensaiados de várias formas. Por exem- plo, a detecção pode ser realizada por técnicas eletroforéticas, incluin- do um polimorfismo conformacional de fita simples (Orita et a/. (1989) Genomics, 8(2), 271-278), eletroforese em gel com gradiente desnatu- rante (Myers (1985) EPO 0273085) ou polimorfismos de comprimento de fragmento de clivagem (Life Technologies, Inc., Gathersberg, MD), mas a ampla disponibilidade do sequenciamento de DNA muitas vezes torna mais fácil simplesmente sequenciar os produtos amplificados di- retamente. Uma vez que a diferença da sequência polimórfica é co- nhecida, ensaios rápidos podem ser projetados para teste de progênie, envolvendo tipicamente alguma versão de amplificação por PCR de alelos específicos (PASA; Sommer, et al., Biotechniques 12(1), 82-87,

1992) ou amplificação por PCR de múltiplos alelos específicos (PAMSA; Dutton e Sommer, Biotechniques, 11(6), 700-7002, 1991).

[0041] Marcadores polimórficos servem como ferramentas úteis para ensaiar plantas para determinar o grau de identidade de linha- gens ou variedades (patente U.S. nº 6.207.367). Estes marcadores formam a base para determinar associações com fenótipos e podem ser usados para acionar o ganho genético. Em certas modalidades dos métodos da invenção, ácidos nucleicos polimórficos podem ser usados para detectar, numa planta de maís, um genótipo associado à resis- tência a doenças, identificar uma planta de maís com um genótipo as- sociado à resistência a doenças e selecionar uma planta de maís com um genótipo associado à resistência a doenças. Em certas modalida- des dos métodos da invenção, ácidos nucleicos polimórficos podem ser usados para produzir uma planta de maís que compreende, em seu genoma, um local introgredido associado à resistência a doenças. Em certas modalidades da invenção, ácidos nucleicos polimórficos po- dem ser usados para melhorar plantas de maís de progênie que com- preendem um local associado à resistência a doenças.

[0042] Marcadores genéticos podem incluir marcadores "dominan- tes" ou "codominantes". Marcadores "codominantes" revelam a pre- sença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo diploide). Marcadores "dominantes" revelam a presença de apenas um único alelo. Marcado- res são, de preferência, herdados de modo codominante, de modo que a presença de ambos os alelos num local diploide ou de múltiplos ale- los em locais triploide ou tetraploide seja prontamente detectável, e os mesmos são livres de variação ambiental, isto é, sua hereditariedade é

1. Um genótipo de marcador compreende tipicamente dois alelos mar- cadores em cada local num organismo diploide. A composição alélica do marcador de cada local pode ser homozigótica ou heterozigótica. A homogozigosidade é uma condição em que ambos os alelos num local são caracterizados pela mesma sequência de nucleotídeos. A hetero- gozisidade se refere às diferentes condições do alelo num local.

[0043] Análises com base em ácido nucleico para determinar a presença ou ausência do polimorfismo genético (isto é, para genotipa- gem) podem ser usadas em programas de melhoramento para identifi- cação, seleção, introgressão e semelhantes. Uma ampla variedade de marcadores genéticos para a análise de polimorfismos genéticos está disponível e é conhecida pelos versados na técnica. A análise pode ser usada para selecionar genes, porções de genes, QTL, alelos ou regiões genômicas que compreendem ou são ligadas a um marcador genético que está ligado ou associado à resistência a doenças em plantas de mais.

[0044] Conforme usado no presente documento, métodos de aná- lise de ácidos nucleicos incluem, porém sem limitação, métodos de detecção baseados em PCR (por exemplo, ensaio TaqMan), métodos de microarranjo, métodos baseados em espectrometria de massa e/ou métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos, incluindo o sequen- ciamento de todo o genoma. Em certas modalidades, a detecção de sítios polimórficos numa amostra de DNA, RNA ou cDNA pode ser fa- cilitada através do uso de métodos de amplificação de ácidos nuclei- cos. Tais métodos aumentam especificamente a concentração de poli- nucleotídeos que abrangem o sítio polimórfico, ou incluem este sítio e sequências situadas distal ou proximalmente ao mesmo. Tais molécu- las amplificadas podem ser prontamente detectadas por eletroforese em gel, métodos de detecção de fluorescência ou outros meios.

[0045] Um método para alcançar tal amplificação emprega a rea- ção em cadeia de polimerase (PCR) (Mullis et a/. 1986 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273; patente europeia nº 50.424; patente europeia nº 84.796; patente europeia nº 258.017; patente eu- ropeia nº 237.362; patente europeia nº 201.184; patente U.S. nº

4.683.202; patente U.S. nº 4.582.788; e patente U.S. nº 4.683.194), com o uso de pares de iniciadores que têm capacidade para se hibridi- zar com as sequências proximais que definem um polimorfismo em sua forma de fita dupla. Métodos para a tipagem de DNA com base em espectrometria de massa também podem ser usados. Tais métodos são divulgados nas patentes U.S. nºº 6.613.509 e 6.503.710 e referên- cias encontradas nas mesmas.

