ES2749964T3

ES2749964T3 - Planta resistente a un patógeno

Info

Publication number: ES2749964T3
Application number: ES10726524T
Authority: ES
Inventors: Olaf Zonneveld; Lange Michel De; William Briggs; Victor Segura
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2030-06-30
Also published as: JP5908834B2; AU2010270379B2; EP3603384B1; US9006521B2; WO2011003783A1; EP2272328A1; EP2451269A1; EP2451269B1; JP2012531920A; EP3603384A1; AU2010270379C1; US20120117683A1; AU2010270379A1

Abstract

Un marcador de ADN que está vinculado al locus de resistencia a Bremia lactucae y puede ser amplificado en una reacción PCR con un par de cebadores oligonucleótídicos de PCR seleccionados de a. par de cebadores 1 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 2, b. par de cebadores 2 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 4, c. par de cebadores 3 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 5 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 6; d. par de cebadores 4 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 7 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 8; y e. par de cebadores 5 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 10

Description

DESCRIPCIÓN

Planta resistente a un patógeno

La presente divulgación se refiere a nuevas plantas resistentes a Bremia, y a semillas de dichas plantas. La presente divulgación también se refiere a métodos para hacer este tipo de plantas y para producir semillas de las mismas. La invención se refiere a marcadores y su uso en la reproducción asistida por marcadores y para identificar el rasgo de resistencia a Bremia.

El mildiu velloso es una enfermedad fúngica provocada por el hongo Bremia lactucae. Se manifiesta en todo el mundo y representa un gran problema tanto para el rendimiento como para la calidad de la lechuga cultivada (Lactuca sativa). El hongo puede infectar la planta de lechuga en cualquier fase de crecimiento, después de lo cual los primeros síntomas de mildiu vellos se vuelven visibles como manchas amarillas cloróticas en la superficie de la hoja. Dentro de las 24-48 horas, se vuelve visible un crecimiento de hongo esponjoso blanco en la superficie inferior de la hoja como una indicación de la formación de esporas. Durante la infección, las manchas de lesiones se vuelven cada vez más grandes y más cloróticas hasta que las hojas se vuelven completamente de un color pardo. La esporulación típica se produce cuando las plántulas de lechuga son susceptibles al mildiú velloso por Bremia. En el caso de que las plantas sean homocigotas para el rasgo de resistencia, no se observa esporulación. Cuando un gen de resistencia semi-dominante es heterocigoto, tampoco se observa esporulación, pero a menudo se puede puntuar el amarilleamiento o el pardeamiento de los cotiledones en condiciones ideales de incubación de mildiú velloso por Bremia.

Bremia lactucae pertenece al grupo Oomicetos, una clase de hongos relativamente primitiva. Otros miembros de este grupo son, por ejemplo, Pythium y Phytophthora. B. lactucae contiene diferentes especies fisiológicas ("fisios"), es conocido como un patógeno muy variable y es específico para el huésped. Nuevos fisios se producen con relativa frecuencia a través de la mutación de los genes de avirulencia durante la formación de esporas que precede a la propagación de B. lactucae.

Dentro del género Lactucae, al que pertenece la lechuga cultivada, existen diferentes especies que son resistentes a Bremia lactucae. La resistencia se basa generalmente en genes cualitativos, conocidos como genes de resistencia Dm (Dm representa mildiú velloso). El mecanismo de resistencia se conoce como mecanismo gen por gen basado en la interacción específica entre productos del gen de resistencia a Dm y el gen de avirulencia específica para el patógeno (reacción HR) que da como resultado la resistencia de la planta de lechuga. Si un gen de resistencia es completamente dominante, no se observa esporulación de Bremia. Sin embargo, si una resistencia es semidominante, a menudo no hay esporulación, pero se observa un amarilleamiento/pardeamiento de los cotiledones. Debido a la alta variabilidad del patógeno, que se ha de atribuir a la aparición de mutaciones frecuentes en los genes de avirulencia, la resistencia específica para la raza mediada por los diversos genes de resistencia Dm generalmente se rompe rápidamente por las razas o fisios recientemente emergentes del patógeno Bremia.

Debido al rendimiento reducido y a la calidad de la lechuga cultivada (Lactuca sativa) provocado por la infestación de la planta de lechuga con el hongo Bremia, particularmente Bremia lactucae, existe una necesidad no satisfecha de estrategias convenientes y económicamente sostenibles para proteger las plantas, p.ej., plantas de lechuga tal como Lactuca, contra la infestación por Bremia lactucae.

La presente divulgación aborda esta necesidad al proporcionar una planta de Lactuca sativa, que es resistente a la infestación por Bremia lactucae y, por lo tanto, está protegida frente al daño provocado por este patógeno. La provisión de plantas de lechuga resistentes a Bremia es una alternativa ecológica para el uso de pesticidas y puede aumentar la eficiencia de las opciones de control biológico y contribuir a programas exitosos de gestión integrada de plagas.

El problema técnico subyacente a la presente divulgación es, por lo tanto, la provisión de una planta de Lactuca sativa resistente a Bremia, que muestra una resistencia mejorada, particularmente una resistencia general, no específica de raza a este patógeno en términos de razas conocidas a partir de la fecha de presentación de la presente solicitud, particularmente a las razas o aislados de Bremia BI1 a BI24, caracterizada y clasificada según el código SEXTET por IBEB (International Bremia Evaluation Board).

El problema técnico está resuelto. Además, ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que el vínculo entre los genes responsables de los cambios morfológicos no deseados en la planta y el gen responsable de la resistencia a Bremia lactucae tal como está presente en el material de origen de tipo salvaje, se rompe y, por lo tanto, ya no está presente en el planta de Lactuca sativa de acuerdo con la invención.

En un primer aspecto, la presente divulgación se refiere a una planta de Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae, en donde el locus de resistencia a Bremia, particularmente un locus de resistencia cualitativa a Bremia lactucae, está vinculado a un determinante genético y puede obtenerse del genoma de una planta silvestre de Lactuca, particularmente del genoma de Lactuca saligna. En un aspecto específico de la divulgación, la resistencia a Bremia lactucae es una resistencia general, no específica de la raza.

En un aspecto específico adicional de la divulgación, el rasgo de resistencia se expresa en la planta de L sativa sin la co-expresión de un gen vinculado que codifica o controla la expresión de un rasgo agronómicamente indeseable tal como, por ejemplo, crecimiento reducido ("enanismo").

En un aspecto, la presente divulgación contempla una planta de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en donde el locus de resistencia a Bremia lactucae está presente en un estado homocigoto.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona una planta de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en donde dicho locus de resistencia a Bremia lactucae está situado en el grupo de enlace 8.

En un aspecto adicional, la presente divulgación también contempla una planta de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en donde la presencia del locus de resistencia a Bremia lactucae se caracteriza por al menos un marcador de ADN representado por un cebador oligonucleotídico de PCR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10 o por un par de cebadores oligonucleotídicos de PCR seleccionados de a. par de cebadores 1 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 2,

b. par de cebadores 2 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 4,

c. par de cebadores 3 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 5 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 6;

d. par de cebadores 4 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 7 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 8; y

e. par de cebadores 5 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 10;

o por cualquier otro marcador en el cromosoma 8 que esté estadísticamente correlacionado y, por lo tanto, genéticamente vinculado con el rasgo de resistencia a Bremia.

En otro aspecto, la presente divulgación también se refiere a una planta de Lactuca sativa de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en donde el locus de resistencia a Bremia lactucae en Lactuca saligna está genéticamente vinculado a al menos un locus marcador, que se co-segrega con el rasgo de resistencia a Bremia y puede identificarse en una reacción PCR por al menos un cebador oligonucleotídico de PCR seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10 o por un par de cebadores de oligonucleótidos de PCR seleccionados de

a. par de cebadores 1 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 2,

En un aspecto adicional, se proporciona una planta de Lactuca sativa de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores que comprende al menos un alelo en un locus de rasgo cualitativo en el genoma de L. sativa que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae, que está genéticamente vinculada a al menos un locus de marcador, que se co-segrega con el rasgo de resistencia a Bremia y que puede identificarse mediante al menos un cebador oligonucleotídico de PCR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10 o un par de cebadores oligonucleotídicos de PCR seleccionados de

En un aspecto, dicho alelo en el locus del rasgo cualitativo en el genoma de L. sativa que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae, se puede obtener de una planta que tiene el fondo genético de la línea de Lactuca sativa LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1, particularmente de una planta que tiene el fondo o la arquitectura genética en el locus de rasgos cualitativos de la línea de Lactuca sativa LSA - (1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1, pero especialmente de una línea de Lactuca sativa LSA - (1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1, cuya semilla representativa está depositada en NCIMB con el N° de Acceso NCIMB 41625, o de una progenie o un ancestro del mismo que comprende dicho locus de rasgos cualitativos.

En otro aspecto tal como se describe en esta memoria, se proporciona una planta de Lactuca sativa de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes que comprende al menos un alelo o parte del mismo en un locus de rasgo cualitativo en el genoma de L. sativa que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae, que es complementario al alelo correspondiente presente en una línea de Lactuca saligna LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1, depositada bajo el N° de acceso NCIMB 41625, y genéticamente vinculada a al menos un locus de marcador dentro del genoma de L saligna, que se co-segrega con el rasgo de resistencia a Bremia y puede identificarse mediante al menos un cebador oligonucleotídico de PCR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10 o un par de cebadores de oligonucleótidos de PCR seleccionados de

También están comprendidos por la presente divulgación cebadores, particularmente pares de cebadores, pero especialmente pares de cebadores que consisten en cebadores directos e inversos que exhiben una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idénticos a los dados en las SEQ ID Nos: 1-11, y su uso para identificar o caracterizar el locus de resistencia a Bremia.

En un aspecto de la divulgación, se incluyen cebadores oligonucleotídicos, particularmente pares de cebadores, pero especialmente pares de cebadores que consisten en un cebador directo y un cebador inverso que exhiben una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias de nucleótidos de las secuencias de cebadores directo e inverso dadas en SEQ ID Nos: 1-11, bajo condiciones de rigurosidad media, particularmente de rigurosidad media a alta, particularmente bajo condiciones de rigurosidad alta, y su uso para identificar o caracterizar el locus de resistencia a Bremia.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona una planta de uno cualquiera de los aspectos precedentes, en donde el par de cebadores 1 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 2 y par de cebadores 2 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 4 amplifica cada uno un fragmento SSR que se co-segrega con el locus de resistencia a Bremia, pero particularmente una planta, en donde

el par de cebadores 1 amplifica un fragmento SSR de 247 pb; y

el par de cebadores 2 amplifica un fragmento SSR de 465 pb.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona una planta de uno cualquiera de los aspectos precedentes, en donde el par de cebadores 3 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 5 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 6 amplifica un fragmento de ADN dentro de la secuencia SSR amplificada por el par de cebadores 1, que comprende un SNP, particularmente un SNP representado por un intercambio de nucleótidos A por C en la posición 272 en la secuencia SSR, que SNP se co-segrega con el locus de resistencia a Bremia.

