ES2711627T3 - Marcadores genéticos para resistencia a orobanca en girasol - Google Patents

Abstract

Un método para identificar una planta de girasol o germoplasma de girasol que tiene un fenotipo de resistencia del Sistema II a Orobanche, que comprende detectar en una planta de girasol o germoplasma de girasol al menos un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP por sus siglas en inglés) de un locus marcador que está asociado con dicho fenotipo, en donde el locus marcador está representado por la SEQ ID NO: 2 o presenta una frecuencia de recombinación inferior al 5 % con respecto al locus marcador de la SEQ ID NO: 2 y mapea para el grupo de unión 4.

Description

DESCRIPCION

Marcadores geneticos para resistencia a orobanca en girasol

Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a metodos para usar marcadores geneticos moleculares para caracterizar el germoplasma de girasol para resistencia a Orobanche cumana.

Antecedentes

El girasol cultivado (Helianthus annuus L.) se esta cultivando como un cultivo de semillas oleaginosas cada vez mas importante en muchas regiones del mundo templadas y semisecas.

El girasol cultivado es una fuente mundial importante de aceite vegetal. Los tipos de aceite de girasoles contienen 40 a 48 por ciento o mas de aceite en la semilla. El aceite de girasol esta valorado como un aceite comestible debido a su alto nivel de grasas insaturadas y su color claro. El aceite de girasol se utiliza para ensaladas, aceite de cocina o margarina. El contenido de protefnas de la harina de girasol preparada a partir de semillas despues de la extraccion de aceite es util como alimento para el ganado. Las semillas de ambas variedades de aceite y de confiterfa del girasol cultivado son utiles como alimento para aves.

La planta parasita orobanca (Orobanche Spp.) se ha vuelto un factor limitativo para los cultivos de girasol en los pafses infestados. La disminucion en el rendimiento del cultivo puede alcanzar el 95 % en un campo afectado. Las especies de Orobanche particulares que afectan al girasol incluyen Orobanche aegyptiaca Pers., O. ramosa L., O. minor Sm., O. cumana Wallr. y O. cernua Loefl.

Orobanche cumana Wallr. (tambien conocido como O. cernua Loefl.) es una plaga severa en el girasol en Europa oriental y se ha extendido por el sur de Europa. En los ultimos anos, se ha observado el progreso de esta planta parasita, su introduccion en nuevos pafses y el desarrollo de nuevas razas y mas virulentas. Orobanche presenta un riesgo mundial, y algunas especies tales como O. minor han aparecido como exoticas en los Estados Unidos.

A partir de 1996, se observo la aparicion de tres nuevas razas de orobanca en campos en Turqufa, Espana y Bulgaria. Para el ano 2000, el numero de campos afectados en estas areas habfa aumentado bruscamente. Algunos productores dejaron de cultivar el girasol debido a la reduccion significativa experimentada en la productividad del grano.

Estas malas hierbas son holoparasitos de rafz obligados. Las especies de Orobanche son muy diffciles de eliminar porque a excepcion de sus partes de flor, viven en el suelo; sus semillas son diminutas y se producen prolfficamente, se dispersan facilmente y son muy longevas. Por lo tanto, los herbicidas utilizados actualmente en el girasol proporcionan un control inadecuado.

Los medios de control de Orobanche incluyen agentes de control biologico, aislamiento de los genes responsables de la resistencia de Orobanche en el girasol, y el desarrollo de lfneas de girasol resistentes.

Se ha informado que Fusarium oxysporum f. sp. orthoceras puede ser un agente potencial para el control biologico de Orobanche cumana (Thomas-Heiko, et al., (Septiembre de 1998) Biological Control. 13(1):41-48). Sin embargo, aun no se han determinado los metodos de aplicacion y las dosis uniformes en condiciones de campo.

El gen Or3 confiere resistencia al ataque de Orobanche pero se conoce por ser eficaz solo contra la raza C. Al menos se han informado seis variantes de razas de Orobanche (Perez-Vich, et al., (2004) Theor. Appl. Gen. 109:92-102; Antonova, T.S., et al., (1996) Weed Research 36(2):113-121).

La identificacion y la utilizacion de fuentes adicionales de resistencia a Orobanche es beneficiosa en gestionar los cambios de razas y en minimizar la perdida de produccion.

Breve descripcion de la invencion

Esta invencion se refiere a los metodos de uso de marcadores geneticos para la caracterizacion de germoplasma del girasol con respecto a la resistencia del Sistema 2 a Orobanche cumana. Las plantas y lfneas identificadas que tienen rasgos de resistencia a Orobanche altamente hereditarios son utiles en el desarrollo de cultivares comerciales de cultivos de girasol que tienen rasgos valiosos de calidad agronomica y/o de las semillas.

La invencion proporciona un metodo para identificar una planta de girasol o germoplasma de girasol que tiene un fenotipo de resistencia del Sistema II a Orobanche, que comprende detectar en una planta de girasol o germoplasma de girasol al menos un polimorfismo de un solo nucleotido (SNP por sus siglas en ingles) de un locus marcador que esta asociado con dicho fenotipo, en donde el locus marcador esta representado por la SEQ ID NO: 2 o presenta una frecuencia de recombinacion inferior al 5 % con respecto al locus marcador de la SEQ ID NO: 2 y mapea para el grupo de union 4.

La invencion proporciona ademas el uso de un marcador para generar marcadores adicionales para la resistencia a Orobanche; en donde dicho marcador es un marcador genetico asociado con la resistencia del Sistema II a Orobanche y mapeo para el grupo de union 4 de Helianthus annuus, comprendiendo dicho marcador la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 o una variante que retiene al menos uno de los polimorfismos de la SEQ ID NO: 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1.

La invencion aun proporciona ademas un metodo para identificar genes o agrupaciones de genes en el genoma del girasol que dan lugar a la resistencia a Orobanche, comprendiendo amplificar una region cromosomica identificada por hibridacion a un cebador seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 9, o 10, y comprendiendo ademas opcionalmente rondas sucesivas de cribado y aislamiento de clones para construir un contigo que comprende un marco de lectura abierto.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 proporciona un mapa de marcador parcial del grupo de union 4 del girasol, incluyendo la posicion de un supuesto gen de resistencia a orobanca del Sistema 2 (BRSII o BRII).

La figura 2 proporciona datos de mapeo adicionales con referencia al gen BRSII, incluyendo un marcador SNP para el rasgo de resistencia.

La figura 3 es un alineamiento de BestFit de alelos resistentes y susceptibles de los marcadores de BRSII (SEQ ID NOS: 2 y 1 respectivamente). Los polimorfismos estan indicados por asteriscos.

La figura 4 es una tabla que proporciona datos de pedigrf y fenotfpicos para la progenie de la poblacion de mapeo.

Breve descripcion de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 representa el alelo marcador para la susceptibilidad a Orobanche del Sistema 2.

La SEQ ID NO: 2 representa el alelo marcador para la resistencia a Orobanche del Sistema 2.

Las SEQ ID NO: 3 y 4 representan sondas utilizadas para identificar los alelos marcadores susceptibles a BRSII y resistentes a BRSII en las posiciones 105-106 de las SEQ ID NO: 1 y 2.

Las SEQ ID NO: 5 y 6 representan cebadores directos e inversos, respectivamente, para amplificar los alelos marcadores en las posiciones 105-106 de las SEQ ID NO: 1 y 2.

Las SEQ ID NO: 7 y 8 representan sondas utilizadas para identificar los alelos marcadores susceptibles a BRSII y resistentes a BRSII en la posicion 142 de las SEQ ID NO: 1 y 2.

Las SEQ ID NO: 9 y 10 representan cebadores inversos y directos, respectivamente, para amplificar los alelos marcadores en la posicion 142 de las SEQ ID NO: 1 y 2.

Descripcion detallada de la invencion

Aunque las secuencias especfficas de ADN que codifican protefnas estan generalmente bien conservadas dentro de una especie, las regiones no codificantes tienden a acumular polimorfismo, y por lo tanto pueden variar entre individuos de la misma especie. Dichas regiones proporcionan la base para numerosos marcadores geneticos moleculares. En general, cualquier polimorfismo de acido nucleico heredado diferencialmente que se segrega de la progenie es un marcador molecular potencial. La variabilidad genomica de cualquier origen, incluyendo inserciones, deleciones, duplicaciones, elementos repetitivos, mutaciones puntuales, eventos de recombinacion, y la presencia y la secuencia de elementos transponibles. Tambien estan bien establecidos los metodos para detectar marcadores moleculares.

Los marcadores que corresponden a polimorfismos geneticos entre los miembros de una poblacion se pueden detectar mediante numerosos metodos, bien establecidos en la tecnica, como los polimorfismos de longitud del fragmento de restriccion, marcadores de isoenzimas, hibridacion especffica de alelos (ASH por sus siglas en ingles), secuencias variables amplificadas del genoma de la planta, replicacion de la secuencia autosostenida, repeticion de la secuencia simple (SSR por sus siglas en ingles), polimorfismo de un solo nucleotido (SNP), o polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP por sus siglas en ingles). Los marcadores de la presente divulgacion son SNP.

Los marcadores geneticos moleculares pueden facilitar el mapeo y la seleccion de rasgos agrfcolamente importantes. Un marcador molecular que demuestra un desequilibrio de union con un rasgo fenotfpico deseado puede ser una herramienta util para la seleccion asistida por marcador (MAS), que proporciona un medio para la identificacion rapida de individuos o lfneas deseables. La introgresion de genes preferidos en un cultivar tambien se facilita por MAS.

Los componentes de la implementacion de MAS pueden incluir: (i) la creacion de un mapa genetico denso de marcadores moleculares, (ii) la deteccion de asociaciones estadfsticas entre un marcador y la variabilidad fenotfpica, (iii) la definicion de un conjunto de alelos marcadores deseables, y (iv) la extrapolacion de esta informacion al conjunto actual de germoplasma de fitomejoramiento para permitir que se tomen decisiones de seleccion basadas en marcadores.

En general, la identificacion de marcadores para la aplicacion de MAS implica el fenotipado del(los) rasgo(s) de interes y el genotipado de la poblacion segregadora de progenies con marcadores polimorficos y el mapeo genetico del rasgo deseado. Los detalles del mapeo se describen en otra parte en el presente documento. Los loci polimorficos en la vecindad del rasgo mapeado se eligen como marcadores potenciales (tfpicamente, un locus marcador mas proximo al locus de interes es un marcador preferido). El analisis de union se utiliza despues para determinar que secuencia polimorfica del alelo marcador demuestra una posibilidad estadfstica de cosegregacion con el fenotipo deseable (por lo tanto, un "alelo marcador"). Por lo tanto, es posible utilizar este marcador para el cribado rapido y preciso de las lfneas de plantas para el alelo marcador sin la necesidad de cultivar las plantas a traves de su ciclo de vida y esperar las evaluaciones fenotfpicas. Asimismo, esto permite la seleccion genetica del alelo particular incluso cuando se desconoce la identidad molecular de QTL (por sus siglas en ingles, locus de rasgos cuantitativos) de tolerancia real. Se pueden tomar muestras de tejidos, por ejemplo, de la primera hoja de la planta y cribarse con el marcador molecular apropiado, y en unos dfas se determina cual progenie avanzara. El uso de marcadores unidos tambien elimina el impacto de los factores medioambientales que pueden influir en la expresion fenotfpica, y, a diferencia de las evaluaciones de campo, el analisis de marcadores se puede realizar en cualquier momento del ano.