[0046] Os polimorfismos nas sequências de DNA podem ser de- tectados ou tipados por uma variedade de métodos eficazes bem co- nhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, aqueles revela- dos nas patentes U.S. nºº 5.468.613, 5.217.863; 5.210.015; 5.876.930;

6.030.787; 6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; 5.945.283;

5.468.613; 6.090.558; 5.800.944; 5.616.464; 7.312.039; 7.238.476;

7.297.485; 7.282.355; 7.270.981 e 7.250.252, todas as quais estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. Entretanto, as composições e métodos da presente invenção podem ser usadas em conjunto com qualquer método de tipagem de polimorfismo para tipar polimorfismos em amostras de DNA genômico. Estas amostras de DNA genômico usadas incluem, porém sem limitação, DNA genô- mico isolado diretamente de uma planta, DNA genômico clonado ou DNA genômico amplificado.

[0047] Por exemplo, polimorfismos em sequências de DNA podem ser detectados por hibridização em sondas de oligonucleotídeo alelo- específico (ASO) conforme divulgado nas patentes U.S. nºº 5.468.613 e 5.217.863. A patente U.S. nº 5.468.613 divulga hibridizações de oli- gonucleotídeo alelo-específico em que uma única ou múltiplas varia- ções de nucleotídeo na sequência de ácidos nucleicos podem ser de- tectadas em ácidos nucleicos por meio de um processo no qual a se- quência que contém a variação de nucleotídeo é amplificada, identifi- cada numa membrana e tratada com uma sonda de oligonucleotídeo de sequência específica marcada.

[0048] A sequência-alvo de ácidos nucleicos também pode ser de- tectada por meio de métodos de ligação de sondas, por exemplo, con- forme divulgado na patente U.S. nº 5.800.944, em que a sequência de interesse é amplificada e hibridizada em sondas seguido pela ligação para detectar uma parte marcada da sonda.

[0049] Microarranjos também podem ser usados para detecção de polimorfismo, em que conjuntos de sondas de oligonucleotídeo são montados de forma sobreposta para representar uma única sequência, de modo que uma diferença na sequência-alvo num ponto resultaria em hibridização parcial de sonda (Borevitz et al, Genome Res. 13:513-523, 2003); Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858, 2005). Em qualquer microarranjo, espera-se que exista uma pluralidade de se- quências-alvo, que pode representar genes e/ou regiões de não codifi- cação, em que cada sequência-alvo é representada por uma série de oligonucleotídeos, em vez de por uma única sonda. Esta plataforma fornece triagem com alto rendimento de uma pluralidade de polimor- fismos. A tipagem de sequências-alvo por meio de métodos baseados em microarranjo é divulgada nas patentes U.S. nº 6.799.122;

6.913.879; e 6.996.476.

[0050] Outros métodos para detectar SNPs e Indels incluem méto- dos de extensão de base única (SBE). Exemplos de métodos de SBE incluem, porém sem limitação, aqueles divulgados nas patentes U.S. nºº 6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; e 5.945.283.

[0051] Num outro método para detectar polimorfismos, SNPs e Indels podem ser detectados por meio de métodos divulgados nas pa- tentes U.S. nºs 5.210.015; 5.876.930; e 6.030.787, em que uma sonda de oligonucleotídeo tem um corante repórter fluorescente 5' e um co- rante de arrefecimento brusco 3' covalentemente ligados às extremi- dades 5' e 3' da sonda. Quando a sonda está intacta, a proximidade do corante repórter ao corante de arrefecimento brusco resulta na su- pressão da fluorescência do corante repórter, por exemplo, por trans- ferência de energia do tipo Forster. Durante PCR, iniciadores diretos e reversos hibridizam numa sequência específica do DNA-alvo que flan- queia um polimorfismo, enquanto a sonda de hibridização hibridiza na sequência contendo polimorfismo no produto de PCR amplificado. No ciclo subsequente de PCR, a DNA polimerase com atividade exonu- clease 5' > 3' cliva a sonda e separa o corante repórter do corante de arrefecimento brusco, resultando no aumento de fluorescência do re- pórter.