En un aspecto específico de la divulgación, dicho SNP co-segregante con el locus de resistencia a Bremia se puede identificar con una sonda de ADN de SEQ ID NO: 11.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona una planta de uno cualquiera de los aspectos precedentes, en donde el par de cebadores 4 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 7 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 8 y par de cebadores 5 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 10 amplifica cada uno un fragmento de ADN dentro de la secuencia SSR amplificada por el par de cebadores 2, que comprende un SNP, particularmente un SNP representado por un intercambio de nucleótidos A por G en la posición 430 en la secuencia SSR, y/o un SNP representado por un intercambio de nucleótidos G por T en la posición 305 en la secuencia SSR, SNP(s) se co-segrega con el locus de resistencia a Bremia.

En un aspecto específico de la divulgación, dichos SNPs que se co-segregan con el locus de resistencia a Bremia se pueden identificar con una sonda de ADN de SEQ ⁱD NO: 13 y una sonda de ADN de SEQ ID NO: 15, respectivamente.

En un aspecto adicional, la presente divulgación también se refiere a una planta de acuerdo con cualquiera de las aspectos precedentes, en donde dicha planta es endogámica, un dihaploide o un híbrido.

En otro aspecto, también se describe una planta de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en donde dicha planta es estéril masculina.

En un aspecto de la divulgación, la planta de Lactuca sativa de acuerdo con la divulgación y tal como se describe antes en esta memoria es heterocigótica para el rasgo de resistencia a Bremia.

En un aspecto de la divulgación, la planta de Lactuca sativa de acuerdo con la divulgación y tal como se describe antes en esta memoria es homocigótica para el rasgo de resistencia a Bremia.

Un aspecto específico de la divulgación se refiere a una planta de L. sativa de acuerdo con la divulgación y tal como se describe antes en esta memoria es capaz de resistir infestaciones con Bremia, planta que es una planta de un grupo de cultivares seleccionados de lechuga mantecosa, lechuga china, lechuga crujiente (formas iceberg), lechuga de hojas sueltas, lechuga romana y lechuga crujiente de verano.

En un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a material vegetal obtenible de una planta de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, que incluyen, pero no se limitan a hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos celulares o de tejidos, o cualquier otra parte o producto de la planta que todavía exhiba el fenotipo resistente de acuerdo con la divulgación, particularmente cuando se cultiva en una planta.

En otro aspecto tal como se describe en esta memoria, se proporcionan partes de una planta de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes que incluyen, pero no se limitan a semillas de plantas, órganos de plantas, tales como, por ejemplo, una raíz, un tallo, una hoja, una yema floral, o un embrión, etc., óvulos, microsporas de polen, células vegetales, tejidos vegetales, cultivos de células vegetales, tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diversas fases de desarrollo, etc. que aún exhibe el fenotipo resistente de acuerdo con la divulgación, particularmente cuando se cultiva en una planta.

En un aspecto adicional de la presente divulgación, también se proporciona una semilla de una planta homocigota de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes.

En otro aspecto, la presente divulgación describe además semillas de una planta de Lactuca sativa tal como se reivindica en cualquiera de los aspectos precedentes, particularmente semilla híbrida, que comprende el determinante genético que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a semillas de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, depositadas en NCIMB Ltd. Bajo el N° de Acceso NCIMB 41625.

En un aspecto adicional, las semillas de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes son proporcionadas por la presente divulgación, en donde dicho determinante genético es un gen de resistencia ubicado en el grupo de enlace 8.

La presente divulgación también describe el uso de Lactuca sativa de uno cualquiera de los aspectos precedentes para producir semilla que comprende el determinante genético que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae, particularmente un gen de resistencia a Bremia ubicado en el grupo de enlace 8.

En otro aspecto, en esta memoria se proporciona un kit para la detección del locus de resistencia a Bremia lactucae en Lactuca sativa, en donde dicho kit comprende al menos un cebador oligonucleotídico de PCR, particularmente un cebador oligonucleotídico de PCR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10 o un par de cebadores oligonucleotídicos de PCR seleccionados de

o cualquier otro marcador en el cromosoma 8 que esté estadísticamente correlacionado y, por lo tanto, genéticamente vinculado al rasgo de resistencia a Bremia y que sea capaz de amplificar un marcador de ADN enlazado al locus de resistencia a Bremia lactucae.

En otro aspecto, se proporciona un kit que contiene, además, una molécula de sonda seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

En una realización de la presente invención, se proporciona un marcador de ADN que está vinculado al locus de resistencia a Bremia lactucae y puede amplificarse por al menos un cebador oligonucleotídico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10 o por un par de cebadores oligonucleótídicos de PCR seleccionados de

o por cualquier otro marcador en el cromosoma 8 que esté estadísticamente correlacionado y, por lo tanto, genéticamente vinculado al rasgo de resistencia a Bremia y que sea capaz de amplificar un marcador de ADN enlazado al locus de resistencia a Bremia lactucae.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también al uso de algunos o todos de estos marcadores de ADN para la selección de diagnóstico del locus de resistencia de la lechuga a Bremia, en particular el locus de resistencia Ls1 a Bremia, en Lactuca sativa.

En otra realización, la presente invención contempla, además, el uso de algunos o todos estos marcadores de ADN para identificar en una planta la presencia del locus de resistencia a Bremia lactucae y/o para controlar la introgresión del locus de resistencia de la lechuga a Bremia lactucaeen Lactuca sativa.

En una realización, la invención se refiere al polinucleótido (producto de amplificación) que se puede obtener en una reacción de PCR que implica al menos un cebador oligonucleotídico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10 o un par de cebadores de oligonucleótidos de PCR seleccionados de

o cualquier otro marcador en el cromosoma 8 que esté estadísticamente correlacionado y, por lo tanto, genéticamente relacionado con el rasgo de resistencia a Bremia, cuyo producto de amplificación corresponde a un producto de amplificación obtenible de la línea de Lactuca sativa LSA - (1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1 (NCIMB 41625) en una reacción PCR con cebadores o pares de cebadores idénticos, con la condición de que el respectivo locus marcador todavía esté presente en dicha planta de Lactuca sativa y/o pueda considerarse un alelo de la misma.

También se describe en esta memoria un polinucleótido que tiene al menos 90%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de dicho producto de amplificación y/o un polinucleótido que exhibe una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias de nucleótidos de dicho producto de amplificación obtenible en la reacción PCR anterior.

El producto de amplificación de acuerdo con la invención y arriba descrito en esta memoria se puede utilizar para generar o desarrollar nuevos cebadores y/o sondas que se pueden utilizar para identificar el locus de resistencia a Bremia lactucae.

Por lo tanto, la presente divulgación se refiere, además, en un aspecto a marcadores derivados, particularmente a cebadores o sondas derivados, desarrollados a partir de un producto de amplificación de acuerdo con la divulgación y tal como se describe anteriormente en esta memoria por métodos conocidos en la técnica, cuyos marcadores derivados están genéticamente vinculados al locus de resistencia a Bremia, particularmente al locus Ls1 de resistencia a Bremia, en Lactuca sativa.

Estos marcadores derivados pueden entonces ser utilizados para identificar plantas resistentes a Bremia, en donde los marcadores descritos específicamente en esta memoria se recombinan con respecto a la resistencia y, por lo tanto, ya no está presente en el genoma de la planta resistente.

En un aspecto adicional, se proporciona un método dentro de la presente divulgación para introducir al menos un alelo asociado con la resistencia a Bremia lactucae en un locus de rasgo cualitativo que contribuye a la resistencia a Bremia en una planta de Lactuca sativa que carece de dicho alelo, que comprende: a) obtener una primera planta de Lactuca sativa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; b) cruzar dicha primera planta de Lactuca sativa con una segunda planta de Lactuca sativa, en donde dicha segunda planta de Lactuca sativa carece de dicho alelo; y c) identificar una planta resultante del cruce que exhibe una resistencia incrementada a Bremia lactucae y que comprende al menos un alelo marcador que se co-segrega con dicha resistencia a Bremia; y d), opcionalmente, aislar dicha planta y e), opcionalmente, realizar un retrocruzamiento de dicha planta con la primera o segunda planta de Lactuca sativa.

En un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere también a un método de obtener una planta de Lactuca sativa resistente contra Bremia lactucae, que comprende: a) obtener un híbrido F1 cruzando una planta de Lactuca saligna con una planta de Lactuca sativa, que es sensible a la infestación con Bremia lactucae; b) retrocruzar el híbrido F1 con dicha planta de Lactuca sativa; y c) identificar una planta resultante del cruce que exhibe resistencia a Bremia lactucae y que comprende al menos un alelo marcador que se co-segrega con dicha resistencia a Bremia, y d), opcionalmente, cultivar dicha planta.

En otro aspecto, se describe un método en esta memoria para obtener semilla de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, que comprende las etapas de: a) obtener una primera planta de Lactuca sativa de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos precedentes; b) cruzar dicha primera planta de Lactuca sativa con una segunda planta de Lactuca sativa, en donde dicha segunda planta de Lactuca sativa carece de dicho alelo; y c) identificar una planta resultante del cruce que exhibe resistencia a Bremia lactucae y que comprende al menos un alelo marcador que se co-segrega con dicha resistencia a Bremia; y d) cosechar semillas de la progenie de dicho cruce que comprende al menos un alelo marcador que se co-segrega con dicha resistencia a Bremia.

En un aspecto específico de la presente divulgación, la planta resultante de uno de los cruces anteriores se identifica en la etapa c) aplicando una reacción PCR utilizando al menos un cebador oligonucleotídico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID N^o. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10 o un par de cebadores de oligonucleótidos de PCR seleccionados de

o cualquier otro marcador en el cromosoma 8 que esté estadísticamente correlacionado y, por lo tanto, genéticamente vinculado con el rasgo de resistencia a Bremia.

En un determinado aspecto de la divulgación, la etapa c) del método se complementa, además, mediante la determinación de (a) el tamaño del fragmento del producto de amplificación obtenido en una reacción PCR con el par de cebadores 1 y/o el par de cebadores 2, y/o (b) el SNP en el amplicón obtenido en una reacción PCR con el par de cebadores 3, el par de cebadores 4 y el par de cebadores 5, utilizando una molécula de sonda seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15.