Los fitomejoradores buscan combinaciones de loci con genes para el alto rendimiento y otros rasgos deseables para desarrollar variedades mejoradas. El cribado de grandes numeros de muestras mediante metodos no moleculares (por ejemplo, la evaluacion de rasgos en plantas de girasol) puede ser costoso, lento y poco fiable. El uso de los marcadores polimorficos descritos en el presente documento proporciona un metodo eficaz para seleccionar variedades resistentes en programas de fitomejoramiento. Cuando una poblacion esta segregando multiples loci que afectan a uno o multiples rasgos, por ejemplo, multiples loci implicados en la tolerancia, o multiples loci cada uno implicado en la tolerancia o resistencia a distintas enfermedades, la eficacia de MAS en comparacion con el cribado fenotfpico se vuelve incluso mayor, debido a que todos los loci pueden evaluarse en el laboratorio junto con una unica muestra de ADN.

Una aplicacion especffica de MAS en el cultivo de plantas es ayudar en la recuperacion eficaz del genotipo progenitor recurrente en el fitomejoramiento del retrocruzamiento. En el retrocruzamiento asistido por marcador de marcadores especfficos (y QTL asociados) de una fuente donante, por ejemplo, para un contexto genetico de elite, se selecciona entre la progenie de retrocruzamiento el rasgo del donante y despues se utiliza el retrocruzamiento repetido para que la lfnea de elite reconstituya la mayor parte del genoma del contexto de elite como sea posible.

Por lo tanto, los marcadores y metodos divulgados en el presente documento pueden utilizarse para guiar la seleccion o el fitomejoramiento asistido por marcador de lfneas de girasol con el complemento deseado de formas alelicas de segmentos de cromosomas asociados con un rendimiento agronomico superior. Ciertos aspectos de la divulgacion abarcan los acidos nucleicos que corresponden a los marcadores, que incluyen pero no se limitan a sondas, cebadores de amplificacion, y productos de amplificacion, todos los cuales son utiles en el genotipado de plantas, asf como el uso de dichos acidos nucleicos para el paseo genomico para identificar secuencias adicionales o contigos adyacentes al(los) marcador(es) para la identificacion de polimorfismo(s) de secuencia adicional(es) o alternativo(s) para el uso en la seleccion asistida por marcador. Mas en general, estos marcadores son utiles en la saturacion de un mapa genetico de girasol.

La presente divulgacion tambien se extiende a un metodo de fitomejoramiento de plantas parentales para formar plantas de girasol de la progenie y a estas plantas de la progenie, per se. Los metodos para cruzar y cultivar plantas de girasol estan bien dentro de la capacidad de los expertos en la tecnica. La progenie resultante puede evaluarse para los alelos asociados con la resistencia y se puede seleccionar la progenie deseada. Dichas plantas o semillas de la progenie pueden venderse en el mercado para la produccion del girasol, utilizadas para alimentos, procesadas para obtener un constituyente deseado, o utilizadas adicionalmente en rondas posteriores de fitomejoramiento. Al menos una de las plantas parentales es una planta divulgada en el presente documento que comprende al menos una de las formas alelicas de los marcadores divulgados en el presente documento, de manera que la progenie es capaz de heredar el alelo.

La diversidad genetica es importante para la ganancia genetica a largo plazo en cualquier programa de fitomejoramiento. Con diversidad limitada, la ganancia genetica se estabilizara eventualmente cuando todos los alelos favorables se hayan fijado dentro de la poblacion de elite. Un objetivo es incorporar la diversidad en un grupo de elite sin perder la ganancia genetica que ya se ha hecho y con la minima inversion posible. MAS proporciona una indicacion de que regiones genomicas y que alelos favorables de los ancestros originales se han seleccionado y conservado a lo largo del tiempo, facilitando esfuerzos para incorporar una variacion favorable de fuentes de germoplasma exoticas (progenitores que no estan relacionados con el grupo de genes de elite) con la esperanza de encontrar alelos favorables que no existen actualmente en el grupo de genes de elite.

Por ejemplo, los marcadores divulgados en el presente documento se pueden utilizar para MAS en cruces que implican lfneas de girasol de elite exoticas sometiendo a la progenie segregadora a MAS para mantener los alelos de principal productividad, junto con los alelos marcadores de resistencia en el presente documento.

Ademas, la "clonacion de genes posicionales" utiliza la proximidad de un marcador de tolerancia para definir ffsicamente un fragmento cromosomico aislado que contiene un QTL de tolerancia. El fragmento cromosomico aislado puede producirse mediante dichos metodos bien conocidos como la digestion de ADN cromosomico con una o mas enzimas de restriccion, o mediante la amplificacion de una region cromosomica en una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingles) o cualquier reaccion de amplificacion alternativa adecuada. El fragmento digerido o amplificado esta ligado tfpicamente en un vector adecuado para la replicacion, y, por ejemplo, la expresion, del fragmento insertado. Los marcadores que son adyacentes a un marco de lectura abierto (ORF por sus siglas en ingles) asociado con un rasgo fenotfpico pueden hibridarse con un clon de ADN (por ejemplo, un clon de una biblioteca de ADN genomico), identificando asf un clon en el que se localiza un ORF (o un fragmento de un ORF). Si el marcador esta mas distante, un fragmento que contiene el marco de lectura abierto se identifica por rondas sucesivas de cribado y aislamiento de clones que juntos comprenden una secuencia contigua de ADN, un proceso denominado "paseo cromosomico", que da como resultado un "contigo" o "mapa de contigos". Los protocolos suficientes para guiar a un experto en el aislamiento de clones asociados con marcadores unidos se encuentran en, por ejemplo, Berger, Sambrook y Ausubel, infra.

Ciertos mapas de union del genoma del girasol estan disponibles; vease, por ejemplo, Tang, et al., "PCR-multiplexes for a genome-wide framework of simple sequence repeat marker loci in cultivated sunflower," (2003) Theor. Appl.Genet. 107:6-19; Yu, et al., "Towards a Saturated Molecular Genetic Linkage Map for Cultivated Sunflower," (2003) Crop Science 43:367-387; Lai, et al., "Identification and Mapping of SNPs from ESTs in Sunflower," (2005) Theor. Appl. Genet. 111:1532-1544; Kusterer, et al., "Molecular Mapping of the Fertility Restoration Locus Rf1 in Sunflower and Development of Diagnostic Markers for the Restorer Gene," (2005) Euphytica 143:35-42; Perez-Vich, et al., "Molecular Mapping of Nuclear Male Sterility Genes in Sunflower," (2005) Crop Sci. 45:1851-1857; y Chen, et ^{al., "Molecular Mapping of a Nuclear Male-Sterility Gene in Sunflower using} TrAp ^{and SSR Markers," (2006) Theor.} Appl. Gen. 113(1): 122-127. Un marcador puede estar enlazado a uno o mas loci de interes, por ejemplo, un unico gen, un locus de rasgos cuantitativos (QTL), u otro marcador.

La mayorfa de marcadores geneticos se basan en una o mas propiedades de acidos nucleicos para su deteccion. Por ejemplo, algunas tecnicas para detectar marcadores geneticos utilizan la hibridacion de una sonda de acidos nucleicos a acidos nucleicos que corresponden al marcador genetico. Los formatos de hibridacion incluyen, pero no se limitan a, fase en solucion, fase solida, fase mixta o ensayos de hibridacion in situ. Los marcadores de polimorfismo de longitud del fragmento de restriccion (RFLP por sus siglas en ingles) se detectan mediante hibridacion de una sonda con ADN genomico digerido con enzimas de restriccion. La sonda es tfpicamente un subfragmento (o un oligonucleotido sintetico que corresponde a un subfragmento) del acido nucleico que se debe detectar. La enzima de restriccion se selecciona para proporcionar fragmentos de restriccion de al menos dos longitudes alternativas (o polimorficas) en varios individuos, y variaran a menudo de una lfnea a otra. Determinar que enzima(s) de restriccion produce(n) los fragmentos informativos para cada combinacion de individuos es un procedimiento simple, bien conocido en la tecnica. Despues de la separacion por longitud en una matriz apropiada (por ejemplo, agarosa) y la transferencia a una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa, nailon), la sonda marcada se hibrida en condiciones que dan como resultado la union en equilibrio de la sonda a la diana, seguido de la eliminacion de la sonda de exceso por lavado.

Las sondas de acidos nucleicos para los loci marcadores se pueden clonar y/o sintetizar. Las etiquetas detectables adecuadas para el uso con sondas de acidos nucleicos incluyen cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, radioisotopicos, fotoqufmicos, bioqufmicos, inmunoqufmicos, electricos, opticos o qufmicos. Las etiquetas utiles incluyen biotina para la coloracion con conjugado de estreptavidina etiquetado, perlas magneticas, colorantes fluorescentes, radiomarcadores, enzimas y etiquetas colorimetricas. Otras etiquetas incluyen ligandos que se unen a anticuerpos etiquetados con fluoroforos, agentes quimioluminiscentes y enzimas. Los marcadores de etiquetado se consiguen facilmente como por ejemplo con el uso de cebadores de PCR etiquetados para los loci marcadores.

La sonda hibridada se detecta despues, mas tfpicamente por autorradiograffa u otra tecnica de deteccion similar (por ejemplo, fluorograffa o contador de centelleo lfquido). Ejemplos de protocolos de hibridacion especfficos estan ampliamente disponibles en la tecnica, vease, por ejemplo, Berger y Kimmel (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol.152, Academic Press, Inc., San Diego ("Berger"); Sambrook, et al., (2001) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3a ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor ("Sambrook"); y Ausubel, et al., (eds) (complementado hasta 2001) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. ("Ausubel").

"Secuencias variables amplificadas" se refiere a secuencias amplificadas del genoma de la planta que presentan alta variabilidad de restos de acidos nucleicos entre miembros de la misma especie. Todos los organismos tienen secuencias genomicas variables y cada organismo (con la excepcion de un clon) tiene un conjunto diferente de secuencias variables. Una vez identificada, la presencia de la secuencia variable especffica puede utilizarse para predecir rasgos fenotfpicos. Preferentemente, el ADN de la planta sirve como molde para la amplificacion con cebadores que flanquean una secuencia variable de ADN. La secuencia variable se amplifica y despues se secuencia.