[0052] Numa outra modalidade, um local ou locais de interesse podem ser diretamente sequenciados com o uso de tecnologias de sequenciamento de ácidos nucleicos. Métodos para sequenciamento de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica e incluem tecnologias fornecidas por 454 Life Sciences (Branford, CT), Agencourt Bioscience (Beverly, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), LI-COR Bioscien- ces (Lincoln, NE), NimbleGen Systems (Madison, WI), Illumina (San Diego, CA) e VisiGen Biotechnologies (Houston, TX). Tais tecnologias de sequenciamento de ácidos nucleicos compreendem formatos, tais como arranjos paralelos de microesferas, sequenciamento por ligação, eletroforese capilar, microchips eletrônicos, "biochips", microarranjos, microchips paralelos e arranjos de molécula única. V. TÉCNICAS DE MELHORAMENTO ADICIONAIS

[0053] Uma planta ou semente de milho fornecida no presente do- cumento também pode ser submetida a melhoramento adicional com o uso de um ou mais métodos conhecidos na técnica, por exemplo, me- lhoramento de pedigree, seleção recorrente, seleção de massa e me- lhoramento por mutação. O melhoramento de pedigree começa com o cruzamento de dois genótipos, tais como uma variedade de milho que compreenda um QTL de resistência a NLB ou alelo de resistência a

NLB ou dois QTLs de resistência a NLB acoplados ou dois alelos de resistência a NLB acoplados fornecidos no presente documento e uma outra variedade de milho que careça de tal local. Se os dois progenito- res originais não fornecem todas as características desejadas, outras fontes podem ser incluídas na população de melhoramento. No méto- do de pedigree, plantas superiores são autocruzadas e selecionadas em sucessivas gerações filiais. Nas gerações filiais sucessivas, a con- dição de heterozigoto dá lugar a variedades homogêneas como resul- tado de autofertilização e seleção. Tipicamente, no método de melho- ramento de pedigree, cinco ou mais gerações filiais sucessivas de au- tocruzamento e seleção são praticadas: F,; para F2; F2 para F3; Fa para Fa; Fa para F5, etc. Após uma quantidade suficiente de endogamia, ge- rações filiais sucessivas servirão para aumentar a semente da varie- dade desenvolvida. A variedade desenvolvida pode compreender ale- los homozigotos em cerca de 95% ou mais de seus locais.

[0054] Além de ser usado para criar uma conversão de retrocru- zamento, o retrocruzamento também pode ser usado em combinação com melhoramento de pedigree. Conforme anteriormente discutido, o retrocruzamento pode ser usado para transferir um ou mais traços es- pecificamente desejáveis de uma variedade, do progenitor doador, pa- ra uma variedade desenvolvida chamada de progenitor recorrente, que tem características gerais agronômicas boas, mas carece daquele tra- ço ou traços desejáveis. Entretanto, o mesmo procedimento pode ser usado para mover a progênie direcionada ao genótipo do parente re- corrente, mas, ao mesmo tempo, reter muitos componentes do parente não recorrente parando o retrocruzamento num estágio inicial e proce- dendo com autocruzamento e seleção. Por exemplo, uma variedade de milho pode ser cruzada com uma outra variedade para produzir uma planta de progênie de primeira geração. A planta de progênie de primeira geração pode, então, ser retrocruzada com uma de suas vari-

edades progenitoras para criar um BC: ou BC>. Progênies são auto- cruzadas e selecionadas de modo que a variedade recém-desenvol- vida tenha muitos dos atributos do progenitor recorrente e, ainda, di- versos dos atributos desejado do progenitor não recorrente. Esta abordagem aproveita o valor e resistências do progenitor recorrente para uso em novas variedades de milho.

[0055] A seleção recorrente é um método usado num programa de melhoramento de planta para aprimorar a população de plantas. O mé- todo implica na polinização cruzada de plantas individuais entre si para formar progênie. As progênies são cultivadas e a progênie superior selecionada por qualquer um dos inúmeros métodos de seleção, que incluem planta individual, progênie de meio-irmão, progênie de irmão pleno e progênie autocruzada. As progênies selecionadas são polini- zadas de modo cruzado entre si para formar progênie para uma outra população. Esta população é plantada e, novamente, as plantas supe- riores são selecionadas para polinização cruzada entre si. A seleção recorrente é um processo cíclico e, portanto, pode ser repetido quan- tas vezes for desejado. O objetivo da seleção recorrente é aprimorar os traços de uma população. A população aprimorada pode, então, ser usada como uma fonte de material de melhoramento para obter novas variedades para uso comercial ou de melhoramento, incluindo a pro- dução de uma linhagem sintética. Uma linhagem sintética é a progênie resultante formada pelo intercruzamento de diversas variedades sele- cionadas.

[0056] A seleção de massa é uma outra técnica útil quando usada em conjunto com seleção acentuada de marcador molecular. Na sele- ção de massa, as sementes de indivíduos são selecionadas com base no fenótipo ou genótipo. Estas sementes selecionadas são, então, se- paradas em lote e usadas para cultivar a próxima geração. A seleção de lotes exige o cultivo de uma população de plantas numa parcela loteada, permitindo a autopolinização das plantas, coletando a semen- te no lote e, então, usando uma amostra da semente coletada no lote para plantar a próxima geração. Além disto, em vez de autopoliniza- ção, a polinização direcionada poderia ser usada como parte do pro- grama de melhoramento.