En un aspecto adicional, la presente divulgación también se refiere a un método de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en el que en la etapa c) la planta resultante de cualquiera de los cruces anteriores se identifica aplicando una selección fenotípica basada en las plantas que exhiben una resistencia incrementada a Bremia lactucae o mediante una combinación de una selección basada en PCR y una selección fenotípica.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para proteger una planta de Lactuca sativa contra la infestación con Bremia lactucae, que comprende a) obtener una planta de Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos precedentes; y b) cultivar dicha planta en un área con alta presión de enfermedad (Bremia lactucae).

En otro aspecto de la presente divulgación, se describe el uso de una semilla de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos precedentes para cultivar una planta de Lactuca sativaresistente a Bremia lactucae.

Definiciones

A las expresiones y términos técnicos usados dentro del alcance de esta solicitud generalmente se les da el significado habitualmente aplicado a los mismos en la técnica relevante de mejoramiento y cultivo de plantas si no se indica lo contrario en esta memoria a continuación.

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/o", "una" y "el/la" incluyen sus plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una o más plantas y la referencia a "una célula" incluye mezclas de células, tejidos y similares.

Una planta cultivada de "Lactuca sativa" se entiende dentro del alcance de la invención para referirse a una planta que ya no está en estado natural, sino que ha sido desarrollada por el cuidado humano y para uso y/o consumo humano.

Se entiende que un "alelo" dentro del alcance de la invención se refiere a formas alternativas o variantes de diversas unidades genéticas idénticas o asociadas con diferentes formas de un gen o de cualquier tipo de elemento genético identificable, que son alternativas en herencia porque están situadas en el mismo locus en cromosomas homólogos Dichas formas alternativas o variantes pueden ser el resultado de polimorfismos, inserciones, inversiones, translocaciones o deleciones de un solo nucleótido, o la consecuencia de la regulación génica provocada, por ejemplo, por modificación química o estructural, regulación de la transcripción. o modificación/regulación posttraduccional. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen o elemento genético dado típicamente ocupan los locus correspondientes en un par de cromosomas homólogos.

Un alelo asociado con un rasgo cualitativo puede comprender formas alternativas o variantes de diversas unidades genéticas, incluidas las que son idénticas o están asociadas con un solo gen o múltiples genes o sus productos, o incluso un gen alterado o controlado por un factor genético que contribuye al fenotipo representado por el locus. Como se usa en esta memoria, la expresión "alelo marcador" se refiere a una forma alternativa o variante de una unidad genética como se define en este documento anteriormente, cuando se usa como un marcador para ubicar locus genéticos que contienen alelos en un cromosoma que contribuyen a la variabilidad de los rasgos genotípicos. Como se usa en esta memoria, el término "reproducción", y variantes gramaticales del mismo, se refieren a cualquier proceso que genere un individuo de la descendencia. Las reproducciones pueden ser sexuales o asexuales, o cualquier combinación de las mismas. Tipos no limitantes a modo de ejemplo de reproducciones incluyen cruces, autopolinización, generación de derivados haploides duplicados y combinaciones de los mismos.

Como se usa en esta memoria, la frase "población reproductora establecida" se refiere a una colección de potenciales participantes en la reproducción producidos por y/o utilizados como parentales en un programa de reproducción; p. ej., un programa de reproducción comercial. Los miembros de la población reproductora establecida están típicamente bien caracterizados genética y/o fenotípicamente. Por ejemplo, varios rasgos fenotípicos de interés podrían haber sido evaluados, p. ej., bajo diferentes condiciones ambientales, en múltiples ubicaciones y/o en diferentes momentos. Alternativamente o además, uno o más loci genéticos asociados con la expresión de los rasgos fenotípicos podrían haber sido identificados y uno o más de los miembros de la población reproductora podrían haber sido genotipados con respecto al uno o más loci genéticos, así como con respeto a uno o más marcadores genéticos que están asociados con uno o más loci genéticos.

Como se usa en esta memoria, la frase "individuo diploide" se refiere a un individuo que tiene dos conjuntos de cromosomas, típicamente uno de cada uno de sus dos parentales. Sin embargo, se entiende que, en algunas realizaciones, un individuo diploide puede recibir sus conjuntos de cromosomas "maternos" y "paternos" del mismo organismo individual, tal como cuando una planta se autofecunda para producir una generación posterior de plantas. Se entiende dentro del alcance de la invención que "homocigótico" se refiere a alelos similares en uno o más loci correspondientes en cromosomas homólogos.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "heterocigótico" se refiere a alelos diferentes en uno o más loci correspondientes en cromosomas homólogos.

Se entiende por " retrocruzamiento " dentro del alcance de la invención para referirse a un proceso en el que una progenie híbrida se retrocruza repetidamente con uno de los parentales. Se pueden utilizar diferentes parentales recurrentes en retrocruzamientos posteriores.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "locus" se refiere a una región en un cromosoma, que comprende un gen o cualquier otro elemento genético o factor que contribuye a un rasgo.

Como se usa en esta memoria, "locus marcador" se refiere a una región de un cromosoma, que comprende un nucleótido o una secuencia de polinucleótidos que está presente en el genoma de un individuo y que se asocia con uno o más loci de interés, que puede que comprendan un gen o cualquier otro elemento o factor genético que contribuya a un rasgo. "Locus marcador" también se refiere a una región en un cromosoma, que comprende una secuencia de polinucleótidos complementaria a una secuencia genómica, tal como una secuencia de un ácido nucleico utilizado como sondas.

"Ligamiento genético" se entiende dentro del alcance de la invención que se refiere a una asociación de caracteres de herencia debido a la ubicación de genes en la proximidad en el mismo cromosoma, medidos por porcentaje de recombinación entre loci (centi-Morgan, cM).

Para los fines de la presente invención, el término "co-segregación" se refiere al hecho de que el alelo para el rasgo y el o los alelos para el o los marcadores tienden a transmitirse juntos, porque están físicamente juntos en el mismo cromosoma (recombinación reducida entre ellos debido a su proximidad física) que resulta en una asociación no aleatoria de sus alelos como resultado de su proximidad en el mismo cromosoma. La "co-segregación" también se refiere a la presencia de dos o más rasgos dentro de una única planta de los que se sabe que al menos uno es genético y que no puede explicarse fácilmente por casualidad.

Como se usa en esta memoria, la expresión "arquitectura genética en el locus del rasgo cualitativo" se refiere a una región genómica que está correlacionada estadísticamente con el rasgo fenotípico de interés y representa la base genética subyacente del rasgo fenotípico de interés.

Como se usa en esta memoria, las frases "cruzada sexualmente" y "reproducción sexual" en el contexto de la materia objeto actualmente descrita se refieren a la fusión de gametos para producir progenie (p. ej., mediante fertilización, tal como para producir semillas por polinización en plantas). Un "cruce sexual" o una "fertilización cruzada" es en algunas realizaciones la fertilización de un individuo por otro (p. ej., polinización cruzada en plantas). El término "autofecundación" se refiere en algunas realizaciones a la producción de semilla mediante autofertilización o auto-polinización; es decir, el polen y el óvulo son de la misma planta.

Como se usa en esta memoria, la expresión "marcador genético" se refiere a una característica de un genoma del individuo (p. ej., un nucleótido o una secuencia de polinucleótidos que está presente en un genoma del individuo) que está asociado con uno o más loci de interés. En algunas realizaciones, un marcador genético es polimórfico en una población de interés, o el locus ocupado por el polimorfismo, dependiendo del contexto. Marcadores genéticos incluyen, por ejemplo, polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), indeles (es decir, inserciones/deleciones), repeticiones de secuencias simples (SSRs), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLPs), ADNs polimórficos amplificados al azar (RAPDs), secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS), marcadores de Tecnología de matrices de Diversidad (DArT ) y polimorfismos de longitud de fragmento amplificado (AFLPs), entre muchos otros ejemplos. Los marcadores genéticos pueden usarse, por ejemplo, para localizar loci genéticos que contienen alelos en un cromosoma que contribuye a variabilidad de rasgos fenotípicos. La expresión "marcador genético" también puede referirse a una secuencia polinucleotídica complementaria a una secuencia genómica, tal como una secuencia de un ácido nucleico usado como sonda.

Un marcador genético puede ubicarse físicamente en una posición en un cromosoma que está dentro o fuera del locus genético con el que está asociado (es decir, es intragénico o extragénico, respectivamente). Dicho de otra manera, mientras que los marcadores genéticos generalmente se emplean cuando no se ha identificado la ubicación en un cromosoma del gen o de una mutación funcional, p. ej., dentro de un elemento de control fuera de un gen, que corresponde al locus de interés y hay un tasa de recombinación distinta de cero entre el marcador genético y el locus de interés, la materia objeto actualmente divulgada también puede emplear marcadores genéticos que están físicamente dentro de los límites de un locus genético (p. ej., dentro de una secuencia genómica que corresponde a un gen, tal como, pero no limitado a un polimorfismo dentro de un intrón o un exón de un gen). En algunas realizaciones la materia objeto descrita en la presente, el uno o más marcadores genéticos comprenden entre uno y diez marcadores, y en algunas realizaciones el uno o más marcadores genéticos comprenden más de diez marcadores genéticos.

Como se usa en esta memoria, el término "genotipo" se refiere a la constitución genética de una célula u organismo. El "genotipo para un conjunto de marcadores genéticos" de un individuo incluye los alelos específicos para uno o más loci marcadores genéticos, presentes en el haplotipo de un individuo. Como se sabe en la técnica, un genotipo puede estar relacionado con un único locus o con múltiples loci, pudiendo estar los loci relacionados o no relacionados y/o ligados o no ligados. En algunas realizaciones, un genotipo de un individuo se refiere a uno o más genes que están relacionados en que el uno o más de los genes están implicados en la expresión de un fenotipo de interés (p. ej., un rasgo cuantitativo o cualitativo tal como se define en esta memoria). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un genotipo comprende un resumen de uno o más alelos presentes dentro de un individuo en uno o más loci genéticos de un rasgo cuantitativo o cualitativo. En algunas realizaciones, un genotipo se expresa en función de un haplotipo (definido en este documento más adelante).