Las tecnicas de amplificacion In vitro se conocen bien en la tecnica. Ejemplos de tecnicas suficientes para dirigir a las personas expertas a traves de dichos metodos in vitro, incluyendo la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), la amplificacion de Qp-replicasa y otras tecnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), se encuentran en Berger, Sambrook y Ausubel (todossupra) asf como Mullis, et al., (1987) Patente de EE.UU. n° 4.683.202; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., eds.) Academic Press Inc., San Diego Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; Kwoh, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelli, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomell, et al., (1989) J. Clin. Chem 35:1826; Landegren, et al., (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu y Wallace, (1989) Gene 4:560; Barringer, et al., (1990) Gene 89:117; y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13:563-564. Los metodos mejorados para clonar acidos nucleicos amplificados in vitro se describen en Wallace, et al., en la patente de EE.UU. n.° 5.426.039. Los metodos mejorados para amplificar acidos nucleicos grandes por PCR se resumen en Cheng, et al., (1994) Nature 369:684, y las referencias en el mismo, en donde se generan los amplicones de PCR de hasta 40 kb. Un experto apreciara que esencialmente cualquier ARN puede convertirse en un ADN bicatenario adecuado para la digestion de restriccion, la expansion por PCR y la secuenciacion utilizando transcriptasa inversa y una polimerasa. Vease, Ausubel, Sambrook y Berger, todos supra.

Los oligonucleotidos para el uso como cebadores, por ejemplo, en reacciones de amplificacion y para el uso como sondas de secuencias de acidos nucleicos, tfpicamente se sintetizan qufmicamente de acuerdo con el metodo de triester fosforamidita de fase solida descrito por Beaucage y Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859, o simplemente se puede pedir comercialmente.

Como alternativa, la replicacion de la secuencia autosostenida se puede utilizar para identificar marcadores geneticos. La replicacion de la secuencia autosostenida se refiere a un metodo de amplificacion de acidos nucleicos que utiliza secuencias de acidos nucleicos objetivo que se replican exponencialmente in vitro bajo condiciones sustancialmente isotermicas utilizando tres actividades enzimaticas implicadas en la replicacion retrovfrica: (1) transcriptasa inversa, (2) Rnasa H, y (3) una ARN polimerasa dependiente de ADN (Guatelli, et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874). Al imitar la estrategia retrovfrica de la replicacion del ARN mediante los intermedios de ADNc, esta reaccion acumula copias de ADNc y de ARN del objetivo original.

Mapeo de loci marcadores

Se han desarrollado multiples paradigmas experimentales para identificar y analizar marcadores moleculares. En general, estos paradigmas implican el cruzamiento de uno o mas pares parentales, que pueden ser, por ejemplo, un unico par derivado de dos cepas consangufneas, o multiples progenitores relacionados o sin relacionar de distintas cepas o lfneas consangufneas, que presentan diferentes caracterfsticas con respecto al rasgo fenotfpico de interes. Los progenitores y una poblacion de la progenie son genotipados para loci marcadores y se evaluan fenotfpicamente para el rasgo de interes. En el contexto de la presente invencion, las plantas parentales y de la progenie son genotipados para el marcador BRSII u homologos, o marcadores alternativos unidos al marcador BRSII, y se evaluan para la resistencia a Orobanche. Los marcadores asociados con la resistencia se identifican basandose en correlaciones estadfsticas significativas entre el(los) genotipo(s) marcador(es) y los fenotipos de las plantas de la progenie evaluada. Numerosos metodos para determinar si los marcadores estan unidos geneticamente a un gen asociado con la resistencia a Orobanche son conocidos por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, mapeo de intervalos (Lander y Botstein (1989) Genetics 121:185), mapeo de regresion (Haley y Knott (1992) Heredity 69:315) y mapeo Mq M (Jansen (1994) Genetics 138:871). Vease tambien, las patentes de EE. UU. 6.399.855 y 6.368.806.

Dos tipos de marcadores que se usan a menudo en los protocolos de seleccion asistida por marcador son los marcadores de repeticiones de secuencias simples (SSR por sus siglas en ingles, tambien conocidos como microsatelite) y los marcadores de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP por sus siglas en ingles). El termino SSR se refiere generalmente a un tipo de heterogeneidad molecular que da como resultado una variabilidad de longitud, y mas tfpicamente es un segmento corto (hasta varios cientos de pares de bases) de ADN que consiste en multiples repeticiones en tandem de una secuencia de dos o tres pares de bases. Estas secuencias repetidas dan como resultado regiones de ADN altamente polimorficas de longitud variable debido a una fidelidad de replicacion escasa, por ejemplo, provocada por el deslizamiento de la polimerasa. Los SSR parecen estar dispersados aleatoriamente a traves del genoma y estan flanqueados generalmente por regiones conservadas. Las repeticiones de dinucleotidos se encuentran en plantas superiores (Condit y Hubbell (1991) Genome 34:66).

La variabilidad genomica de SSR es hereditaria, multialelica, codominante y detectable de manera reproducible, haciendo que los SSR sean adecuados para el uso como marcadores geneticos moleculares. La proliferacion de tecnicas de deteccion basadas en amplificacion cada vez mas sofisticadas (por ejemplo, PCR) proporciona una variedad de metodos sensibles para la deteccion de heterogeneidad de secuencias de nucleotidos. Los cebadores (u otros tipos de sondas) estan disenados para hibridarse con regiones conservadas que flanquean el dominio de SSR, dando como resultado la amplificacion de la region variable de SSR. Los diversos amplicones generados a partir de una region de SSR tienen tamanos caracterfsticos y reproducibles. Los amplicones de SSR de distintos tamanos observados a partir de dos cromosomas homologos en un individuo, o de diferentes individuos en la poblacion de plantas, se denominan generalmente "alelos marcadores". Mientras que existan dos alelos SSR que produzcan productos de PCR con al menos dos tamanos diferentes, el SSR puede emplearse como un marcador. Los marcadores SSR se pueden desarrollar a partir de ADN genomico o EST (etiquetas de secuencias expresadas).

Los marcadores que se basan en polimorfismos de un solo nucleotido (SNP) son tambien bien conocidos en la tecnica. Un SNP se produce cuando se altera un solo nucleotido (A, T, C o G) en la secuencia genomica o cuando ocurre una insercion/delecion. El SNP puede o no dar como resultado un cambio funcional del gen. Se han desarrollado varias tecnicas para la deteccion de SNP, que incluyen el metodo de hibridacion especffica del alelo (ASH; vease, por ejemplo, Coryell, et al., (1999) "Allele specific hybridization markers for soybean," Theor. Appl. Genet. 98:690-696). Los expertos en la materia conocen perfeccionamientos del analisis de SNP y adaptaciones para el uso en sistemas de alto rendimiento; vease, por ejemplo, Shirasawa, et al., (2006) Theor. Appl. Genet. 113(1): 147-155; Giancola, et al., (2006) Theor. Appl. Genet. 112(6):1115-1124. Un marcador SSR puede servir como una primera etapa en el desarrollo de un marcador SNP; vease, Brooks, et al., (2006) Crop Sci. 46(4):1467-1470. Los marcadores SSR y SNP se pueden utilizar en combinacion; vease, Gilson, et al., (2006) Transgenic Res. 15(6):785-786. Se ha informado sobre el analisis de SNP de secuencias promotoras (Schwarz, et al., (2003) J. Agr. Food Chem. 51(15):4263-4267).

Tambien se utilizan ampliamente tipos adicionales de marcadores moleculares, incluyendo el polimorfismo de longitud del fragmento de restriccion (RFLP por sus siglas en ingles), polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP por sus siglas en ingles), ADN polimorfico amplificado aleatoriamente (RAPD por sus siglas en ingles) y marcadores de isoenzimas. Los expertos en la materia conocen un amplio intervalo de protocolos para detectar esta variabilidad, y estos protocolos son frecuentemente especfficos para el tipo de polimorfismo para cuya deteccion estan disenados, incluyendo, por ejemplo, amplificacion por PCR, polimorfismos de conformacion monocatenaria (SSCP por sus siglas en ingles) y replicacion de la secuencia autosostenida (3SR; vease, Chan y Fox (1999) "NASBA and other transcriptionbased amplification methods for research and diagnostic microbiology," Reviews in Medical Microbiology 10:185-196).

Independientemente de su naturaleza molecular, por ejemplo, si un marcador es un SSR, SNP, RFLP, u otro tipo, los marcadores son tfpicamente especfficos de la cepa; es decir, un marcador particular se define con respecto a las lfneas parentales de interes. Para cada locus marcador, se identifican alelos de resistencia y de susceptibilidad para cada par de lfneas parentales. Siguiendo la correlacion de alelos especfficos con resistencia o susceptibilidad en las lfneas parentales, el marcador se puede utilizar para identificar la progenie con genotipos que corresponden al fenotipo deseado.

La vinculacion de un marcador molecular a un locus de interes se mide como una frecuencia de recombinacion, que establece la distancia (en centiMorgans, cM) entre los puntos de referencia en el mapa genetico. La distancia ffsica entre loci se mide en pares de bases, por ejemplo, el numero de kilopares de bases (kb) o megapares de bases (Mbp) con los que dos loci se separan uno del otro en un cromosoma. En general, cuanto mas cerca esten los dos loci (por ejemplo, un marcador SNP y un QTL) en el mapa genetico, mas cerca estaran uno del otro en el mapa ffsico. Mientras que la distancia genetica relativa es generalmente proporcional a la distancia entre los loci, la correlacion imprecisa entre cM y la distancia ffsica puede resultar de la variacion en las frecuencias de recombinacion para diferentes regiones cromosomicas. Algunas regiones cromosomicas son "puntos calientes" de recombinacion, mientras que otras regiones no muestran ninguna recombinacion o demuestran solo eventos raros de recombinacion. En general, cuanto mas cerca esta un marcador del locus de interes, ya sea medido en terminos de recombinacion o de distancia ffsica, mejor sirve para senalar el rasgo seleccionable deseado.

El objetivo del fitomejorador es enriquecer la poblacion vegetal para individuos con los rasgos deseados, lo que en ultima instancia conduce a una productividad agrfcola mejorada. Se sabe que los loci cromosomicos especfficos (o intervalos) que se pueden mapear en el genoma de un organismo pueden correlacionarse con fenotipos cuantitativos particulares. Dichos loci se denominan loci de rasgos cuantitativos o QTL. El fitomejorador puede utilizar ventajosamente marcadores moleculares para identificar los individuos deseados identificando los alelos marcadores que muestran una probabilidad estadfsticamente significativa de cosegregacion con un fenotipo deseado, manifestado como desequilibrio de union. Al identificar un marcador molecular o agrupacion de marcadores moleculares que se cosegrega con un rasgo cuantitativo, el fitomejorador esta identificando por lo tanto un QTL. Se han desarrollado multiples paradigmas para identificar y analizar marcadores QTL (vease, por ejemplo, Jansen (1996) T rends Plant Sci 1:89). La mayorfa de los informes publicados sobre el mapeo de QTL se han basado en el uso del cruce biparental (Lynch y Walsh (1997) Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauer Associates, Sunderland). Al identificar y seleccionar un alelo marcador (o alelos deseados de marcadores multiples) que se asocia con el fenotipo deseado, el fitomejorador es capaz de seleccionar rapidamente el fenotipo deseado. Este proceso se denomina seleccion asistida por marcador o MAS. Cuanto mas marcadores moleculares se colocan en el mapa genetico, mas potencialmente util se vuelve este mapa para realizar la MAS.