[0057] O melhoramento por mutação também pode ser usado para introduzir novos traços numa planta ou semente de milho fornecida no presente documento. Mutações que ocorrem espontaneamente ou são artificialmente induzidas podem ser fontes úteis de variabilidade para um melhorista de planta. A meta da mutagênese artificial é aumentar a taxa de mutação para uma característica desejada. Taxas de mutação podem ser aumentadas por muitos meios diferentes, incluindo tempe- ratura, armazenamento de semente de longo prazo, condições de cul- tivo de tecido, radiação (tal como raios X, raios gama (por exemplo, cobalto-60 ou césio-137), nêutrons, (produto da fissão nuclear por urâ- nio-235 num reator atômico), radiação beta (emitida de radioisótopos, tais como fósforo-32 ou carbono-14) ou radiação ultravioleta (de 2500 a 2900 nm)), ou mutagênicos químicos (tais como análogos básicos (5-bromo-uracila), compostos relacionados (8-etóxi cafeína), antibióti- cos (estreptonigrina), agentes alquilantes (mostardas de enxofre, mos- tardas de nitrogênio, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sul- fonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso ou acridinas. A mu- tagênese baseada em transpóson ou T-DNA também é abrangida pela presente divulgação. Uma vez que um traço desejado tenha sido ob- servado através de mutagênese, o traço pode, então, ser incorporado no germoplasma existente por técnicas de melhoramento tradicionais. VI. INFORMAÇÕES DE DEPÓSITO

[0058] Um depósito da linhagem de maís 17 9Y 10, que é divul- gada no presente documento e referenciada nas reivindicações, foi feito com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 Univer-

sity Blvd., Manassas, VA 20110-2209. A data de depósito foi 11 de se- tembro de 2017, e o número de registro para as sementes depositadas é o nº de registro ATOCC PTA-124466. Todas as restrições ao depósito foram removidas, e o depósito destina-se a atender todos os requisitos dispostos no título 37 do C.F.R. $1.801-1.809. O depósito será manti- do no depositário por um período de 30 anos, ou 5 anos após a última solicitação, ou durante a vida útil efetiva da patente, o qual for mais longo, e será substituído, se necessário, durante este período. VII. DEFINIÇÕES

[0059] As definições a seguir são fornecidas para definir melhor a presente invenção e para orientar os versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que especificado de outro modo, os ter- mos devem ser compreendidos de acordo com o uso convencionais por aqueles versado na técnica relevante.

[0060] Conforme usado no presente documento, "helmintosporiose do norte" ou "NLB", ou "helmintosporiose do milho do norte" ou "NCLB", se refere a uma doença de planta causada pelo patógeno fúngico Exserohilum turcicum, que também é conhecido como Helmin- thosporium turcicum e Setosphaeria turcica.

[0061] Conforme usado no presente documento, o termo "configu- ração cis" ou "ligação cis" se refere a um arranjo no qual dois ou mais alelos são ligados ao mesmo cromossomo progenitor. O termo "confi- guração trans" ou "ligação trans" se refere a uma configuração na qual dois ou mais alelos são dispostos em cromossomos progenitores dife- rentes.

[0062] Conforme usado no presente documento, os termos "re- combinante" ou "recombinado" no contexto de um segmento cromos- sômico se refere a sequências de DNA recombinantes que compreen- dem um ou mais locais genéticos numa configuração na qual não são encontrados na natureza, por exemplo, como resultado de um evento de recombinação entre cromossomos homólogos durante a meiose.

[0063] Conforme usado no presente documento, o termo "planta" inclui células de plantas, protoplastos de plantas, células de plantas de cultura de tecidos a partir das quais plantas de maís podem ser rege- neradas, calos de plantas, tufos de plantas e células de plantas que estão intactas em plantas ou partes de plantas, tais como pólen, flores, sementes, folhas, caules e semelhantes.

[0064] Conforme usado no presente documento, o termo "popula- ção" significa uma coleção geneticamente heterogênea de plantas que compartilham uma derivação progenitora comum.

[0065] Conforme usado no presente documento, os termos "varie- dade" e "cultivar" significam um grupo de plantas similares que, por seus pedigrees genéticos e desempenho, podem ser identificadas a partir de outras variedades na mesma espécie.

[0066] Conforme usado no presente documento, um "alelo" se re- fere a uma dentre duas ou mais formas alternativas de uma sequência genômica num dado local num cromossomo.

[0067] Um "local de traço quantitativo (QTL)" é uma localização cromossômica que codifica pelo menos um primeiro alelo que afeta a expressividade de um fenótipo.

[0068] Conforme usado no presente documento, um "marcador" significa uma característica detectável que pode ser usada para a dis- criminação entre organismos. Exemplos de tais características inclu- em, porém sem limitação, marcadores genéticos, marcadores bioquí- micos, metabólitos, características morfológicas e características agronômicas.