Como se usa en esta memoria, el término "germoplasma" se refiere a la totalidad de los genotipos de una población u otro grupo de individuos (p. ej., una especie). El término "germoplasma" también puede referirse a material vegetal; p. ej., un grupo de plantas que actúan como depósito de diversos alelos. La frase "germoplasma adaptado" se refiere a materiales vegetales de probada superioridad genética; p. ej., para un entorno o área geográfico dado, mientras que las frases "germoplasma no adaptado", "germoplasma bruto" y "germoplasma exótico" se refieren a materiales vegetales de valor genético desconocido o no probado; p. ej., para un entorno o área geográfica dado; tal como la frase "germoplasma no adaptado" se refiere en algunas realizaciones a materiales vegetales que no son parte de una población reproductora establecida y que no tienen una relación conocida con un miembro de la población reproductora establecida.

Como se usa en esta memoria, el término "híbrido» y las expresiones "planta híbrida" y "progenie híbrida" se refieren a un individuo producido a partir de parentales genéticamente diferentes (p. ej., un individuo genéticamente heterocigótico o mayormente heterocigótico).

Como se usa en esta memoria, la frase "híbrido F1 simple" se refiere a un híbrido F1 producido a partir de un cruce entre dos líneas endogámicas.

Como se usa en esta memoria, la expresión "línea endogámica" se refiere a una población genéticamente homocigótica o casi homocigótica. Una línea endogámica, por ejemplo, puede obtenerse mediante varios ciclos de reproducción entre hermanos o de autopolinización o en producción de dihaploides. En algunas realizaciones, las líneas endogámicas reproducen verdaderamente uno o más rasgos fenotípicos de interés. Un "endogámico", "individuo endogámico" o "descendencia endogámica" es un individuo muestreado de una línea endogámica.

Como se usa en este documento, la expresión "línea dihaploide", se refiere a líneas endogámicas estables que han surgido de cultivo de anteras. Algunos granos de polen (haploides) cultivados en medio y circunstancias específicas pueden desarrollar plántulas que contienen n cromosomas. Estas plántulas entonces están "duplicadas" y contienen 2n cromosomas. La progenie de estas plántulas se denomina "dihaploide" y esencialmente ya no se segrega (es estable).

Como se usa en esta memoria, el término "ligamiento" y variantes gramaticales del mismo, se refiere a la tendencia de alelos en diferentes loci en el mismo cromosoma de segregar juntos más a menudo que lo que se esperaría por probabilidad si su transmisión fuera independiente, en algunas realizaciones como una consecuencia de su proximidad física.

Como se usa en esta memoria, la frase "ácido nucleico" se refiere a cualquier cadena física de unidades monoméricas que puede corresponder a una cadena de nucleótidos, incluido un polímero de nucleótidos (p. ej., un polímero típico de ADN, ADNc o ARN), oligonucleótidos modificados (p. ej., oligonucleótidos que comprenden bases que no son típicas de ARN o ADN biológicos, tales como oligonucleótidos 2'-0-metilados), y similares. En algunas realizaciones, un ácido nucleico puede ser de cadena sencilla, de doble cadena, de múltiples cadenas o combinaciones de los mismos. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico de la materia objeto descrita comprende o codifica opcionalmente secuencias complementarias, además de cualquier secuencia explícitamente indicada.

Como se usa en esta memoria, la frase "rasgo fenotípico" se refiere a la apariencia u otra característica detectable de un individuo, que resulta de la interacción de su genoma, proteoma y/o metaboloma con el entorno.

Como se usa en esta memoria, la frase "resistencia" se refiere a la capacidad de una planta de restringir el crecimiento y desarrollo de un patógeno específico y/o el daño que provocan cuando se comparan con plantas susceptibles en condiciones ambientales similares y la presión del patógeno. Plantas resistentes pueden exhibir algunos síntomas o daños de la enfermedad bajo la presión del patógeno, p. ej., la presión del patógeno fúngico, tal como la presión del patógeno Bremia lactucae.

Como se usa en esta memoria, el término "susceptibilidad" se refiere a la incapacidad de una planta de restringir adecuadamente el crecimiento y el desarrollo de un patógeno específico, p. ej., un patógeno fúngico, tal como Bremia lactucae.

Como se usa en esta memoria, la frase "resistencia a Bremia" o "resistencia a razas de Bremia" o "planta resistente a Bremia" se refiere a la capacidad de las plantas de resistir la colonización por el hongo Bremia lactucae, aislados BI: 1 a BI: 24 como se caracteriza y clasifica de acuerdo con el código ^sE^xTET por IBEB (International Bremia Evaluation Board).

Plantas resistentes no mostrarán o mostrarán muy pocas necrosis con una esporulación nula o muy escasa en las condiciones de ensayo definidas en el Ejemplo 1.5 que figura más adelante.

Como se usa en esta memoria, el término "pluralidad" se refiere a más de uno. Por lo tanto, una " pluralidad de individuos " se refiere a al menos dos individuos. En algunas realizaciones, el término pluralidad se refiere a más de la mitad del total. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "pluralidad de una población" se refiere a más de la mitad de los miembros de esa población.

Como se usa en esta memoria, el término "progenie" se refiere al o a los descendientes de un cruce particular. Típicamente, la progenie es el resultado del cultivo de dos individuos, aunque algunas especies (particularmente algunas plantas y animales hermafroditas) pueden ser autofecundadas (es decir, la misma planta actúa como donante de gametos masculinos y femeninos). El o los descendientes pueden ser, por ejemplo, de la F1, la F2, o cualquier generación posterior.

Como se usa en esta memoria, la frase "rasgo cualitativo" se refiere a un rasgo fenotípico que es controlado por uno o unos pocos genes que exhiben efectos fenotípicos importantes. Debido a esto, los rasgos cualitativos son típicamente heredados simplemente. Ejemplos en plantas incluyen, pero no se limitan a, color de la flor, color del fruto y varias resistencias a enfermedades conocidas, tales como, por ejemplo, resistencia a la mancha de hongos. La "selección basada en marcadores" se entiende dentro del alcance de la invención para referirse, p. ej., al uso de marcadores genéticos para detectar uno o más ácidos nucleicos de la planta, en que el ácido nucleico está asociado con un rasgo deseado para identificar plantas que portan genes para rasgos deseables (o indeseables), de modo que esas plantas puedan usarse (o evitarse) en un programa de reproducción selectiva.

" Marcador de Microsatélites o SSRs (repeticiones de secuencias simples)" se entiende dentro del alcance de la invención para referirse a un tipo de marcador genético que se compone de numerosas repeticiones de secuencias cortas de bases de ADN, que se encuentran en los loci en el genoma de toda la planta y tienen una probabilidad de ser altamente polimórficos.

" PCR (reacción en cadena de la polimerasa)" se entiende dentro del alcance de la invención para referirse a un método para producir cantidades relativamente grandes de regiones específicas de ADN o subconjunto(s) del genoma, haciendo posible con ello diversos análisis que se basan en estas regiones.

"Cebador de PCR" se entiende dentro del alcance de la invención para referirse a fragmentos relativamente cortos de ADN de cadena sencilla utilizado en la amplificación por PCR de regiones específicas de ADN.

Se entiende que " fenotipo" dentro del alcance de la invención se refiere a una o más característica(s) distinguibles de un rasgo genéticamente controlado.

Se entiende que "polimorfismo" dentro del alcance de la invención se refiere a la presencia en una población de dos o más formas diferentes de un gen, marcador genético o rasgo heredado o un producto génico obtenible, por ejemplo, mediante corte y empalme alternativo, metilación del ADN, etc.

"Reproducción selectiva" se entiende dentro del alcance de la invención que se refiere a un programa de reproducción que utiliza plantas que poseen o muestran rasgos deseables como parentales.

Se entiende que la planta "que se va a ensayar" dentro del alcance de la invención se refiere a una planta del género Lactuca utilizada para caracterizar genéticamente un rasgo en una planta a ensayar. Típicamente, la planta que se va a ensayar se cruza con una planta "de prueba" y se puntúa la relación de segregación del rasgo en la progenie del cruce.

"Sonda", tal como se usa en esta memoria, se refiere a un grupo de átomos o moléculas que es capaz de reconocer y unirse a una molécula o estructura celular diana y, por lo tanto, permitir la detección de la molécula o estructura diana. Particularmente, "sonda" se refiere a una secuencia de ADN o ARN marcada que puede usarse para detectar la presencia de y para cuantificar una secuencia complementaria por hibridación molecular.

El término "hibridar", como se usa en esta memoria, se refiere a condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente a condiciones de hibridación en las que se usa 5xSSPE, SDS al 1%, solución Denhardt 1x como una solución y/o las temperaturas de hibridación están entre 35°C y 70°C, preferiblemente en 65°C. Después de la hibridación, el lavado se realiza preferiblemente primero con 2xSSC, SDS al 1% y luego con 0.2xSSC a temperaturas entre 35°C y 75°C, particularmente entre 45°C y 65°C, pero especialmente a 59°C (con respecto a la la definición de SSPE, SSC y solución de Denhardt, véase Sambrook et al., loc. cit.). Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad, como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., supra, son particularmente preferidas. Condiciones de hibridación rigurosas particularmente preferidas están presentes, por ejemplo, si la hibridación y el lavado se producen a 65°C, como se indicó anteriormente. Condiciones de hibridación no rigurosas, por ejemplo, con la hibridación y el lavado llevados a cabo a 45°C, son menos preferidas y a 35°C incluso menos.

"Homología de Secuencia o Identidad de Secuencia" se usa en esta memoria indistintamente. Los términos "idénticas" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o proteínas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia, según se miden utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Si las dos secuencias que deben compararse entre sí difieren en longitud, la identidad de secuencia se relaciona preferiblemente con el porcentaje de los residuos de nucleótidos de la secuencia más corta que son idénticos a los residuos de nucleótidos de la secuencia más larga. La identidad de secuencia se puede determinar convencionalmente con el uso de programas de computadora como el programa Bestfit (Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, con el fin de encontrar el segmento con la mayor identidad de secuencia entre dos secuencias. Cuando se utiliza Bestfit u otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene, por ejemplo, una identidad del 95% con una secuencia de referencia de la presente invención, los parámetros se ajustan preferiblemente de modo que el porcentaje de identidad se calcule en toda la longitud de la secuencia de referencia. y que se permiten brechas de homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Cuando se usa Bestfit, los denominados parámetros opcionales se dejan preferiblemente en sus valores predeterminados ("por defecto"). Las desviaciones que aparecen en la comparación entre una secuencia dada y las secuencias de la invención arriba descritas pueden ser provocadas, por ejemplo, por adición, deleción, sustitución, inserción o recombinación. Esta comparación de secuencias también se puede realizar preferiblemente con el programa " fasta20u66 " (versión 2.0u66, septiembre de 1998 por William R. Pearson y la Universidad de Virginia; véase también W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, ejemplos adjuntos y http://workbench.sdsc.edu/). Para este fin, pueden usarse los ajustes de parámetros "por defecto".

Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. La frase: "hibridación específicamente a" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula solo a una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (p. ej., celular total) ADN o ARN. "Se une(n) sustancialmente" se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico diana y abarca desajustes menores que pueden acomodarse reduciendo la rigurosidad de los medios de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico diana.

Las "condiciones de hibridación rigurosas" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas", en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como las hibridaciones de Southern y Northern, dependen de la secuencia y son diferentes para parámetros ambientales distintos. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nueva York. En general, las condiciones de hibridación y lavado altamente rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C.más bajas que el punto de fusión térmico para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Normalmente, en "condiciones rigurosas" hibridará una sonda con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

El punto de fusión térmico es la temperatura (con una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Se seleccionan condiciones muy estrictas para que sean iguales a la T sub m para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una transferencia Southern o northern son formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42°C, y la hibridación se lleva a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCl 0,15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos.. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado SSC 0,2 veces a 65°C. durante 15 minutos (véase Sambrook, infra, para una descripción de tampón SSC). A menudo, un lavado de rigurosidad alta va precedido por un lavado de rigurosidad baja para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para un dúplex de, p. ej., más de 100 nucleótidos, es 1 vez SSC a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de rigurosidad baja para un dúplex de, p. ej., más de 100 nucleótidos, es 4-6 veces SSC a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (p. ej., aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones rigurosas implican típicamente concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1,0 M ion Na, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de ion Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es típicamente de al menos aproximadamente 30°C. También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2 veces (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, p. ej., cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier fase de desarrollo, particularmente una planta de semilla.

Una "célula vegetal" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una única célula aislada o de una célula cultivada, o formar parte de una unidad con una organización superior tal como, por ejemplo, un tejido vegetal, un órgano vegetal o una planta entera.

"Cultivo de células vegetales" significa cultivos de unidades vegetales tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diversas etapas de desarrollo.

"Material vegetal" o " material vegetal que se obtiene de una planta " se refiere a hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos celulares o de tejidos, o cualquier otra parte o producto de una planta.

Un "órgano de una planta" es una parte distinta y visiblemente estructurada y diferenciada de una planta, tal como una raíz, un tallo, una hoja, una yema floral o un embrión.

"Tejido vegetal", como se usa en esta memoria, se refiere a un grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional. Se incluye cualquier tejido de una planta en la planta o en cultivo. Esta expresión incluye, aunque sin limitación, plantas enteras, órganos vegetales, semillas de plantas, cultivo tisular y cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de esta expresión junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido vegetal, como los enumerados anteriormente o que esté contemplado de otra manera por esta definición, no pretende ser exclusivo de ningún otro tipo de tejido vegetal. Los términos " raza " o " razas " se refieren a cualquier grupo de endogamia, incluidos subgrupos taxonómicos, tales como subespecies, taxonómicamente subordinados a una especie y superordinados a una sub-raza y marcados por un perfil predeterminado de factores latentes de rasgos hereditarios.

La presente invención se refiere a nuevas plantas de Lactuca sativa, que son resistentes a la infestación por Bremia lactucae y, por lo tanto, están protegidas frente al daño provocado por este patógeno. La presente invención también se refiere a métodos de producción y uso de este tipo de plantas.

Las plantas de acuerdo con la invención pueden obtenerse cruzando dos o más genotipos parentales, de los cuales al menos uno puede tener uno o más alelos, particularmente uno o más alelos en loci de rasgos cualitativos correspondientes que contribuyen a la resistencia a Bremai, alelo(s) que carece(n) del otro genotipo parental o que complementa el otro genotipo para obtener una planta de acuerdo con la invención y como se describió anteriormente en esta memoria. Si más de uno de los loci de rasgos cualitativos contribuye a la expresión del rasgo de resistencia y los dos genotipos parentales originales no proporcionan el conjunto completo de alelos, se pueden incluir otras fuentes en la población reproductora. El otro genotipo parental puede contribuir un rasgo deseable incluyendo la calidad del cultivo exigida por el mercado, tales como, por ejemplo, el aumento de tamaño de la cabeza y el peso, mayor rendimiento de semilla, color exterior verde mejorado o profundo, tolerancia a la sequía y al calor, así como calidades agronómicas mejoradas.

En la lechuga iceberg, por ejemplo, los rasgos deseados comprenden una cabeza apretada y densa que se asemeja a una col. Las lechugas iceberg son generalmente de sabor suave, proporcionan una textura crujiente y exhiben un interior blanco o amarillo cremoso. Las lechugas batavias son cercanas a la iceberg y se caracterizan por una cabeza más pequeña y menos firme. En relación a la lechuga de cabeza de mantequilla, éstas se caracterizan por una cabeza más pequeña, con una textura mucho más suave, aceitosa y mantecosa. Finalmente, la lechuga romana tiene hojas verticales alargadas y crujientes, formando una cabeza en forma de pan con hojas externas de color verde oscuro.

Aparte de la calidad del cultivo, características agronómicamente importantes tales como, por ejemplo, una buena arquitectura de la planta, alta productividad y resistencias básicas a enfermedades, tales como, pero no limitadas al virus del mosaico de la lechuga (LMV), Nasonovia, áfidos de la raíz, virus amarillo occidental de remolacha (BMYV), virus del mosaico del nabo (TMV) son rasgos adicionales deseados.

En una realización particular de la invención, un gen de resistencia a mildiú velloso ha sido identificado en la lechuga silvestre L. saligna acceso IVT1306(=CGN05315), que confiere resistencia total a todos las razas conocidas hasta la fecha de Bremia. Fue introgresada por el rescate de embriones en L. sativa cultivada. Extensos ensayos de la enfermedad de las plántulas de Bremia en poblaciones F2 y F3 indicaron que la resistencia es provocada por un gen principal (semi)dominante. Esta resistencia derivada de L. saligna ("Ls1") puede combinarse con otras resistencias de Bremia, tales como R17, R18, R36, R38, Dm3, Lv1 o Crapaudine.

Para el desarrollo del marcador "Ls1" se han desarrollado dos poblaciones de BC4F2 (n = 70) y se ha sometido a ensayo la resistencia a Bremia de familias F3 de 70 plantas por línea utilizando diversas cepas de Bremia, tales como Bl20, Bl21, Bl24 y Bl25. BSA Se pudieron identificar tres candidatos marcadores ^sS^rque muestran un polimorfismo específico entre las líneas R y S parentales y F3.

Los genotipos parentales pueden cruzarse entre sí para producir semilla de progenie. Los genotipos parentales pueden ser líneas endogámicas desarrolladas al autofecundar plantas heterocigotas seleccionadas de campos con polinización no controlada o abierta y empleando procedimientos de selección recurrentes. Las plantas superiores son autofecundadas y seleccionadas en generaciones sucesivas. En las generaciones sucesivas la condición heterocigota da paso a líneas homogéneas como resultado de la auto-polinización y selección. Con generaciones sucesivas de endogamia, la planta se vuelve cada vez más homocigota y uniforme dentro de las plantas de la progenie. Típicamente, se pueden practicar de cinco a siete o más generaciones (F1 a F2; F3 a F4; F4 a F5) de autofecundación y selección de pedigrí para obtener líneas endogámicas que sean uniformes en las características de las plantas y semillas y que se mantendrán uniformes bajo la continua auto-fertilización.

Durante la endogamia, muchos alelos indeseables en loci heterocigotos serán reemplazados por alelos más favorables y los alelos desfavorables o no deseados se eliminarán de la progenie. Además, a través de la selección basada en marcadores, se puede maximizar el número de alelos favorables, debido a que se identifican los alelos más desfavorables y se reemplazan sucesivamente por los alelos más favorables.

En un aspecto, la planta de acuerdo con la invención puede obtenerse introgresando el rasgo de resistencia a Bremia de una planta ancestral, particularmente una planta ancestral silvestre en una planta de lechuga cultivada, particularmente una planta de Lactuca sativa, más particularmente una planta de Lactuca sativacultivada.

En una realización específica de la invención, el ancestro salvaje, del cual se puede obtener el rasgo de resistencia a Bremia, es Lactuca saligna, salvaje, particularmente Lactuca saligna IVT1306(=CGN05315), o de una progenie o un ancestro del mismo que comprende dicho locus de rasgo cualitativo. El rasgo de resistencia de acuerdo con la presente invención, que confiere a una planta que expresa este rasgo resistencia a infestaciones con el hongo Bremia lactucase, puede, como alternativa, obtenerse de la línea de Lactuca sativa LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 -1 - 3:1, de la cual la semilla representativa está depositada en el NCIMB bajo el número de acceso NCIMB 41625, o de una progenie o ancestro de la línea LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1 que comprende rasgo de resistencia a Bremia.

Por consiguiente, en una realización específica de la invención, el genotipo parental que contribuye al o a los rasgos de resistencia es una línea endogámica que tiene las propiedades relevantes de la invención de la línea de Lactuca sativa LSA - (1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1 depositada, es decir, sustancialmente la misma arquitectura del genoma en el locus del rasgo cualitativo asociado con la resistencia a Bremia, muestras de semillas de la cual se han depositado el 11 de junio de 2009 ante el NCIMB con el número de acceso NCIMB 41625.

Para determinar la utilidad de la línea endogámica y su potencial para contribuir genéticamente a la progenie híbrida, se realiza una prueba cruzada con otra línea endogámica, y la progenie resultante se evalúa fenotípicamente.

En otra realización específica de la invención, el genotipo parental que contribuye al o a los rasgos de resistencia es un híbrido que tiene las propiedades relevantes de la invención de la línea de Lactuca sativa LSA - (1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1 depositada, es decir, sustancialmente la misma arquitectura del genoma en el locus del rasgo cualitativo asociado con la resistencia a Bremia, muestras de semillas de la cual se han depositado el 11 de junio de 2009 ante el NCIMB con el número de acceso NCIMB 41625.

La línea de Lactuca sativa LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1 resultó de un cruce de Lactuca salignasalvaje de acceso IVT1306 (= CGN05315), como el donante del rasgo de resistencia con una línea endogámica de Lactuca sativa. La progenie resistente a Bremia de este cruce se cruzó con otras líneas endogámicas de diferentes antecedentes genéticos para obtener finalmente la línea de Lactuca sativa LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1.