Numerosos metodos estadfsticos para determinar si los marcadores estan unidos geneticamente a un locus de interes son conocidos por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, modelos lineales estandar, como ANOVA o mapeo de regresion (Haley y Knott (1992) Heredity 69:315), los metodos de maxima probabilidad tales como algoritmos de expectativa-maximizacion, (por ejemplo, Lander y Botstein (1989) "Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps," Genetics 121:185-199; Jansen (1992) "A general mixture model for mapping quantitative trait loci by using molecular markers," (1993) Theor. Appl. Genet., 85:252-260; Jansen "Maximum likelihood in a generalized linear finite mixture model by using the EM algorithm," Biometrics 49:227-231; Jansen (1994) "Mapping of quantitative trait loci by using genetic markers: an overview of biometrical models," En J.W. van Ooijen and J. Jansen (eds.), Biometrics in Plant breeding: applications of molecular markers, pag. 116-124, CPRO-DLO Netherlands; Jansen (1996) "A general Monte Carlo method for mapping multiple quantitative trait loci," Genetics 142:305-311; y Jansen y Stam (1994) "High Resolution of quantitative trait into multiple loci via interval mapping," Genetics 136:1447-1455). Los metodos estadfsticos ejemplares incluyen analisis de marcadores de un solo punto, mapeo por intervalos (Lander y Botstein (1989) Genetics 121:185), mapeo por intervalos compuestos, analisis de regresion penalizado, analisis complejo de pedigrf, analisis MCMC, analisis MQM (Jansen (1994) Genetics 138:871), analisis hA p LO-IM+, analisis HAPLO-MQM, analisis HAPLO-MQM+, MCMC bayesiano, regresion contrafda, analisis de identidad por descendencia y regresion de Haseman-Elston, cualquiera de ellos es adecuado en el contexto de la presente invencion. Los detalles adicionales con respecto a los metodos estadfsticos alternativos aplicables a poblaciones de fitomejoramiento complejo que se pueden utilizar para identificar y localizar QTL se describen en: la patente de EE. UU. numero 6.399.855 de Beavis, et al., "QTL Mapping in Plant Breeding Populations" y el documento WO2001/049104 de Jansen, et al., "MQM Mapping Using Haplotyped Putative QTL-Alleles: A Simple Approach for Mapping QTLs in Plant Breeding Populations". Estos enfoques son computacionalmente intensivos y se realizan normalmente con la asistencia de un sistema informatico y software especializado. Los paquetes estadfsticos apropiados estan disponibles de una variedad de fuentes publicas y comerciales, y se conocen por los expertos en la materia.

Existe una necesidad en la tecnica de un germoplasma de girasol mejorado que sea resistente a Orobanche cumana. Existe una necesidad en la tecnica de la identificacion de marcadores moleculares que se unen a loci de resistencia a Orobanche cumana para facilitar la MAS. Dichos marcadores se pueden utilizar para seleccionar plantas individuales y poblaciones vegetales que muestran alelos marcadores favorables que se pueden emplear despues para seleccionar el fenotipo resistente. Como alternativa, los marcadores se pueden utilizar para contraseleccionar plantas o poblaciones vegetales que son susceptibles a Orobanche cumana. La presente divulgacion proporciona composiciones y metodos que satisfacen estas necesidades y proporcionan otras ventajas.

Se proporcionan metodos para identificar plantas o germoplasma de girasol que presentan resistencia, resistencia mejorada o susceptibilidad a Orobanche cumana. Se divulgan tambien metodos para producir plantas o germoplasma de girasol que son resistentes o tienen resistencia mejorada a Orobanche cumana, por ejemplo, en los que se crean plantas resistentes a traves de la introgresion de alelos marcadores de resistencia deseados (por ejemplo, seleccion asistida por marcadores) y/o por metodos de produccion transgenicos. Las plantas o germoplasma producidos por los metodos divulgados en el presente documento son tambien un aspecto de la divulgacion. Los sistemas para identificar plantas y germoplasma que se predice que tienen resistencia, resistencia mejorada o susceptibilidad a Orobanche cumana son tambien una caracterfstica de la divulgacion, al igual que los kits que facilitan los metodos divulgados en el presente documento.

En determinadas realizaciones, la invencion proporciona metodos para identificar una primera planta de girasol que tiene resistencia, resistencia mejorada o susceptibilidad a Orobanche cumana. En los metodos, al menos un alelo de un locus marcador que esta asociado con la resistencia, resistencia mejorada, o fenotipo de susceptibilidad se detecta en la primera planta de girasol. El locus marcador puede ser BRSII.

Por lo general, el locus estrechamente unido presenta una frecuencia de recombinacion genetica de menos de aproximadamente 10 % con referencia al locus marcador. En realizaciones deseables, el locus unido presenta una frecuencia de recombinacion genetica del 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,75 %, 0,5 % o 0,25 %, o menos.

De forma deseable, se identifican las plantas que tienen al menos un alelo favorable que se correlaciona positivamente con la resistencia o la resistencia mejorada. Opcionalmente, dos, tres o mas alelo(s) favorable(s) se identifican en, o se introgresan en, la planta. Se puede utilizar cualquier tecnica adecuada para evaluar la resistencia o la susceptibilidad de una planta de girasol a Orobanche cumana. Por ejemplo, la resistencia se puede puntuar en una ubicacion de campo conocida por albergar semillas de Orobanche, o el nivel de resistencia se puede puntuar utilizando condiciones de invernadero o vivero controladas. Los metodos de cribado se describen en detalle en el documento WO 2003/073837.

Cualquiera de una variedad de metodos moleculares puede utilizarse para detectar un alelo marcador. Por ejemplo, se puede detectar una forma alelica de una repeticion de la secuencia simple polimorfica (SSR) mediante una tecnologfa basada en amplificacion tal como la PCR. Como alternativa, se puede detectar un alelo marcador de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP) por una etapa de amplificacion seguida por un ensayo de hibridacion especffica de alelo (ASH). En estos y otros metodos de deteccion basados en amplificacion, el locus marcador o una parte del mismo se amplifica (por ejemplo, mediante PCR, LCR o transcripcion utilizando un acido nucleico aislado de una planta de interes como un molde) y se detecta el amplicon marcador resultante.

En un ejemplo, un cebador de amplificacion o un par de cebadores de amplificacion (por ejemplo, un par de cebadores proporcionado como las SEQ ID NOS: 5 y 6) se mezcla con el acido nucleico genomico aislado de la primera planta de girasol, en donde el cebador o el par de cebadores es complementario o parcialmente complementario de al menos una parte del locus marcador, y es capaz de iniciar la polimerizacion del ADN mediante una a Dn polimerasa utilizando el acido nucleico genomico del girasol como molde. El cebador o par de cebadores (por ejemplo, un par de cebadores que amplifica el locus marcador BRSII) se extiende en una reaccion de polimerizacion de ADN que tiene una ADN polimerasa y un acido nucleico genomico molde para generar al menos un amplicon. En cualquier caso, los datos que representan el(los) alelo(s) detectado(s) se pueden transmitir (por ejemplo, electronicamente o por infrarrojos, por transmision inalambrica u optica) a un ordenador o medio legible por ordenador para su analisis o almacenamiento.

Se apreciara que la capacidad para identificar un locus marcador favorable que se correlaciona con la resistencia a Orobanche proporciona un metodo para seleccionar plantas con un rasgo de resistencia favorable. Es decir, cualquier planta que se identifica por comprender un locus marcador deseado puede seleccionarse, mientras que las plantas que carecen de este locus, o que tienen un locus que esta correlacionado negativamente con la resistencia, pueden seleccionarse en contra.

Por lo tanto, en un metodo, posterior a la identificacion de un locus marcador favorable, los metodos incluyen seleccionar la primera planta de girasol, o seleccionar la progenie de la primera planta. Asimismo, la planta de girasol seleccionada puede cruzarse con una segunda planta de girasol (por ejemplo, un girasol de elite o exotico, dependiendo de las caracterfsticas que se desean en la progenie). De forma similar, si un alelo esta correlacionado con la resistencia a Orobanche, un metodo puede comprender introgresar el alelo en una segunda planta de girasol. De forma deseable, la segunda planta de girasol presenta menos resistencia a Orobanche que la primera planta de girasol, mientras que la planta de girasol introgresada presenta una tolerancia aumentada a Orobanche en comparacion con la segunda planta. En algunos aspectos, una planta de girasol de elite se utiliza como la segunda planta para la introgresion. Una planta o germoplasma de girasol introgresados producidos por cualquiera de los metodos divulgados en el presente documento tambien es una caracterfstica de la presente divulgacion.

Los enfoques transgenicos tambien pueden utilizarse para producir plantas o germoplasma de girasol resistentes a Orobanche. Por ejemplo, los metodos para producir una planta de girasol que tiene resistencia mejorada a Orobanche pueden incluir introducir un acido nucleico exogeno en una planta de girasol objetivo, en donde el acido nucleico exogeno esta derivado de una secuencia de nucleotidos genomica que esta estrechamente unida a un locus marcador favorable asociado con la resistencia mejorada a Orobanche. El locus marcador puede ser BRSII y/o un locus genetico unido al mismo.

Cualquiera de una variedad de metodos puede utilizarse para proporcionar el acido nucleico exogeno. En un metodo, la secuencia de nucleotidos se afsla por clonacion posicional y se identifica por la union al alelo favorable. La composicion precisa del acido nucleico exogeno puede variar; en un aspecto, el acido nucleico exogeno corresponde a un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipeptido que, cuando se expresa en una planta de girasol, da como resultado una planta de girasol que tiene resistencia mejorada a Orobanche.

Los sistemas para identificar una planta de girasol que se predice que tienen resistencia, resistencia mejorada, o susceptibilidad a Orobanche son tambien una caracterfstica de la divulgacion. Por lo general, el sistema puede incluir (a) un conjunto de sondas o cebadores marcadores configurados para detectar al menos un alelo favorable de un locus marcador asociado con resistencia a Orobanche, en donde el locus marcador puede ser BRSII o un locus genetico unido al mismo; (b) un detector que esta configurado para detectar una o mas salidas de senal del conjunto de sondas o cebadores marcadores, o un amplicon del mismo, identificando de este modo la presencia o ausencia del alelo; y (c) instrucciones del sistema que correlacionan la presencia o ausencia del alelo favorable con la resistencia o susceptibilidad predicha. En algunos aspectos, el conjunto de sondas o cebadores marcadores comprende secuencias de nucleotidos proporcionadas en las SEQ ID NOS: 3-6.