[0069] Conforme usado no presente documento, o termo "fenótipo" significa as características detectáveis de uma célula ou organismo que podem ser influenciadas por expressão gênica.

[0070] Conforme usado no presente documento, o termo "genóti-

po" significa a constituição alélica específica de uma planta.

[0071] Conforme usado no presente documento, variedade de "eli- te" ou "cultivada" significa qualquer variedade que tenha resultado do melhoramento e seleção para desempenho agronômico superior. O termo "cultivado" em referência a uma planta ou variedade inclui as linhagens progenitoras de uma variedade de maís híbrida cultivada. Uma "planta de elite" se refere a uma planta que pertence a uma vari- edade de elite. Várias variedades de elite estão disponíveis e são co- nhecidas por aqueles versados na técnica de melhoramento de mais. Uma "população de elite" é um gama de indivíduos ou variedades de elite que pode ser usada para representar o estado da técnica em ter- mos de genótipos agronomicamente superiores de uma dada espécie de cultura, tal como maís. De modo similar, um "germoplasma de elite" ou cepa de germoplasma de elite é um germoplasma agronomicamen- te superior.

[0072] Conforme usado no presente documento, o termo "introgre- dido", quando usado em referência a um local genético, se refere a um local genético que foi introduzido num novo fundo genético, tal como através de retrocruzamento. A introgressão de um local genético pode ser alcançada através dos métodos de melhoramento de plantas e/ou por meio de métodos de genética molecular. Tais métodos de genética molecular incluem, porém sem limitação, várias técnicas e/ou métodos de transformação de plantas que fornecem recombinação homóloga, recombinação não homóloga, recombinação sítio-específica e/ou mo- dificações genômicas que fornecem substituição de local ou conversão de local.

[0073] Conforme usado no presente documento, "transgênico" significa uma planta ou semente cujo genoma foi alterado pela integra- ção estável de DNA recombinante. Uma linhagem transgênica inclui uma planta regenerada a partir de uma célula de planta originalmente transformada e plantas transgênicas de progênie de gerações posteri- ores ou cruzamentos de uma planta transformada.

[0074] Conforme usado no presente documento, o termo "ligado" ou "geneticamente ligado", quando usado no contexto de marcadores de ácidos nucleicos e/ou regiões genômicas, significa que os marcado- res e/ou regiões genômicas estão localizados próximos no mesmo grupo de ligação ou cromossomo, de modo que tendam a segregar em conjunto na meiose.

[0075] Conforme usado no presente documento, "local de resis- tência" significa um local associado à resistência ou tolerância a doen- ças. Por exemplo, um local de resistência de acordo com a presente invenção pode, em certas modalidades, controlar a resistência ou a suscetibilidade a NLB.

[0076] Conforme usado no presente documento, "alelo de resis- tência" significa a sequência de ácidos nucleicos associada à resistên- cia ou tolerância a doenças.

[0077] Conforme usado no presente documento "resistência" ou "resistência aprimorada" numa planta a condições de doença é uma indicação de que a planta tem mais capacidade para reduzir o ônus da doença do que uma planta não resistente ou menos resistente. Resis- tência é um termo relativo que indica que uma planta "resistente" tem mais capacidade para reduzir o ônus da doença em comparação com uma planta (menos resistente) diferente (por exemplo, uma variedade de planta diferente) cultivada em condições de doença similares. Uma pessoa versada na técnica entenderá que a resistência da planta a condições de doença varia amplamente e pode representar um espec- tro de fenótipos mais resistentes ou menos resistentes. Entretanto, através de uma simples observação, uma pessoa versada na técnica pode, em geral, determinar a resistência relativa de diferentes plantas, variedades de plantas ou famílias de plantas sob condições de doença e, além disto, reconhecerá também as gradações fenotípicas de "resis- tente".

EXEMPLOS EXEMPLO 1. FONTES DE RESISTÊNCIA À HELMINTOSPORIOSE

DO NORTE

[0078] A resistência à helmintosporiose do norte (NLB) no mais é conferida tanto pela resistência qualitativa (monogênica) como pela resistência quantitativa (poligênica). Genes quantitativos para resistên- cia a NLB no maís que foram bem caracterizados são Ht1, Ht2, Ht3, HtN e HtM. Tanto Ht2 como HtN residem num agrupamento de genes de resistência a NLB no cromossomo 8 (NLB 8.1), enquanto Ht1 resi- de no cromossomo 2. Há isolados conhecidos de NLB que podem su- perar cada um destes genes de resistência quantitativa. Os isolados são caracterizados em raças pelos genes de resistência que podem superar. Assim, as raças de NLB são caracterizadas como Raça O, Raça 1, Raça 2, Raça 3, Raça N, Raça M e todas as permutações possíveis das mesmas (por exemplo, Raça 12, Raça 2N, etc.), em que o número ou letra da raça indica o gene Ht no qual o isolado é virulen- to. Através de múltiplos ensaios em estufa, identificou-se que o empi- lhamento de Ht1, Ht2 e HtN em conjunto num híbrido deve fornecer resistência de amplo espectro contra raças caracterizadas de NLB (Tabela 1). TABELA 1. SUMÁRIO DE TRIAGENS DIFERENCIAIS PARA 1SO- LADOS DE NLB E PILHAS DE GENES HT. Combinação 12EXS01 12EXS02/12EXS03 12EXS07 Em pe e EE e]