Por consiguiente, la línea de Lactuca sativa LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1 o cualquier otra línea de planta que contenga el rasgo de resistencia a Bremia se puede utilizar como un material fuente para introgresar dicho rasgo de resistencia en cualquier antecedente genético deseado para obtener una planta de lechuga que sea altamente resistente a las infestaciones con un hongo del género Bremia, más particularmente a las infestaciones con Bremia lactucae, puede contener además, uno o más rasgos deseables, tales como los rasgos de calidad de los cultivos exigidos por el mercado. Aparte de la calidad del cultivo, características agronómicamente importantes, tales como, por ejemplo, una buena arquitectura de la planta, alta productividad y resistencias básicas a patógenos relevantes, tales como el virus del mosaico de la lechuga (LMV), Nasonovia, áfidos de la raíz, virus amarillo occidental de remolacha (BMYV), virus del mosaico del nabo (TMV) son rasgos adicionales deseados.

Basado en la descripción de la presente invención, la persona experta que está en posesión de la línea de Lactuca sativa LSA - (1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1, una muestra de la cual ha sido depositada en NCIMB Ltd bajo el número de acceso NCIMB 41625 o de una progenie o ancestro de la misma que contiene un locus de rasgo cualitativo en el grupo de enlace 8 asociado con resistencia a Bremia, tal como se describe en esta memoria, no tiene dificultad para transferir el rasgo de resistencia a Bremia de la presente invención a otras plantas de lechuga de diversos tipos utilizando técnicas de reproducción bien conocidas en la técnica. El rasgo de la presente invención puede transferirse, por ejemplo, a plantas de lechuga de los siguientes grupos de cultivares: cabeza de manteca, lechuga china, cabeza crujiente (formas iceberg), de hoja suelta, romana, crujiente de verano. Por consiguiente, en una realización, una planta de la presente invención es una planta de L sativa capaz de resistir infestaciones con Bremia, planta que es una planta del grupo de cultivares seleccionado del grupo que consiste en cabeza de mantequilla, lechuga china, cabeza crujiente (formas iceberg), de hoja suelta, romana y verano crujiente. En una realización de la invención, las plantas de lechuga se cultivan para la producción de semillas (híbridas) o de lechuga comercial.

Por consiguiente, en otra realización, la presente invención describe un método para transferir el rasgo de resistencia a Bremia de acuerdo con la presente invención a una planta de lechuga que carece de dicho rasgo, que comprende a) obtener una planta que comprende dicho rasgo; b) cruzarla a una planta que carece de dicho rasgo; c) obtener plantas del cruce de la etapa b); d) seleccionar una planta de la etapa c) que sea capaz de resistir infestaciones con Bremia de acuerdo con la presente invención. En una realización, el método comprende, además, e) retrocruzar una planta resultante de la etapa d) con una planta de lechuga,, y f) seleccionar una planta de lechuga, que sea capaz de resistir infestaciones con Bremia de acuerdo con la presente invención. En una realización, el método comprende, además, obtener una planta de lechuga endogámica, que es capaz de resistir infestaciones con Bremia de acuerdo con la presente invención y, en una realización, el método comprende, además, cruzar dicha planta de lechuga endogámica con otra planta de lechuga para producir un planta de lechuga híbrida, que es capaz de resistir infestaciones con Bremia de acuerdo con la presente invención. En una realización, se selecciona una planta de lechuga determinando la presencia o ausencia del hongo, tal como se describe en esta memoria. En una realización, la planta de la etapa a) que comprende dicho rasgo es la línea de Lactuca sativa LSA - (1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1, cuya semilla representativa está depositada en NCIMB bajo el N° de acceso NCIMB 41625, o una progenie o ancestro de dicha planta.

En determinadas realizaciones de la invención, se utiliza un Ensayo de Resistencia estandarizado, tal como el descrito en el Ejemplo X que figura más adelante, para determinar la presencia o ausencia de resistencia contra Bremia en las plantas de la progenie resultante de uno de los cruces anteriores y para seleccionar esas plantas de la progenie para la reproducción adicional que son resistentes a Bremia.

Como alternativa, la reproducción asistida por marcadores puede emplearse para identificar aquellos individuos que contienen el locus de resistencia a Bremia, y/o los loci de marcadores flanqueantes genéticamente vinculados al mismo, tal como se describe en esta memoria.

La selección basada en marcadores ya puede utilizarse en las fases tempranas del desarrollo endogámico, a menudo en combinación con métodos de rastreo que se basan en gran medida en características fenotípicas que pueden determinarse visualmente y que están relacionadas con índices de rendimiento clave, tales como, por ejemplo, el vigor de la planta, la longitud de entrenudos, las ramificaciones, la resistencia a insectos u hongos, tales como la resistencia a infestaciones de Bremia, resistencias a virus, etc., que son relevantes para la idoneidad de la planta para ser utilizada en la producción comercial de híbridos. La selección también puede basarse en marcadores moleculares, que pueden o no estar vinculados a rasgos de interés.

En particular, la selección basada en marcadores puede aplicarse en combinación con o seguida de una selección fenotípica para identificar aquellos individuos en los que todos los loci relevantes de la invención descritos en esta memoria tienen genotipos homocigotos favorables.

Existen varios tipos de marcadores moleculares que se pueden utilizar en la selección basada en marcadores, que incluyen, pero no se limitan a polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), polimorfismo de longitud de fragmento de restricción amplificada (AFLP), repeticiones de secuencia simple (SSR) y polimorfismos de un solo nucleótido SNP.

El RFLP implica el uso de enzimas de restricción para cortar el ADN cromosómico en sitios de restricción cortos específicos; los polimorfismos resultan de duplicaciones o deleciones entre los sitios o mutaciones en los sitios de restricción.

La RAPD utiliza la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de baja rigurosidad con cebadores únicos de secuencia arbitraria para generar matrices específicas para cepas de fragmentos de ADN anónimos. El método requiere solo pequeñas muestras de ADN y analiza un gran número de loci polimórficos.

El AFLP requiere la digestión de ADN celular con una o más enzimas de restricción antes de utilizar la PCR y los nucleótidos selectivos en los cebadores para amplificar fragmentos específicos. Con este método, utilizando técnicas de electroforesis para visualizar los fragmentos obtenidos, se pueden medir hasta 100 loci polimórficos por combinación de cebador y solo se requiere una pequeña muestra de ADN para cada uno de los ensayos.

El análisis por SSR se basa en secuencias de microsatélites de ADN (repetición corta) que están muy dispersas por todo el genoma de los eucariotas, que se amplifican de forma selectiva para detectar variaciones en repeticiones de secuencias simples. Solo se requieren pequeñas muestras de ADN para un análisis por SSR. Los SNP utilizan ensayos de extensión por PCR que detectan de manera eficiente las mutaciones puntuales. El procedimiento requiere poco ADN por muestra. Uno o dos de los métodos anteriores se pueden utilizar en un programa típico de reproducción basada en marcadores.

El método más preferido para lograr la amplificación de fragmentos de nucleótidos que abarcan una región polimórfica del genoma de la planta emplea la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 273 (1986 )), utilizando pares de cebadores que incluyen un cebador directo y un cebador inverso que son capaces de hibridar con las secuencias proximales que definen un polimorfismo en su forma de doble cadena.

Se pueden emplear métodos alternativos para amplificar fragmentos, tales como la "Reacción en Cadena de la Ligasa" ("LCR") (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:189 193 (1991)), que utiliza dos pares de sondas de oligonucleótidos para amplificar exponencialmente una diana específica. Las secuencias de cada uno de los pares de oligonucleótidos se seleccionan para permitir que el par se hibride con secuencias adyacentes de la misma cadena de la diana. Una hibridación de este tipo forma un sustrato para una ligasa dependiente del molde. Al igual que con la PCR, los productos resultantes sirven así como un molde en ciclos subsiguientes y se obtiene una amplificación exponencial de la secuencia deseada.

La LCR se puede realizar con oligonucleótidos que tienen las secuencias proximal y distal de la misma cadena de un sitio polimórfico. En una realización, cualquiera de los oligonucleótidos se diseñará para que incluya el sitio polimórfico real del polimorfismo. En una realización de este tipo, las condiciones de reacción se seleccionan de manera que los oligonucleótidos pueden ligarse juntos solo si la molécula diana contiene o carece del nucleótido específico que es complementario del sitio polimórfico presente en el oligonucleótido. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden seleccionarse de manera que no incluyan el sitio polimórfico (véase, Segev, Solicitud PCT WO 90/01069).

Un método adicional que puede emplearse alternativamente es el "Ensayo de ligamiento de oligonucleótidos" ("OLA") (Landegren et al., Science 241:1077 1080 (1988)). El protocolo OLA utiliza dos oligonucleótidos que están diseñados para ser capaces de hibridarse con secuencias adyacentes de una sola cadena de una diana. La OLA, al igual que la LCR, es particularmente adecuada para la detección de mutaciones puntuales. Sin embargo, a diferencia de la LCR, la OLA da como resultado una amplificación "lineal" en lugar de exponencial de la secuencia diana.

Aún otro método que puede emplear alternativamente es el "Ensayo invasor" que utiliza una endonucleasa flap específica para la estructura (FEN) para escindir un complejo tridimensional formado por la hibridación de oligonucleótidos solapantes específicos para el alelo para un ADN diana que contiene un sitio de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). La reasociación del oligonucleótido complementario al alelo de SNP en la molécula diana desencadena la escisión del oligonucleótido por escisión, una FEN termoestable. La escisión puede ser detectada por varios enfoques diferentes. Lo más comúnmente, el producto de escisión desencadena una reacción de escisión secundaria en un casete de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) para liberar una señal fluorescente. Alternativamente, la escisión se puede detectar directamente mediante el uso de sondas de polarización de fluorescencia (FP), o por espectrometría de masas. La reacción de escisión invasiva es altamente específica, tiene una tasa de fracaso baja y puede detectar cantidades de zeptomol de ADN diana. Mientras que el ensayo se ha utilizado tradicionalmente para interrogar a un SNP en una muestra por reacción, se han sometido a ensayo nuevos enfoques basados en chips o perlas para hacer que este ensayo eficiente y preciso sea adaptable a la multiplexación y al genotipado de SNP de alto rendimiento.

Nickerson et al. han descrito un ensayo de detección de ácido nucleico que combina atributos de PCR y OLA (Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.). 87:89238927 (1990)). En este método, la PCR se utiliza para lograr la amplificación exponencial del ADN diana, que luego se detecta utilizando OLA.

También se conocen esquemas basados en el ligamiento de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de un ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, amplificando con ello el di-oligonucleótido (Wu et al., Genomics 4:560569 (1989)), y puede adaptarse fácilmente a los propósitos de la presente invención.