La configuracion precisa del detector dependera del tipo de etiqueta utilizada para detectar el alelo marcador. Los aspectos tfpicos incluyen detectores de luz y detectores de radioactividad. La deteccion de una emision de luz (o emisiones de luz multiples) u otra etiqueta de sonda es indicativa de la presencia o ausencia de un alelo marcador. De forma similar, la forma precisa de las instrucciones puede variar dependiendo de los componentes del sistema, por ejemplo, pueden estar presentes como un software de sistema en una o mas unidades integradas del sistema o pueden estar presentes en uno o mas ordenadores o medios legibles por ordenador acoplados de manera operativa al detector. En un aspecto tfpico, las instrucciones del sistema incluyen al menos una tabla de consulta que incluye una correlacion entre la presencia o ausencia del alelo favorable y la resistencia predicha o la resistencia mejorada.

El sistema puede estar compuesto de elementos separados o puede estar integrado en una sola unidad para la deteccion conveniente de alelos marcadores y para realizar correlaciones de marcador-rasgo. El sistema tambien puede incluir una muestra tal como ADN genomico, ADN genomico amplificado, ADNc, ADNc amplificado, ARN o ARN amplificado de girasol o de un tejido vegetal de girasol seleccionado.

Salvo que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente una persona con una habilidad habitual en la tecnica a la cual pertenece la presente invencion. A menos que se mencione de otro modo, las tecnicas empleadas o contempladas en el presente documento son metodologfas estandar bien conocidas por una persona experta en la materia.

En el ambito de la presente divulgacion, se usara un numero de terminos. Para proporcionar una comprension clara y consistente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, incluido el alcance que se le dara a dichos terminos, se proporcionan las siguientes definiciones.

"Alelo" se refiere a una o mas secuencias de nucleotidos que pueden ocurrir en un locus cromosomico especffico. Un individuo diploide heterocigoto tiene dos formas diferentes de una secuencia, o alelo, en los loci correspondientes del par de cromosomas. Un individuo diploide homocigoto tiene dos copias del mismo alelo en los loci correspondientes de los cromosomas homologos.

Un "alelo favorable" puede ser el alelo en un locus particular que confiere, o contribuye a, un fenotipo agronomicamente deseable. En otras circunstancias, un "alelo favorable" puede ser uno que permita la identificacion de plantas con rasgos agronomicos negativos, tal como susceptibilidad a enfermedades.

Un alelo se correlaciona "positivamente" con un rasgo cuando la presencia del alelo es un indicador de que el rasgo deseado o forma de rasgo ocurrira en una planta que comprende ese alelo. Un alelo se correlaciona "negativamente" con un rasgo cuando la presencia del alelo es un indicador de que un rasgo deseado o forma de rasgo no ocurrira en una planta que comprende el alelo.

"Frecuencia alelica" se refiere a la frecuencia a la que un alelo esta presente en un locus dentro de un individuo, dentro de una lfnea o dentro de una poblacion de lfneas. Por ejemplo, para un alelo "A", los individuos diploides de genotipo "AA," "Aa," o "aa" tienen frecuencias alelicas de 1,0, 0,5, o 0,0, respectivamente.

El termino "asociado con" o "asociado" en el contexto de esta invencion se refiere a, por ejemplo, un acido nucleico y un rasgo fenotfpico que estan en desequilibrio de union, es decir, el acido nucleico y el rasgo se encuentran juntos en plantas de la progenie mas a menudo que si el acido nucleico y el fenotipo se segregaran por separado.

"Orobanca", "Orobanche cumana" "Orobanche cumana Wallr.", "O. cernua Loefl", "Orobanche". y "O. cumana" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a la maleza parasitaria descrita y sus razas.

El termino "centiMorgan" significa una unidad de medida de la frecuencia de recombinacion. Un centiMorgan representa un 1 % de posibilidad de que un marcador en un primer locus genetico, en una sola generacion, se separe del marcador en un segundo locus debido al cruzamiento.

"Esteril masculino citoplasmatico" o "CMS": Una lfnea de girasol que no produce polen viable se denomina esteril masculino. La esterilidad masculina citoplasmica se hereda por via materna, es decir, la planta esteril masculina se utiliza como lfnea parental femenina en un cruce con polen de otro girasol. Las lfneas de CMS se producen cruzando una lfnea de mantenimiento con una planta de girasol con el rasgo de esterilidad masculina citoplasmica y despues retrocruzando con la lfnea de mantenimiento hasta que se desarrolle una lfnea esteril masculina que es homologa a la lfnea de mantenimiento en todos los otros aspectos. Las lfneas de CMS se denominan tambien lfneas femeninas.

Un "mapa genetico" es una descripcion de una relacion de union genetica entre loci en uno o mas cromosomas (o grupos de union) dentro de una especie dada, generalmente representada en una forma de diagrama o de tabla. El "mapeo genetico" es el proceso de definir la relacion de union de los loci a traves del uso de marcadores geneticos, las poblaciones que segregan los marcadores, y los principios geneticos estandar de la frecuencia de recombinacion. Una "ubicacion del mapa genetico" es un punto de referencia en un mapa genetico, relativo a los marcadores geneticos circundantes en el mismo grupo de union, donde se puede encontrar un marcador especffico. Por el contrario, un mapa ffsico del genoma se refiere a distancias absolutas (por ejemplo, medidas en pares de bases o fragmentos geneticos contiguos aislados y superpuestos, o contigos). Un mapa ffsico del genoma no tiene en cuenta el comportamiento genetico (por ejemplo, las frecuencias de recombinacion) de varios segmentos cromosomicos.

Los terminos "geneticamente unido" se refiere a loci geneticos que estan en desequilibrio de union y que estan determinados estadfsticamente a no clasificarse independientemente. Los loci unidos geneticamente se clasifican dependientemente del 51 % al 99 % del tiempo o cualquier valor de numero entero entre ellos, preferentemente al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %.

El termino "homogeneidad" indica que los miembros de un grupo tienen el mismo genotipo en uno o mas loci especfficos. El termino "heterogeneidad" indica que los individuos dentro del grupo difieren en el genotipo en uno o mas loci especfficos.

El termino "homologo" se refiere a secuencias de acidos nucleicos que estan derivadas de un gen ancestral comun a traves de procesos naturales o artificiales (por ejemplo, son miembros de la misma familia de genes), y por lo tanto comparten tfpicamente similitud de secuencia. Los acidos nucleicos homologos tienen a menudo una identidad de secuencia suficiente para que una de las secuencias o su complemento sea capaz de hibridarse selectivamente con la otra en condiciones de hibridacion rigurosas. El termino "se hibrida selectivamente" incluye referencia a la hibridacion, en condiciones de hibridacion rigurosas, de una secuencia de acidos nucleicos con una secuencia diana de acidos nucleicos especffica hasta un grado detectable mayor (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el contexto) que su hibridacion con secuencias de acidos nucleicos no diana y a la exclusion sustancial de acidos nucleicos no diana. Las secuencias de hibridacion selectiva tienen al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia, a menudo al menos el 90 % de identidad de secuencia y pueden tener el 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia entre sf. Un acido nucleico que exhibe al menos cierto grado de homologfa a un acido nucleico de referencia puede ser unico o identico al acido nucleico de referencia o su secuencia complementaria.

El termino "celula huesped" significa una celula que contiene un acido nucleico heterologo, tal como un vector, y apoya la replicacion y/o expresion del acido nucleico. Las celulas hospedadoras pueden ser celulas procariotas tales como E. coli, o celulas eucariotas tales como celulas de levadura, de insecto, de anfibio o de mamffero. Preferentemente, las celulas hospedadoras son celulas vegetales. En el contexto de la divulgacion, una celula hospedadora particularmente preferida es una celula de girasol.

El termino "intervalo" se refiere a un tramo lineal continuo de un ADN cromosomico con terminos definidos por y que incluyen marcadores moleculares.

El termino "introducido" cuando se refiere a un acido nucleico heterologo o aislado se refiere a la incorporacion de un acido nucleico en una celula eucariota o procariota donde se puede incorporar el acido nucleico en el genoma de la celula (por ejemplo, cromosoma, plasmido, plastido o ADN mitocondrial), convertido en un replicon autonomo o expresado de forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado). El termino incluye dichos medios de introduccion de acidos nucleicos como "transfeccion", "transformacion" y "transduccion".

El termino "introgresion" se refiere a la transmision de un alelo deseado de un locus genetico desde un contexto genetico a otro. Por ejemplo, la introgresion de un alelo deseado en un locus especffico puede ocurrir por medio de un cruce sexual entre dos plantas, donde una de las plantas tiene el alelo deseado dentro de su genoma. El alelo se introgresa en la progenie. En otro ejemplo, la transmision de un alelo puede ocurrir mediante la recombinacion entre dos genomas donantes in vitro, por ejemplo, en un protoplasto fusionado, donde uno de los protoplastos donantes tiene el alelo deseado en su genoma. El alelo deseado puede ser, por ejemplo, un transgen o un alelo seleccionado de un marcador o locus de rasgo cuantitativo.

El termino "aislado" se refiere a material, tal como un acido nucleico o una protefna, que esta sustancialmente libre de componentes que normalmente acompanan o interaction con el mismo en su entorno de origen natural. El material aislado comprende opcionalmente el material no encontrado con el material en su entorno natural, por ejemplo, una celula. Ademas, si el material esta en su entorno natural, tal como una celula, el material se coloca en una ubicacion en la celula (por ejemplo, el genoma u organulo subcelular) no nativo a un material encontrado en este entorno. Por ejemplo, un acido nucleico de origen natural (por ejemplo, un promotor) se considera que esta aislado si se introduce mediante medios no naturales en un locus del genoma no nativo a ese acido nucleico. Los acidos nucleicos que estan "aislados" como se define en el presente documento, tambien se denominan acidos nucleicos "heterologos".

"Lfnea" significa un grupo de plantas que son geneticamente homogeneas y presentan poca variacion entre individuos, generalmente como resultado de varias generaciones de autopolinizacion. Asimismo, una lfnea puede incluir un grupo de plantas propagadas vegetativamente a partir de una unica planta progenitora, utilizando una tecnica de cultivo tisular o celular.

El termino "desequilibrio de union" se refiere a una segregacion no aleatoria de loci geneticos. Esto implica que dichos loci estan en una proximidad ffsica suficiente a lo largo de una longitud de un cromosoma que tienden a segregarse entre si, es decir, con una frecuencia mayor que la que ocurrirfa de forma aleatoria.