E EEEF EF FS pe E e E E q io pm e e e E pes e fe e e pes e RR E ES

EXEMPLO 2. CARACTERIZAÇÃO DO AGRUPAMENTO DE GENES NLB 8.1

[0079] Ht2 e HtN são ligados muito fortemente, com distância físi- ca de apenas aproximadamente 113 kb entre os genes. Dada a rela- ção entre a razão de distância física e genética de aproximadamente 2 Mb/cM em torno do agrupamento de genes NLB 8.1 (Figura 1), os 113 kb entre Ht2 e HtN é aproximadamente equivalente a 0,05 cM. Embora Ht2 e HtN possam ser empilhados numa configuração trans num híbri- do, esta opção requer seleção independente em dois traços e impede a implantação de outras fontes de resistência no agrupamento de ge- nes NLB 8.1. EXEMPLO 3. ACOPLAMENTO DE LOCAIS HT2 E HTN

[0080] A fim de implantar os locais Ht2 e HtN fortemente ligados numa configuração acoplada num fundo de milho doce de elite, um evento de recombinação foi primeiro gerado num fundo de milho ma- duro para permitir a genotipagem com o uso de lascas de semente. Isto permitiria a introgressão de locais Ht2 e HtN numa configuração acoplada em doadores de milho doce de elite. Um evento de acopla- mento entre Ht2 e HtN permite, ainda, que os dois genes sejam seleci- onados e implantados como um único traço, reduzindo, assim, os esfor- ços de fenotipagem e genotipagem de marcadores e permitindo a im- plantação simultânea de outros traços desejados. Para este propósito, um cruzamento entre dois endocruzamentos de milho maduro, BSESHTN (que porta o gene HtN) e A619HT2 (que porta o gene Ht2), foi realizado (B68HTN e A619HT2 disponíveis junto à U.S. National Plant Germplasm System). Plantas F2 do cruzamento B6ES8BHTN/A619HT2 que eram hete- rozigotos para HtN e Ht2 foram selecionadas e autocruzadas para produzir uma grande população de grãos F3.

[0081] Com base na taxa de recombinação estimada em torno da região NLB 8.1 e nas probabilidades de amostragem binomial, deter-

minou-se que era necessário criar aproximadamente 50.000 progênies para identificar recombinantes entre HtN e Ht2 na configuração dese- jada (Figura 2).

[0082] 50.000 grãos de F3 foram submetidos a raspagem de se- mentes para identificar recombinantes putativos entre dois marcadores de flanqueamento a montante e dois marcadores de flanqueamento a jusante (Tabelas 2, 3). Destes 50.000 grãos de F3 em lascas, 39 re- combinantes putativos na configuração desejada foram identificados. TABELA 2. MARCADORES USADOS PARA DETECTAR RECOM-

BINANTES PUTATIVOS E EVENTOS DE RECOMBINAÇÃO TIDOS COMO ALVO.

õ o $ Ê a ls Sl gl gl she & |) v O o oh dl O o = Cs = Zz zZ ç 2/7 2 E Ss £ ore çxelgajsa º E gg tajto & 2º 8 nn 3 ni ne O E | em Er e ee) esa fr fe fe fe Jens Je | TABELA 3. IDENTIFICAÇÃO DE RECOMBINANTES PUTATIVOS.

Posição Recombi- Recombinan- Marcador favo- A6G19HT2 |B68HTN Física ms nante-alvo 1 |te-alvo 2 raveis Q-NZMAYO09401770 |152,245,739 |C cer Tc c | e 7 Q-ZMHt2 152,245,836 |T TT | 6 G|T TT 6 Q-NZMAYO009238970 |152,358,289 |C TT |c Cc T | e c Q-NZMAYO009430172 |152,379,449 |C TT |c Cc T | e c