En una realización, un marcador molecular es un fragmento de ADN amplificado por PCR, p. ej., un marcador de SSR o un marcador de RAPD. En una realización, la presencia o ausencia de un fragmento de ADN amplificado es indicativa de la presencia o ausencia del rasgo en sí mismo o de un alelo particular del rasgo. En una realización, una diferencia en la longitud de un fragmento de ADN amplificado es indicativa de la presencia de un alelo particular de un rasgo y, por lo tanto, permite distinguir entre diferentes alelos de un rasgo.

En una realización específica de la invención, los marcadores de repetición de secuencia simple (SSR) se utilizan para identificar alelos relevantes para la invención en las plantas parentales y/o sus ancestros, así como en las plantas de la progenie que resultan de un cruce de dichas plantas parentales. Las repeticiones de secuencias simples son secuencias de ADN cortas y repetidas, y están presentes en los genomas de todos los eucariotas y consisten en varias a más de cien repeticiones de un motivo de nucleótido dado. Dado que el número de repeticiones presentes en una ubicación particular en el genoma a menudo difiere entre las plantas, las SSR pueden analizarse para determinar la ausencia o presencia de alelos específicos.

En otra realización de la invención, los marcadores de SNP de la invención se utilizan para identificar alelos relevantes para la invención en las plantas parentales y/o sus ancestros, así como en las plantas de la progenie que resultan de un cruce de dichas plantas parentales.

En la presente invención, se puede utilizar un marcador o un conjunto de dos o más marcadores que comprenden un par de cebadores oligonucleotídicos de PCR que consisten en un cebador directo y un cebador inverso seleccionado del grupo del par de cebadores 1 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 2 y par de cebadores 2 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 4, cuyos cebadores conducen a un producto de amplificación en una reacción PCR que exhibe un peso molecular o una secuencia de nucleótidos, que es esencialmente idéntica o puede considerarse como un alelo al de un producto de amplificación de PCR correspondiente obtenible de la línea de Lactuca sativa LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1 en una reacción PCR con el o los pares de cebadores idénticos.

En una primera etapa, muestras de ADN o ADNc se obtienen a partir de material vegetal adecuado, tal como tejido foliar, extrayendo ADN o ARN utilizando técnicas conocidas. Los cebadores que flanquean una región que contiene SSRs dentro del locus de rasgos cualitativos relevantes para la invención descritos antes en esta memoria o dentro de una región vinculada al mismo, se utilizan luego para amplificar la muestra de ADN utilizando el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocido por los expertos en la técnica.

Básicamente, el método de amplificación por PCR implica el uso de un cebador o un par de cebadores que comprenden dos secuencias de cebadores oligonucleotídicos cortas que flanquean el segmento de ADN a amplificar o secuencias de adaptador ligadas a dicho segmento de ADN. Ciclos repetidos de calentamiento y desnaturalización del ADN son seguidos por la reasociación de los cebadores a sus secuencias complementarias a bajas temperaturas, y la extensión de los cebadores reasociados con ADN polimerasa. Los cebadores se hibridan a cadenas opuestas de las secuencias diana de ADN. La hibridación se refiere a la reasociación de las cadenas de ADN complementarias, en que complementaria se refiere a la secuencia de los nucleótidos, de manera que los nucleótidos de una cadena pueden unirse con los nucleótidos en la cadena opuesta para formar estructuras de doble cadena. Los cebadores están orientados de modo que la síntesis de ADN por la polimerasa se realiza de manera bidireccional a través de la secuencia de nucleótidos entre los cebadores. Este procedimiento duplica de manera efectiva la cantidad de ese segmento de ADN en un ciclo. Debido a que los productos de la PCR son complementarios y capaces de unirse a los cebadores, cada uno de los ciclos sucesivos duplica la cantidad de ADN sintetizado en el ciclo precedente. El resultado de este procedimiento es la acumulación exponencial de un fragmento diana específico, que es aproximadamente 2 <n>, en que n es el número de ciclos.

A través de la amplificación por PCR, se hacen millones de copias del segmento de ADN flanqueado por los cebadores. Las diferencias en el número de secuencias repetidas o inserciones o deleciones en la región que flanquea dichas repeticiones, que se encuentran entre los cebadores flanqueantes en diferentes alelos, se reflejan en variaciones de longitud de los fragmentos de ADN amplificados. Estas variaciones pueden detectarse, por ejemplo, separando electroforéticamente los fragmentos de ADN amplificados en geles o utilizando un secuenciador capilar. Al analizar el gel o perfil, se puede determinar si la planta contiene el alelo deseado en un estado homocigoto o heterocigoto o si el alelo deseado o no deseado está ausente del genoma de la planta.

En la alternativa, la presencia o ausencia del alelo deseado se puede determinar mediante PCR en tiempo real utilizando colorantes de ADN de doble cadena o el método de la sonda informadora fluorescente.

El análisis de marcadores se puede hacer temprano en el desarrollo de la planta utilizando muestras de ADN extraídas del tejido foliar de plantas muy jóvenes o de semillas. Esto permite identificar plantas con una composición genética deseable temprano en el ciclo de reproducción y descartar plantas que no contienen los alelos deseados relevantes para la invención antes de la polinización, reduciendo así el tamaño de la población reproductora y reduciendo los requisitos de fenotipado.

Además, mediante el uso de marcadores moleculares se puede hacer una distinción entre plantas homocigóticas que llevan dos copias del alelo deseado relevante para la invención en el locus cualitativo de resistencia a Bremia y plantas heterocigotas que llevan solo una copia y plantas que no contienen copia alguna del o de los alelos favorables.

Por lo tanto, se pueden desarrollar marcadores alternativos por métodos conocidos por el experto en la técnica y se utilizan para identificar y seleccionar plantas con un alelo o un conjunto de alelos de un locus o loci de rasgo cualitativo de acuerdo con la presente invención y como se describe en esta memoria anteriormente.

Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos del producto de amplificación obtenido en la amplificación por PCR utilizando un par de cebadores oligonucleotídicos de PCR que consisten en un cebador directo y un cebador inverso seleccionados del grupo del par de cebadores 1 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 2 y par de cebadores 2 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 4 se pueden obtener por los expertos en la técnica y nuevos cebadores o pares de cebadores y diseñados en base a la secuencia de nucleótidos recientemente determinada del producto de amplificación por PCR. Además, los marcadores de acuerdo con la invención y descritos anteriormente en esta memoria podrían colocarse en un mapa genético de lechuga u otras especies, en particular especies de la familia Asteraceae, y podrían utilizarse marcadores de mapeo conocidos en la misma región o en regiones homólogas u ortólogas como punto de partida para desarrollar nuevos marcadores.

Por consiguiente, los marcadores específicamente descritos en la presente invención también pueden utilizarse en la identificación y/o el desarrollo de marcadores nuevos o adicionales asociados con el locus cualitativo de resistencia a Bremia, que a su vez puede utilizarse en la reproducción asistida por marcadores y/o la búsqueda de recombinantes que flanquean el locus de resistencia a Bremia y/o el mapeo de precisión y/o la clonación del locus cualitativo de resistencia a Bremia.

Existen varios métodos o enfoques disponibles, conocidos por los expertos en la técnica, que se pueden utilizar para identificar y/o desarrollar marcadores en desequilibrio de enlace y/o ligados a y/o localizados en la región de interés, así como marcadores que representan las mutaciones causales reales que subyacen al rasgo cualitativo. Sin ser completamente exhaustivos, algunos enfoques, conocidos por los expertos en la materia, incluyen:

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques de hibridación para identificar otra secuencia en la región de interés: secuencias de cebadores tal como se describen en esta memoria y/o secuencias de marcadores/genes (o parte de los mismos) que se pueden determinar utilizando las secuencias de cebadores tal como se describen en esta memoria se pueden utilizar como sondas (de hibridación) para aislar secuencias/genes de ácidos nucleicos que flanquean los marcadores y/o que están ligados y/o asociados y/o son específicos para el locus de resistencia a Bremia de una muestra de ácido nucleico genómico y/o muestra o conjunto de muestras de ARN o ADNc (por ejemplo, rastreo de recursos genómicos tales como colecciones de BAC o rastreo de colecciones de ADNg o ADNc).

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques de PCR para identificar otra secuencia en la región de interés: secuencias de cebadores tal como se describen en esta memoria y/o secuencias de genes marcadores/(candidatos) (o parte de las mismas) que pueden determinarse utilizando las secuencias de cebadores tal como se describen puede utilizarse como cebadores de amplificación (PCR) para amplificar una secuencia de ácidos nucleicos/gen que flanquea y/o está ligada y/o asociada con y/o es específica para la región del locus de resistencia a Bremia de una muestra de ácido nucleico genómico y/o muestra de ^aRⁿo ADNc o conjunto de muestras aisladas o no de un tejido vegetal específico y/o después de un tratamiento específico de la planta y de pimiento o, en principio, de cualquier otro organismo con homología suficiente.

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques de PCR para identificar otra secuencia en la región de interés: las secuencias de nucleótidos/genes de uno o más marcadores pueden determinarse después de que los cebadores internos para dichas secuencias de marcadores puedan diseñarse y utilizarse para determinar adicionalmente el flanqueo adicional de secuencia/genes dentro de la región del locus de resistencia a Bremia y/o genéticamente ligados y/o asociados con el rasgo.

- uso de secuencias/marcadores descritos en el mapeo y/o enfoques de mapeo comparativos para identificar marcadores en la misma región o las mismas regiones (posicionamiento del locus de resistencia a Bremia en otros mapas): basado en la información de posición y/o información de marcador tal como se describe en esta memoria, los marcadores, de cualquier tipo, pueden identificarse mediante enfoques de mapeo genético, finalmente (si ya es necesario) mediante el posicionamiento de los marcadores descritos (mediante mapeo genético o extrapolación basada en marcadores comunes a través de mapas) en uno o más mapas genéticos (de alta densidad), y/o mapa o mapas genéticos o de consenso integrados. Los marcadores ya conocidos y/o nuevos marcadores genéticamente ligados y/o posicionados en la vecindad de los marcadores descritos y/o la región del locus de resistencia a Bremia pueden identificarse y/u obtenerse y finalmente utilizarse en el mapeo (de precisión) y/o la clonación del locus de resistencia a Bremia y/o aplicaciones de reproducción MAS.

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques 'in-siloco' para identificar secuencias/marcadores/genes (candidatos) adicionales: Secuencias de cebadores tal como se describen en esta memoria y/o secuencias de marcadores/genes (candidatos) (o parte de las mismas) que pueden determinarse utilizando las secuencias de cebadores tal como se describen en esta memoria o basados en marcadores vinculados pueden utilizarse en métodos 'in-silico' para buscar bases de datos de secuencias o proteínas (p. ej., BLAST) para secuencias/genes flanqueantes y/u homólogos (adicionales) y/o diversidad alélica (tanto secuencias genómicas y/o de ADNc o incluso proteínas y ambas originadas a partir del pimiento y/o cualquier otro organismo) genéticamente vinculadas y/o asociadas con los rasgos tal como se describen en esta memoria y/o ubicados en la región del locus de resistencia a Bremia.