Los terminos "marcador", "marcador molecular", y "locus marcador" se refieren a una secuencia de nucleotidos o producto codificado de la misma (por ejemplo, una protefna) que se usa como un punto de referencia al identificar un locus unido, tal como un locus de rasgo cuantitativo (QTL). Un marcador puede derivarse de una secuencia de nucleotidos genomica o de secuencias de nucleotidos expresadas o de un polipeptido codificado. El termino puede referirse tambien a secuencias de acidos nucleicos complementarias a, o que flanquean, las secuencias marcadoras, tales como los acidos nucleicos utilizados como sondas o pares de cebadores capaces de amplificar la secuencia marcadora. Dicha secuencia de acidos nucleicos o molecula que se puede utilizar para identificar la presencia de un locus marcador, por ejemplo, una sonda de acidos nucleicos que es complementaria a una secuencia de locus marcador, puede denominarse tambien como "sonda marcadora". Como alternativa, en algunos aspectos, una sonda marcadora se refiere a una sonda de cualquier tipo que es capaz de distinguir (es decir, genotipo) el alelo particular que esta presente en un locus marcador.

Los terminos "acido nucleico", "polinucleotido", "secuencia de polinucleotidos" y "secuencia de acidos nucleicos" se refieren a polfmeros de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos monocatenarios o bicatenarios, o quimeras de los mismos. Como se usa en el presente documento, los terminos pueden incluir de manera adicional o alternativa analogos de nucleotidos de origen natural que tienen la naturaleza esencial de los nucleotidos naturales ya que se hibridan con acidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a la de los nucleotidos de origen natural (por ejemplo, acidos nucleicos peptidos). A menos que se indique de otro modo, una secuencia de acidos nucleicos particular divulgada en el presente documento abarca opcionalmente las secuencias complementarias, ademas de la secuencia indicada explfcitamente. El termino "gen" se utiliza para referirse a, por ejemplo, un ADNc y un ARNm codificado por la secuencia genomica, asf como a esa secuencia genomica.

"Planta o partes de la planta" se refiere a celulas vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido de celulas vegetales a partir de los que pueden regenerarse plantas, callos de plantas, agrupaciones de plantas y celulas vegetales que estan intactos en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, ovulos, flores, hojas, vainas, tallos, rafces, puntas de rafces, anteras y semilla y harina de semillas.

Los terminos "locus de rasgo cuantitativo" o "QTL" se refieren a un locus genetico polimorfico con al menos dos alelos que reflejan diferencialmente la expresion de un rasgo fenotfpico distribuido de manera continua.

A efectos de la presente invencion, "resistencia", "resistencia a orobanca" o resistencia a "Orobanche" se define como un atributo geneticamente controlado de las plantas de girasol que evita que una planta de orobanca parasita se fije a una planta de girasol y complete su ciclo de vida a traves de la etapa reproductiva (con semilla). La resistencia puede resultar de una o mas de varias respuestas planta-parasito, incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a: (1) falta de suficiente estfmulo de germinacion de semilla de orobanca de la planta de girasol (se supone que es un exudado qufmico de rafz); (2) bloqueo de la penetracion haustorial de orobanca de la superficie de la rafz de girasol; o (3) bloqueo de la conexion haustorial de orobanca al sistema vascular de la planta de girasol.

El termino "recombinante" indica que el material (por ejemplo, un acido nucleico o protefna) se ha alterado sinteticamente (de manera no natural) por la intervencion humana. La alteracion para producir el material sintetico puede realizarse en el material dentro de o eliminado de su entorno o estado natural. Por ejemplo, un acido nucleico de origen natural se considera un acido nucleico recombinante si se altera, o si se transcribe de ADN que haya sido alterado, por medio de la intervencion humana realizada dentro de la celula de la cual se origina. Vease, por ejemplo, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, patente de EE. UU. n.° 5.565.350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling, et al., PCT/US93/03868.

"Lfnea restauradora" significa una lfnea que posee el gen o genes para restaurar la fertilidad masculina o la viabilidad del polen para un hfbrido de girasol o lfnea consangufnea que tiene un citoplasma materno que condiciona la esterilidad masculina. Este termino se describe tambien en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Fick, "Breeding and Genetics," en Sunflower Science and Technology 279-338 (J.F. Carter, ed., 1978).

"Seleccion" significa la extraccion de un fenotipo deseado de un amplio grupo de fitomejoramiento geneticamente heterogeneo, denominado comunmente poblacion. Las plantas individuales dentro de la poblacion se seleccionan para las manifestaciones preferidas de dichos rasgos como morfologfa de la planta, morfologfa de la flor, resistencia a insectos o enfermedades, madurez y productividad.

Los terminos "repeticion de secuencia simple" o "SSR" se refieren a un tipo de marcadores moleculares (tambien conocidos como microsatelite) basados en secuencias cortas de nucleotidos (2-6 unidades de longitud) que se repiten en tandem. Por ejemplo, una repeticion de dinucleotido podrfa ser GAGAGAGA y una repeticion de trinucleotido podrfa ser ATGATGATGATG. Se cree que cuando el ADN se replica, suceden errores en el proceso y se agregan conjuntos adicionales de estas secuencias repetidas a la cadena. Con el tiempo, estas secuencias repetidas varfan en longitud entre un cultivar y otro. Un ejemplo de una variacion alelica en SSR serfa: Alelo A: GAGAGAGA (4 repeticiones de la secuencia GA) y Alelo B: GAGAGAGAGAGA (6 repeticiones de la secuencia GA). Estas variaciones de longitud son faciles de trazar en el laboratorio y permiten el seguimiento de la variacion genotfpica en los programas de fitomejoramiento.

Los terminos "polimorfismo de un solo nucleotido" o "SNP" se refieren a una alteracion de un solo nucleotido en la secuencia genomica. Esto puede suceder cuando una sola adenina, timina, citosina o guanina (representadas por A, T, C, o G) se cambia a uno cualquiera de los otros cuatro nucleotidos, o cuando un solo nucleotido se inserta o elimina. El SNP puede o no dar como resultado un cambio funcional del gen.

Los terminos "planta transgenica" se refieren a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleotido heterologo. En general, el polinucleotido heterologo se integra de manera estable dentro del genoma de modo que el polinucleotido pase a las generaciones sucesivas. El polinucleotido heterologo puede estar integrado en el genoma solo o como una parte de un casete de expresion recombinante. "Transgenico" se utiliza en el presente documento para referirse a cualquier celula, lfnea celular, callo, tejido, parte de planta o planta, cuyo genotipo se ha alterado por la presencia de acido nucleico heterologo que incluye aquellos organismos o celulas transgenicos inicialmente tan alterados, asf como aquellos que se crean por propagacion sexual o asexual del organismo o celula transgenicos iniciales y retienen el acido nucleico heterologo. El termino "transgenico" como se usa en el presente documento no abarca la alteracion del genoma (cromosomico o extracromosomico) mediante metodos convencionales de fitomejoramiento de plantas (es decir, cruces) o eventos de origen natural tales como la fertilizacion cruzada aleatoria, la infeccion vfrica no recombinante, la transformacion bacteriana no recombinante, la transposicion no recombinante o la mutacion espontanea.

"Variedad" o "cultivar" se refiere a un grupo de plantas dentro de las especies (por ejemplo, Helianthus annuus) que comparten ciertas caracterfsticas constantes que las separan de la forma tfpica y de otras variedades posibles dentro de esas especies.

Los cultivos de campo se cultivan a traves de tecnicas que aprovechan el metodo de polinizacion de la planta. Una planta se autopoliniza si el polen de una flor se transfiere a la misma o a otra flor de la misma planta o una planta geneticamente identica. Una planta se autopoliniza si el polen proviene de una flor en una planta geneticamente diferente. De esta manera, el termino "autopolinizado" en un programa de fitomejoramiento se refiere a la autopolinizacon y el termino "cruzado" se refiere a la polinizacion cruzada.

Los girasoles tienen una inflorescencia de tipo cabezuela con flores de rayos esteriles y flores de disco perfectas (que tienen estambre y pistilo). En su estado silvestre, el girasol ha sido autoesteril o autoincompatible de modo que es un cultivo altamente polinizante cruzado que depende en gran medida de las abejas o de otros insectos para la polinizacion. La mayorfa de las areas de produccion no tienen una poblacion de abejas suficiente para polinizar de manera adecuada el cultivo. Esto ha dado como resultado una seleccion del fitomejorador para autocompatibilidad o autofertilidad que aumenta el rendimiento de las semillas cuando hay unas pocas abejas presentes.

Una poblacion de fitomejoramiento del girasol deberfa ser sustancialmente homogenea y reproducible para ser util sea en el fitomejoramiento adicional o en el desarrollo de un cultivar comercial. Existe un numero de metodos analfticos disponibles para determinar la estabilidad fenotfpica de una poblacion de girasoles.

El metodo mas antiguo y mas tradicional de analisis es la observacion de los rasgos fenotfpicos. Los datos se recogen normalmente en experimentos de campo a lo largo de la vida de las plantas de girasol que se deben examinar. Las caracterfsticas fenotfpicas se observan muy a menudo para rasgos asociados con el rendimiento de las semillas, el contenido de aceite de semillas, el contenido de protefnas de las semillas, la composicion de acidos grasos del aceite, el contenido de glucosinolato de la harina, el habito de crecimiento, la resistencia al encamado, la altura de la planta, la resistencia a la rotura, etc. Otras caracterfsticas fenotfpicas observadas incluyen resistencia a enfermedades o insectos y tolerancia a los herbicidas.

Se ha descubierto que las composiciones y metodos divulgados en el presente documento pueden ser utiles para identificar lfneas nuevas de girasoles resistentes a Orobanche cumana.

Una semilla de Orobanche proxima a la zona de la rafz de una variedad susceptible germinara, formara un haustorio en la rafz de la planta susceptible y completara su ciclo de vida extrayendo el sustrato de la planta hospedadora, provocando de este modo un grave perjuicio para el crecimiento y la productividad de la planta hospedadora. Vease, por ejemplo, Dominguez, (1996) Plant Breed. 1l5:203-204; Ish-Shalom-Gordon, et al., (1993) Phytopathology 83:1250­ 1252; Kirichenco, et al., (1987) Plant Breed. Abstr. 57:1392; Melero-Vara, et al. (2000), Helia 23:45-56; y Sukno, et al., (1999) Crop Sci. 39:674-678). La resistencia del Sistema I a Orobanche cumana da como resultado un fallo de una semilla de Orobanche en la zona de la rafz de una variedad resistente para infectar la planta hospedadora. Esta forma de resistencia esta representada en la lfnea del girasol U00S9LM y n° de acceso ATCC PTA-3793.