EXEMPLO 4. VALIDAÇÃO DE EVENTOS DE RECOMBINAÇÃO PU- TATIVA DE HT2/HTN POR GENOTIPAGEM

[0083] Recombinantes putativos foram semeados, amostrados pa- ra tecido foliar e submetidos a duas rodadas de validação genotípica com o uso do mesmo conjunto de marcadores TaqMan. O evento de recombinação tido como alvo entre Ht2 e HtN foi validado genotipica- mente em apenas quatro dos 39 recombinantes putativos (Tabela 4). Estes 4 recombinantes foram autocruzados para obter espigas de F4. A semente de F4 foi obtida a partir de dois dos eventos ("Evento 0009" e "Evento 0299"), e os inventários destes 2 recombinantes putativos foram plantados para autocruzamento e obtenção de espigas de F5 a partir de recombinantes fixos. TABELA 4. GENÓTIPOS F3 PARA PLANTAS NAS QUAIS O EVEN- TO DE RECOMBINAÇÃO TIDO COMO ALVO FOI VALIDADO. Q-NZMAYO009401770 | 152,245,739 Cc Cc Cc Cc Cc Cc T Cc Cc Q-ZMHt2 152,245,836 T T T T T T G T T Q-NZMAYO009238970 | 152,358,289 Cc Cc T Cc T Cc Cc Cc T EXEMPLO 5. VALIDAÇÃO DE EVENTOS DE RECOMBINAÇÃO PU- TATIVA DE HT2/HTN POR FENOTIPAGEM

[0084] Os dois eventos de recombinação putativa independentes entre Ht2 e HtN ("Evento 0009" e "Evento 0299") foram recuperados na geração F3 após a raspagem de 50.000 grãos a partir de plantas F2 heterozigotos e validados fenotipicamente como linhagens F5 com no uso dos isolados Raça 2 e Raça N.

[0085] Os dois recombinantes F3 foram usados para derivar linha- gens F5 fixadas para eventos de acoplamento putativo de Ht2-HtN. Plan- tas F4 foram genotipadas através da região de traço de 152,245,739 a 152,379,449 bp (Tabela 5), e plantas que estavam fixadas através da região de traço foram autocruzadas para desenvolve as linhagens F5. TABELA 5. GENÓTIPOS DE LINHAGENS PROGENITORAS E RECOM- BINANTES F4 SELECIONADOS. Marcador Ligação de traço | Posição Física & 2 2 2 3 | Ss is < mn ÂE WE

[0086] Duas destas linhagens F5 foram usadas juntamente com verificações do progenitor para validação fenotípica do evento de aco- plamento. As entradas específicas usadas para validação fenotípica fo- ram: A619 (isolinhagem progenitora fêmea sem Ht2); A619Ht2 (linhagem progenitora fêmea); B68 (isolinhagem progenitora macho sem HtN); B68HtN (linhagem progenitora macho); Evento 0009; Evento 0229.

[0087] Estas entradas foram plantadas em duas experiências em estufa. Cada experiência foi plantada como um projeto de blocos com- pleto randomizado com 2 replicações. A primeira experiência foi inocu- lada com um isolado da Raça 2 (Et212) de helmintosporiose do norte (NLB). A segunda experiência foi inoculada com um isolado da Raça N (Et234) de NLB. O tipo de raça destes isolados foi determinado com ba- se em testes anteriores em painéis diferenciais, bem como nas reações nas linhagens progenitoras. As duas experiências foram conduzidas se- paradamente para evitar contaminação cruzada com os dois isolados.

[0088] Resultados das experiências com a Raça 2 e a Raça N são mostrados na Figura 3. Para a experiência com a Raça 2, A619, B68 e A619Ht2 foram todos suscetíveis ao isolado da Raça 2, enquanto B68HtN foi resistente conforme esperado. Tanto o Evento 0009 como o Evento 0299 foram resistentes ao isolado da Raça 2 e mostraram a mesma reação resistente ao tipo "matizado" (lesões pontuais) que o B68HtN. Portanto, tanto o Evento 0009 como o Evento 0299 portam o alelo HtN resistente do B6SHtN. Para a experiência da Raça N, A619, B68 e B68HtN foram suscetíveis, enquanto A619Ht2 foi resistente con- forme esperado. O Evento 0009 foi resistente ao isolado da Raça N, enquanto o Evento 0299 foi suscetível. O Evento 0009 mostrou a mesma reação de tipo de lesão clorótica que o A619Ht2, enquanto o Evento 0299 mostrou grandes lesões do tipo suscetível. Portanto, o Evento 0009 herdou o alelo Ht2? resistente do A619Ht2, enquanto o Evento 0299 porta o alelo suscetível do B68SHtN. Estes resultados de- monstram que os alelos resistentes nos locais Ht2 e HtN foram aco- plados com sucesso no Evento 0009 fixado. EXEMPLO 6. INTROGRESSÃO DE EVENTOS DE RECOMBINAÇÃO DE HT2/HTN