A diferencia del caso de la resistencia del Sistema 1, Una semilla de Orobanche cumana en la zona de la rafz de las plantas de girasol que llevan el gen de resistencia del Sistema 2 germinara, penetrando en los tejidos de la rafz hospedadora y formando un haustorio. Los brotes de orobanca comenzaran a desarrollarse bajo tierra. Sin embargo, para las plantas de girasol con el gen de resistencia del Sistema 2, la planta de Orobanche invasora se marchitara y morira antes de que emerja del suelo, incapaz de completar su ciclo de vida en el sistema de rafces de la planta resistente. Esta forma de resistencia esta representada en la lfnea del girasol 8556UG y n° de acceso ATCC PTA-3792; vease, el documento WO 2003/073837. En ciertos aspectos, la presente divulgacion proporciona marcadores moleculares para un gen que proporciona resistencia del Sistema 2 a Orobanche cumana.

Un tercer mecanismo combina las fuentes de resistencia de ambos sistemas para crear una resistencia mas fuerte. Esta forma de resistencia esta representada en el hfbrido de girasol 01UL2365 y n° de acceso ATCC PTA-3791. La resistencia a orobanca se refuerza combinando el rasgo de resistencia del Sistema 2 con otros genes de resistencia.

En el pasado, los fitomejoradores han tenido que confiar en un bioensayo para seleccionar plantas resistentes, buscando orobanca viva dentro de un radio de 50 cm alrededor de cada planta y comprobando bajo tierra cualquier rafz de orobanca fijada al sistema de rafces. Este es un metodo muy tedioso y puede ser impreciso debido a los efectos medioambientales. Un marcador molecular asociado con el alelo de resistencia del gen de resistencia del Sistema 2 permitirfa a los fitomejoradores seleccionar de manera mas rapida y mas fiable las plantas resistentes durante el proceso de fitomejoramiento.

En ciertos aspectos, la presente divulgacion proporciona marcadores moleculares para resistencia del Sistema 2 a Orobanche cumana. Anteriormente, ningun marcador molecular habfa estado disponible para identificar o diferenciar la resistencia del Sistema 2 a Orobanche en el girasol. Los fitomejoradores de girasoles han tenido que confiar en las observaciones de campo cuando incorporan genes de resistencia del Sistema 2 a Orobanche en sus poblaciones de fitomejoramiento. Los nuevos marcadores moleculares facilitan los esfuerzos de los fitomejoradores de girasoles. Por ejemplo, el uso de los marcadores permite a los fitomejoradores:

1) Diferenciar entre plantas dentro de una poblacion de fitomejoramiento de segregacion para identificar aquellos que llevan el gen de resistencia del Sistema 2.

2) Producir resistencia del Sistema 2 en lfneas consangufneas de elite que contenfan anteriormente poca o ninguna resistencia a Orobanche, aumentando de este modo la diversidad de los productos de girasol disponibles para los cultivadores en areas infestadas con Orobanche.

3) Combinar el gen del Sistema 2 con otros genes de resistencia, para desarrollar plantas que contienen tanto resistencia del Sistema 1 como del Sistema 2 y de este modo proporcionan una combinacion de resistencia que es superior a la resistencia del Sistema 1 o Sistema 2 sola.

4) Combinar el gen del Sistema 2 con genes que proporcionan otros rasgos utiles, como la resistencia a otros parasitos o enfermedades que afectan al girasol, o tolerancia a herbicidas.

5) Crear nuevos productos comerciales que pueden utilizarse para agotar los bancos de semillas de Orobanche existentes en el perfil del suelo y limitar nuevos depositos de semillas de Orobanche en un sistema de cultivo. 6) Identificar regiones y/o agrupaciones de genes en el genoma del girasol que dan lugar a la resistencia a Orobanche en el girasol y clonar los genes utiles a partir de estos loci para el desarrollo de marcadores adicionales o el desarrollo de nuevas construcciones de transgenes que se pueden utilizar para desarrollar girasoles transgenicos con resistencia a Orobanche.

Las composiciones y los metodos divulgados en el presente documento pueden ayudar a crear de manera reproducible lfneas de girasol que expresan el rasgo de resistencia a Orobanche dentro de un contexto fenotfpico consistente que exhibe uno o mas rasgos deseables tales como alto rendimiento de semillas, madurez temprana, tolerancia a la sequfa, tolerancia al frfo, contenido de protefnas de las semillas adecuado y composicion de aminoacidos, enanismo, resistencia al encamado, resistencia a insectos o enfermedades provocadas por bacterias, hongos, o virus, y tolerancia al tratamiento con herbicidas.

Desarrollo hfbrido en girasol

La semilla de girasol hfbrida se produce tfpicamente por un sistema de esterilidad masculina que incorpora consanguinidades geneticas o esteriles masculinas citoplasmicas (CMS por sus siglas en ingles). Las plantas de una consanguinidad CMS son esteriles masculinas como resultado de factores que resultan del genoma citoplasmico, en oposicion al nuclear. Por lo tanto, esta caracterfstica se hereda exclusivamente a traves del progenitor femenino, puesto que solo la hembra proporciona citoplasma a la semilla fertilizada. CMS pueden derivar de lfneas de girasol conocidas en la tecnica y disponibles publicamente como CMS HA89 (USDA). La fuente de CMS HA89 es el material de Leclercq, "Cytoplasmic Sterility in the Sunflower," (1969) Ann. Amelior Plant 19:99-106.

Las plantas de CMS se fertilizan con polen de otra planta que no es esteril masculina. El polen de la segunda planta puede o no contribuir con los genes que hacen las plantas de la progenie fertiles masculinas.

Las lfneas esteriles masculinas citoplasmicas se desarrollan tradicionalmente por el metodo de retrocruzamiento en el que las lfneas deseables que han sufrido consanguinidad y seleccion en varias generaciones se cruzan inicialmente con esterilidad masculina citoplasmica. A partir de entonces, la lfnea consangufnea deseable se utiliza como un progenitor recurrente en el procedimiento de retrocruzamiento. La progenie final sera geneticamente similar al progenitor recurrente a excepcion de que sera esteril masculina.

Las lfneas restauradoras de la fertilidad pueden desarrollarse utilizando el retrocruzamiento para transferir un gen restaurador dominante a una lfnea consangufnea establecida con citoplasma normal. Si se utiliza este procedimiento, las plantas seleccionadas deben cruzarse con una lfnea esteril masculina citoplasmica despues de cada generacion para determinar si los genes restauradores de la fertilidad estan presentes. Un procedimiento mas comun es la autopolinizacion y la seleccion de plantas fertiles masculinas a partir de hfbridos comerciales o cruces planificados de progenitores que tienen genes restauradores en el citoplasma esteril masculino. Este procedimiento no requiere una prueba del cruzamiento con una lfnea esteril masculina durante la seleccion porque las plantas seran completamente fertiles masculinas si los genes restauradores necesarios estan presentes.

Una lfnea restauradora adecuada para CMS puede producirse mediante el cruzamiento con cualquiera de las lfneas restauradoras comunmente disponibles, tales como RHA274, RHA271, y RHA273 (USDA), u otras lfneas que poseen genes para la restauracion de la fertilidad masculina. Las lfneas y variedades derivadas de esta manera que producen semillas que tienen resistencia a orobanca y que son verdaderos fitomejoradores para al menos los genes restauradores de la fertilidad, pueden aislarse mediante autopolinizacion continua y cruzarse con las lfneas CMS resistentes a orobanca descritas previamente.

Desarrollo consangufneo en girasol

El uso de consanguinidades esteriles masculinas es solo un factor en la produccion de hfbridos de girasol. El desarrollo de hfbridos de girasol requiere, en general, el desarrollo de lfneas consangufneas homocigoticas, el cruzamiento de estas lfneas y la evaluacion de la progenie. Los metodos de fitomejoramiento por pedigrf y de fitomejoramiento por seleccion recurrente se utilizan para desarrollar lfneas consangufneas de poblaciones de fitomejoramiento. Los programas de fitomejoramiento combinan los contextos geneticos de dos o mas lfneas consangufneas o varias otras fuentes de base amplia en grupos de fitomejoramiento a partir de los cuales se desarrollan nuevas lfneas consangufneas por autofertilizacion y seleccion de los fenotipos deseados. Las nuevas consanguinidades se cruzan con otras lfneas consangufneas, y los hfbridos de estos cruces se evaluan para su potencial comercial.

El fitomejoramiento del pedigrf se utiliza comunmente para la mejora de los cultivos. El fitomejoramiento del pedigrf comienza con el cruzamiento de dos genotipos, cada uno de los cuales puede tener una o mas caracterfsticas deseables que faltan en el otro o que complementan al otro. Si los dos padres originales no proporcionan todas las caracterfsticas deseadas, se pueden incluir padres adicionales en el esquema de cruzamiento.

Estos padres se cruzan de una manera simple o compleja para producir una F1. Una poblacion F2 se produce por autofertilizacion de una o varias F1 o mediante entrecruzamiento de dos F1 (es decir, apareamiento de hermanos). La seleccion de los mejores individuos puede comenzar en la poblacion F2. Comenzando en la F3, se seleccionan las mejores familias, y los mejores individuos dentro de las mejores familias. Las pruebas replicadas de familias (lfneas) puede comenzar en la generacion de F4 para mejorar la efectividad de la seleccion de rasgos con baja heredabilidad. En una etapa avanzada de consanguinidad (es decir, F6 y F7), las mejores lfneas o mezclas de lfneas fenotfpicamente similares se evaluan comunmente por su liberacion potencial como nuevos cultivares.

Las variedades mejoradas tambien se pueden desarrollar a traves de seleccion recurrente. Una poblacion geneticamente variable de individuos heterocigotos se identifica o se crea por entrecruzamiento de varios padres diferentes. Las mejores plantas se seleccionan basandose en la superioridad individual, la progenie sobresaliente, y/o la capacidad de combinacion excelente. Las plantas seleccionadas se entrecruzan para producir una nueva poblacion en la que se continuan ciclos adicionales de seleccion.

El objetivo de los programas de desarrollo de hfbridos de girasol comerciales es desarrollar nuevas lfneas consangufneas que se combinen para producir hfbridos con alta productividad y rendimiento agronomico superior. La productividad es el rasgo primario que buscan los fitomejoradores. Sin embargo, muchos otros rasgos agronomicos fundamentales son importantes en las combinaciones de hfbridos y tienen un impacto en la productividad o, por el contrario, proporcionan un rendimiento superior en las combinaciones de hfbridos. Los objetivos fundamentales en el fitomejoramiento del girasol incluyen una productividad de semillas mejorada, un porcentaje de aceite de semillas mejorado o una calidad de aceite, madurez mas temprana, altura de la planta mas baja, uniformidad del tipo de planta y resistencia a enfermedades o insectos. Ademas, las lfneas per se tienen preferentemente un rendimiento aceptable para los rasgos parentales tales como la productividad de semillas y la produccion de polen, todos los cuales afectan a la capacidad de proporcionar lfneas parentales en cantidad y calidad suficientes para la hibridacion. Estos rasgos han demostrado estar bajo el control genetico y muchos, si no todos, los rasgos estan afectados por genes multiples.

A traves de tecnicas de fitomejoramiento, se puede combinar o "apilar" la resistencia mejorada a Orobanche cumana con cualquier otro rasgo deseable de semillas, agronomico, o de resistencia a insectos o enfermedades. Los ejemplos de otros rasgos deseables incluyen, pero no se limitan a, un perfil o contenido de aceite de semillas alterado, alta productividad de semillas, madurez mas temprana, tolerancia a la sequfa, tolerancia al frfo, mayor contenido de protefnas de las semillas, modificacion de la composicion del contenido de aminoacidos en las semillas, enanismo, resistencia al encamado, resistencia a insectos o enfermedades provocadas por bacterias, hongos, o virus, o tolerancia al tratamiento con herbicidas.

Los metodos divulgados en el presente documento encuentran un uso particular en los programas de fitomejoramiento con lfneas de girasol tolerantes a herbicida con sulfonilurea. Los herbicidas con sulfonilurea se han encontrado efectivos contra las malezas parasitas del girasol tales como la cuscuta y las especies de Orobanche (L. Garcia-Torres, et al., (1994) Weed Research 34:395-402).

Regeneracion de plantas

Esta divulgacion tambien se refiere a las partes de las plantas divulgadas en el presente documento, incluyendo celulas vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido de celulas vegetales a partir de los que pueden regenerarse plantas de girasol, callos de plantas, agrupaciones de plantas y celulas vegetales que estan intactos en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, ovulos, flores, hojas, vainas, tallos, rafces, puntas de rafces, anteras y semilla y harina de semillas.

Las plantas producidas de acuerdo con la presente divulgacion pueden regenerarse a partir de partes de plantas que utilizan tecnicas conocidas. Por ejemplo, las semillas de las plantas divulgadas en el presente documento pueden plantarse de acuerdo con los procedimientos de cultivo de girasoles convencionales. Estas plantas generaran semillas adicionales.

Las plantas de girasol pueden generarse tambien utilizando el cultivo y la regeneracion de tejidos. El cultivo de varias celulas y tejidos de girasol y la regeneracion de plantas del mismo es conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, la propagacion de girasol mediante el cultivo de tejidos se describe en las siguientes referencias: Henderson, et al, (1952) "The culture of normal sunflower stem callus.", Am. J. Bot. 39:444-451; Levine, M., (1951) "Response of fibrous roots of sunflower and tobacco tissue cultures to plant growth substances", Bot. Gaz. 112:281-289; Henrickson, C.E., (1954) "The flowering of sunflower explants in aseptic culture", Plant Physiol. 29:536-538; y Sadhu, M. K., (1974) "Effect of different auxins on growth and differentiation in callus tissue from sunflower stem pith", Indian J. Exp. Biol.

12:110-111.

Aceite y harina vegetal

La semilla de las plantas divulgadas en el presente documento puede utilizarse para producir aceite y harina vegetal. La semilla de estas variedades, la planta producida a partir de dicha semilla, la planta de girasol hfbrida producida a partir del cruzamiento de estas variedades con otras variedades, la semilla hfbrida resultante y varias partes de la planta hfbrida de girasol pueden utilizarse en la produccion de un aceite vegetal comestible u otros productos alimentarios de acuerdo con las tecnicas conocidas.

Las unidades, prefijos, y sfmbolos se indican en su forma aceptada del Sistema Internacional de Unidades (SI). A menos que se indique de otro modo, los acidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientacion 5' a 3'; las secuencias de aminoacidos se escriben de izquierda a derecha en orientacion amino a carboxi. Los intervalos numericos indicados en la memoria descriptiva incluyen los numeros que definen el intervalo e incluyen cada numero entero dentro del intervalo definido. Se puede hacer referencia a los nucleotidos en el presente documento por sus sfmbolos de una letra recomendados por la Comision de Nomenclatura IUPAC-IUBMB. Los terminos definidos en el presente documento se definen de manera mas completa por referencia a la memoria descriptiva como un todo.

Los siguientes Ejemplos se presentan como ilustraciones especfficas de la invencion reivindicada. Deberfa entenderse, sin embargo, que la invencion no esta limitada a los detalles especfficos expuestos en los Ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Cribado de campo

El cribado de la nueva fuente de germoplasma de fitomejoramiento y lfneas consangufneas para la resistencia a orobanca se realizo durante varios anos en el vivero de verano en Ahmetbey, Luleburgaz-Kirklarli, Turqufa. El vivero estaba infestado artificialmente con semillas de nuevas razas de O. cumana. La infestacion del suelo del vivero se repitio cada ano. El cribado se realizo plantando 15 plantas en una longitud de fila de 4 metros para cada seleccion del germoplasma de fitomejoramiento y lfneas consangufneas. Se evaluo la resistencia a orobanca justo antes de la cosecha retirando las plantas del suelo y contando el numero de plantas de girasol con brotes muertos de orobanca fijados al sistema de rafces del girasol debajo de la superficie del suelo. Se encontro que las plantas resistentes del Sistema 2 tenfan brotes primarios muertos de orobanca fijados a sus sistemas de rafces debajo del suelo. Las lfneas susceptibles a orobanca se infectaron con brotes de orobanca que emergieron del suelo. Las plantas susceptibles mostraron diferentes grados de intensidad de ataque de orobanca.

Ejemplo 2: Mapeo molecular del QTL que confiere resistencia del sistema 2 a orobanca

Un enfoque para determinar que alelos desempenan un papel en un rasgo fenotfpico es comparar las cepas de plantas con fenotipos altamente divergentes para el rasgo de interes. Las distribuciones de alelos para una base de datos entera de marcadores se analizan para los dos grupos fenotfpicos. Por ejemplo, una prueba de "Distribucion de alelos intergrupales" puede realizarse utilizando el software GeneFlow™ version 7.0 (GENEFLOW, Inc., Alexandria, Virginia). Un analisis de la frecuencia de alelos intergrupales proporciona un metodo para encontrar distribuciones no aleatorias de alelos entre dos grupos fenotfpicos. Durante el procesamiento, una tabla de contingencia de frecuencias de alelos se construye y a partir de ella se calculan una estadfstica G y probabilidad (la estadfstica G se ajusta utilizando la correccion de William). El valor de probabilidad se ajusta para tener en cuenta el hecho de que se estan realizando multiples pruebas (por lo tanto, existe algun fndice esperado de falsos positivos). La probabilidad ajustada es proporcional a la probabilidad de que las diferencias observadas de la distribucion de alelos entre las dos clases se produzcan solo por casualidad. Cuanto mas bajo es el valor de probabilidad, mas significativa es la asociacion entre el genotipo marcador en ese locus y el fenotipo de interes, en este caso, el fenotipo de resistencia a Orobanche. Una descripcion mas completa de la derivacion de los valores de probabilidad puede encontrarse en la documentacion del software GeneFlow™ version 7.0. Vease tambien, Sokal y Rolf (1981), Biometry: The Principles and Practices of Statistics in Biological Research, 2a ed., San Francisco, W. H. Freeman and Co. En este analisis, las probabilidades ajustadas inferiores a 0,05 se consideran significativas (el marcador y el fenotipo muestran desequilibrio de union), y las probabilidades ajustadas inferiores a aproximadamente 0,01 se consideran altamente significativas. Todas las clases de alelos representadas por menos de un numero mfnimo de observaciones a traves de ambos grupos no se incluyen en el analisis estadfstico.

La logica subyacente es que los marcadores con distribuciones de alelos significativamente diferentes entre los grupos resistentes y susceptibles pueden asociarse con el rasgo y pueden utilizarse para diferenciarlos. El presente analisis examino un locus marcador cada vez y determino si la distribucion de alelos dentro del grupo tolerante era significativamente diferente de la distribucion de alelos dentro del grupo susceptible. Una distribucion de alelos estadfsticamente diferente es una indicacion de que el marcador esta unido a un locus que esta asociado con la resistencia a Orobanche.

Para identificar los loci marcadores geneticos del girasol asociados con la resistencia a Orobanche, el mapeo de una poblacion de 182 lfneas de girasoles F2:3 se derivo del cruce de U0151LG (progenitor resistente) X E0005LG (progenitor susceptible). La resistencia o susceptibilidad de las lfneas progenitoras se habfan determinado anteriormente. Se aislo el ADN genomico de las plantas progenitoras y de la progenie y se analizaron en reacciones PCR utilizando cebadores de amplificacion publicamente disponibles especfficos para un gran numero de marcadores SSR que cubrieron colectivamente todos los cromosomas en el genoma del girasol. Las plantas de la progenie y progenitoras se puntuaron tambien en el campo para la resistencia a Orobanche. Como resultado de este analisis, un supuesto locus para la resistencia del sistema 2 a orobanca de raza H se mapeo para el grupo 4 de union (LG-04) del

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para identificar una planta de girasol o germoplasma de girasol que tiene un fenotipo de resistencia del Sistema II a Orobanche, que comprende detectar en una planta de girasol o germoplasma de girasol al menos un polimorfismo de un solo nucleotido (SNP por sus siglas en ingles) de un locus marcador que esta asociado con dicho fenotipo, en donde el locus marcador esta representado por la SEQ ID NO: 2 o presenta una frecuencia de recombinacion inferior al 5 % con respecto al locus marcador de la SEQ ID NO: 2 y mapea para el grupo de union 4.

2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la deteccion comprende amplificar el locus marcador o una parte del locus marcador y detectar el amplicon marcador amplificado resultante.

3. El metodo de la reivindicacion 2, en donde la amplificacion comprende:

(a) mezclar un cebador de amplificacion o un par de cebadores de amplificacion con un acido nucleico aislado de la planta o germoplasma de girasol, en donde el cebador o el par de cebadores es complementario o parcialmente complementario de al menos una parte del locus marcador, y es capaz de iniciar la polimerizacion del ADN mediante una ADN polimerasa utilizando el acido nucleico del girasol como molde; y

(b) extender el cebador o par de cebadores en una reaccion de polimerizacion de ADN que comprende una ADN polimerasa y un acido nucleico molde para generar al menos un amplicon.

4. El metodo de la reivindicacion 3, en donde el cebador o par de cebadores se selecciona de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 9 y 10.

5. Uso de un marcador para generar marcadores adicionales para la resistencia a Orobanche; en donde dicho marcador es un marcador genetico asociado con la resistencia del Sistema II a Orobanche y mapeo para el grupo de union 4 de Helianthus annuus, comprendiendo dicho marcador la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 o una variante que retiene al menos uno de los polimorfismos de la SEQ ID NO: 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1.

6. Un metodo para identificar genes o agrupaciones de genes en el genoma del girasol que dan lugar a la resistencia a Orobanche, comprendiendo amplificar una region cromosomica identificada por hibridacion a un cebador seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 9, o 10, y comprendiendo ademas opcionalmente rondas sucesivas de cribado y aislamiento de clones para construir un contigo que comprende un marco de lectura abierto.