[0089] Um recombinante putativo entre Ht2 e HtN, "Evento 0009", é validado, demonstrando que Ht2 e HtN foram ligados na configura- ção de acoplamento. A linhagem "Evento 0009" passou por 4 gera- ções de autocruzamento e foi designada "17 9Y 10". Os locais aco- plados Ht2 e HtN na linhagem madura 17 9Y 1(Q podem ser introgre- didos em endocruzamentos de milho doce de elite ou qualquer outro Zea mays L. ssp. O evento de acoplamento é identificado inequivoca- mente no germoplasma de melhoramento e selecionado para segregar populações de melhoramento com o uso de uma combinação de um marcador associado a Ht2 a montando do ponto de interrupção da re- combinação (por exemplo, Q-NZMAYO009401770) e um segundo mar- cador associado a HtN a jusante do ponto de interrupção da recombi- nação (por exemplo, Q-NZMAY009238970). Esta estratégia pode dis- tinguir plantas portadoras do evento de acoplamento de plantas porta- doras de HItN isoladamente, plantas portadoras de Ht2 isoladamente ou plantas que não são portadoras de alelos resistentes.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Segmento de DNA recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro alelo que compreende um local Ht2 e confere resistência a NLB e um segundo alelo que compreende um local HtN e confere resistência a NLB.

2. Segmento de DNA recombinante, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro alelo é derivado de uma planta da linhagem A619HT?2 e o referido segundo alelo é derivado de uma planta da linhagem B68HTN.

3. Segmento de DNA recombinante, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido segmento cro- mossômico compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2,7, 12 e 12.

4. Segmento de DNA recombinante, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que é definido, ainda, como compreendido numa célula.

5. Segmento de DNA recombinante, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que é definido, ainda, como compreendido numa semente.

6. Segmento de DNA recombinante, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que é definido, ainda, como compreendido numa planta.

7. Segmento de DNA recombinante, de acordo com a rei- vindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido segmento de DNA confere resistência de amplo espectro a NLB à referida planta.

8. Método para produzir uma planta de maís que exibe re- sistência de amplo espectro a NLB, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: a) introgredir uma planta de maís que compreende o seg- mento de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, consi-

go mesma ou com uma segunda planta de maís de um genótipo dife- rente para produzir uma ou mais plantas de progênie; e b) selecionar uma planta de progênie que compreende o re- ferido segmento cromossômico recombinante, em que a referida sele- ção compreende seleção auxiliada por marcador.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida seleção auxiliada por marcador compreen- de a detecção de pelo menos um alelo num local genômico flanqueado pelos locais de marcador Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e Q- NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16) no cromossomo 8.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida seleção auxiliada por marcador compreen- de a detecção de pelo menos um alelo num local genômico flanqueado pelos locais de marcador Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) e Q- NZMAYO009238970 (SEQ ID NO: 11) no cromossomo 8.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida seleção auxiliada por marcador compreen- de a detecção de pelo menos um alelo num local geneticamente ligado a um local de marcador selecionado a partir do grupo que consiste em Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1), Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6), Q- NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) e Q-NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16).

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a referida seleção auxiliada por marcador compre- ende a detecção de pelo menos um alelo num local geneticamente |i- gado a cada um dos locais de marcador selecionados a partir do grupo que consiste em Q-NZMAYO09401770 (SEQ ID NO: 1) e Q- NZMAYO009238970 (SEQ ID NO: 11).

13. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a planta de progênie é uma planta de progênie F2-Fe.

14. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a produção da planta de progênie compreende retro- cruzamento.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o retrocruzamento compreende de 2 a 7 gerações de retrocruzamento.

16. Método de transformação de planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) introduzir o segmento de DNA recombinante, como defi- nido na reivindicação 1, numa célula de planta; e b) regenerar uma planta da referida célula que compreen- de o segmento de DNA recombinante.

17. Método para identificar uma planta de maís que exibe resistência de amplo espectro a NLB, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: a) obter uma amostra de ácidos nucleicos a partir de pelo menos uma primeira planta de mais; e b) identificar, na referida amostra, a presença de um alelo num local genômico flanqueado pelos locais de marcador Q- NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1) e Q-NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16) no cromossomo 8, em que o local genômico confere, à planta de mais, a referida resistência de amplo espectro a NLB.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que a referida identificação compreende a detecção, na referida amostra, da presença de pelo menos um alelo num local ge- nômico flanqueado pelos locais de marcador Q-ZMHt2 (SEQ ID NO: 6) e Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) no cromossomo 8.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que a referida identificação compreende a detecção, na referida amostra, da presença de pelo menos um alelo num local ge-

neticamente ligado a um local de marcador selecionado a partir do grupo que consiste em Q-NZMAYO009401770 (SEQ ID NO: 1), Q- ZMHt2 (SEQ ID NO: 6), Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) e Q- NZMAYO009430172 (SEQ ID NO: 16).

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que a referida identificação compreende a detecção, na referida amostra, da presença de pelo menos um alelo num local ge- neticamente ligado a cada um dos locais de marcador selecionados a partir do grupo que consiste em Q-NZMAY009401770 (SEQ ID NO: 1) e Q-NZMAY009238970 (SEQ ID NO: 11) no cromossomo 8.