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques de mapeo físicos (posicionamiento del locus de resistencia a Bremia en el mapa físico o secuencia del genoma): secuencias de cebadores tal como se describe en esta memoria y/o secuencias de marcadores/genes (o parte de los mismos) que pueden ser determinadas utilizando las secuencias de cebador que se describen en esta memoria o utilizando otros marcadores genéticamente vinculados a los marcadores descritos en esta memoria y/o ubicados en la región del locus de resistencia a Bremia se pueden disponer en un mapa físico y/o secuencia del genoma (completo) en principio de cualquier organismo con homología suficiente para identificar secuencias/marcadores/genes (candidatos) aplicables en (el mapeo de precisión) y/o la clonación del locus de resistencia a Bremia y/o aplicaciones de reproducción MAS.

- uso de secuencias/marcadores descritos para disponer el locus de resistencia a Bremia en otros mapas (físicos) o genomas (a través de especies. para lechuga se pueden utilizar otras especies de Asteraceae como especies modelo): secuencias de cebadores tal como se describen en esta memoria y/o las secuencias de marcadores/genes (o parte de las mismas) que se pueden determinar utilizando las secuencias de cebadores tal como se describen en esta memoria se pueden utilizar en enfoques de mapeo de genoma o sinteína comparativos para identificar regiones homólogas y secuencias homólogas y/u ortólogas/genes (candidatos) genéticamente vinculados y/o dispuestos en la región del locus de resistencia a Bremia y aplicable en (el mapeo de precisión) y/o la clonación del locus de resistencia a Bremia y/o aplicaciones de reproducción MAS.

- uso de secuencias/marcadores descritos para seleccionar los individuos apropiados que permiten la identificación de marcadores en la región de interés mediante enfoques genéticos: las secuencias de cebadores y/o marcadores tal como se describen en esta memoria pueden utilizarse para seleccionar individuos con alelos diferentes/contrastantes que, por ejemplo, en enfoques de asociación genética y/o el análisis de segregantes en bruto (BSA, Michelmore et al., PⁿA^s, 88, 9828-9832, 1991) se pueden utilizar para identificar marcadores/genes en la región específica de interés y/o asociados o genéticamente vinculados a los rasgos descritos.

- uso de la información descrita para buscar genes candidatos (posicionales): la información descrita puede utilizarse para identificar genes candidatos posicionales y/o funcionales que pueden estar asociados con los rasgos descritos y/o vinculados genéticamente.

Para el genotipado, el mapeo o el mapeo de asociación, el ADN se extrae de material vegetal adecuado, tal como, por ejemplo, el tejido de la hoja. En particular, se recogen grandes cantidades de hojas de una pluralidad de plantas. Muestras de ADN se genotipan utilizando una pluralidad de SSRs, SNPs polimórficos, o cualquier otro tipo de marcador adecuado que cubre la totalidad del genoma de la lechuga.

El análisis conjunto de datos genotípicos y fenotípicos se puede realizar utilizando un software estándar conocido por los expertos en la técnica. Las introducciones de plantas y el germoplasma pueden seleccionarse para los alelos en el correspondiente locus de resistencia a Bremia descrito en esta memoria, en base a la o las secuencias de nucleótidos del o de los marcadores en el locus/los loci de marcadores vinculados a dicho locus de resistencia a Bremia o cualquier otro marcador conocido a ser ubicado en el cromosoma 8, y el peso molecular del o de los alelos utilizando una o más de las técnicas descritas en esta memoria o conocidas por los expertos en la técnica.

La secuencia de ácidos nucleicos de los marcadores, los marcadores vinculados o el locus de resistencia a Bremia descritos en esta memoria puede determinarse por métodos conocidos por la persona experta. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende dicho locus de resistencia a Bremia o una parte del mismo que confiere resistencia puede aislarse de una planta donante resistente a Bremia fragmentando el genoma de dicha planta y seleccionando aquellos fragmentos que albergan uno o más marcadores indicativos de dicho locus de resistencia a Bremia. Posterior o alternativamente, las secuencias marcadoras (o partes de las mismas) indicativas de dicho locus de resistencia pueden utilizarse como cebadores de amplificación (PCR), con el fin de amplificar (a) secuencia(s) de ácidos nucleicos que comprende(n) dicho locus de resistencia a partir de una muestra de ácido nucleico genómico o un fragmento de genoma obtenido de dicha planta. La secuencia de nucleótidos del locus de resistencia a Bremia, y/o de cualquier marcador adicional comprendido en el mismo, se puede obtener mediante métodos de secuenciación estándar.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada (preferiblemente ADN pero no limitada a ADN) que comprende un locus de resistencia a Bremia de la presente invención, o una parte del mismo que confiere resistencia. Por lo tanto, los marcadores descritos pueden utilizarse para la identificación y el aislamiento de uno o más marcadores o genes de lechuga u otros cultivos vegetales, particularmente cultivos de Asteraceae que están vinculados o codifican resistencia a Bremia.

La secuencia de nucleótidos de marcadores adicionales vinculados al locus de resistencia a Bremia de la presente invención puede, por ejemplo, también resolverse determinando la secuencia de nucleótidos de uno o más marcadores asociados con el locus de resistencia a Bremia y diseñando cebadores para dichas secuencias de marcadores que luego pueden utilizarse para determinar adicionalmente la secuencia fuera de dicha secuencia de marcador. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de los marcadores de SSR descritos en esta memoria o cualquier otro marcador predicho en la región del locus de resistencia a Bremia y/o vinculado a dicha región puede obtenerse secuenciando el producto de amplificación por PCR de dichos marcadores mediante métodos bien conocidos en la técnica. O, alternativamente, utilizando las secuencias de marcadores en una PCR o como sondas de hibridación para identificar secuencias de nucleótidos vinculadas mediante, por ejemplo, pero no limitadas a la detección de bAc .

La presente invención se describe adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Material y Métodos

1.1 Materiales

- Se han desarrollado dos poblaciones segregantes F2 y la correspondiente F3 para el gen de resistencia a Bremia Ls1 para el desarrollo de marcadores mediados por BSA (poblaciones 3043 = línea S [Winnie] * línea R [LSA-1306-158xK175 / 13xAng-2-45 ) 1: 3-2] y población 3045 = línea S [ Kristo ] * línea R [(Kris / B28-1-19xB06 / SAT-79-6) -1-1: 2]).

- Secuencias de marcadores candidatos de SSRs NL0918, NL0920 y NL0222, que fueron identificadas por SSR-BSA y mapeadas a genes de resistencia a Bremia Ls1 en el grupo de enlace 8 del mapa de referencia de lechuga L. sativa x L. serriola RIL.

- Se obtuvieron secuencias de dos clones EST LE0178 y LK1463 de la colección EST de UC Davis: Estos 2 EST están ubicados en la misma región que el gen Ls1 y los 3 marcadores de SSR vinculados en el grupo de enlace 8.

1.2 Desarrollo del ensayo

Todo el ADN de la planta se aisló según el protocolo de Acetato de potasio Proteinasa K.

Para la secuenciación alélica se diseñaron hasta 3 combinaciones diferentes de cebadores de PCR en los extremos 5' y 3' de SSRs y ESTs vinculados. Los fragmentos de PCR y las secuencias de ADN de estos 5 marcadores potenciales se obtuvieron utilizando líneas de un panel de líneas resistentes y susceptibles.

El desarrollo del ensayo Taqman EPR se basó en los SNPs específicos para alelos descubiertos del panel de secuencia. El desarrollo del ensayo EPR se realizó de acuerdo con las directrices estándar, incluidas el ensayo de diferentes mezclas de PCR, concentraciones de ADN y temperaturas de reasociación. Las sondas son sondas Taqman FAM y VIC MGB (Eurogentec)

1.3 Protocolos de Ensayo

1.3.1 Protocolo PCR

1. Aislar ADN genómico con extracción de ADN estándar. Protocolo de Acetato de potasio Proteinasa K.

Finalmente, se obtuvieron 150 pl de solución de ADN.

2. Diluir el ADN del molde a 1/30;

3. Pipetear 4pl de cada una de las muestras de ADN diluidas en pocillos individuales.

4. Cubrir y centrifugar la placa y colocar en hielo;

5. Preparar la mezcla madre. Lo siguiente es por reacción.

1.3.2 Ensayo Taqman EPR

Las sondas marcadas por fluorescencia MGB se pueden adquirir de ABI. La amplificación por PCR se realiza utilizando la siguiente mezcla de reacción -Protocolo SIGMA

Protocolo AmpliTaq Gold

6. Añadir 6^l de mezcla madre a cada una de las muestras de ADN (todo, excepto el ADN del molde).

7. Centrifugar brevemente;

8. Cargar la placa en la máquina de PCR.

9. Programa PCR en formato de placa ABI GENEAMP PCR 9700- 384 como sigue:

2 min 94°C

5 min 72°C

Los resultados de SNP se leyeron en un ABI7900.

10. Leer la placa en ABI7900.

1.4 Panel de verificación

La verificación se realizó en:

(i) Panel de verificación específico que consiste en 29 genotipos (13 resistentes fijos, 15 susceptibles y 1 línea de segregación).

(ii) 96 genotipos susceptibles (cultivares)

1.5 Ensayo de enfermedad

Los ensayos se realizan en una cámara climática con alta humedad. La duración del día es de 16 horas y durante el día la temperatura es de 18°C y la RH es de aproximadamente 85%. Durante la noche la temperatura es de 15°C y la RH ronda el 100%. Antes de la inoculación de un ensayo, las esporas del patógeno Bremia se multiplican en variedades susceptibles. La elección de una variedad susceptible para un aislado de Bremia se realiza a partir del conjunto oficial de huéspedes diferenciales y de un conjunto interno. El ensayo de la enfermedad para la resistencia a Bremia se realizó utilizando diversas cepas de Bremia o aislados tales como Bl20, Bl21, Bl24 y Bl25.

Los aislados de Bremia se caracterizan y clasifican de acuerdo con el código SEXTET por IBEB (International Bremia Evaluation Board).

Antes de la inoculación del material de ensayo los autores de la invención recolectaron las hojas con esporas y lavaron las esporas de las hojas con agua. La concentración de la suspensión de esporas se ajusta a 100.000 esporas por ml. La suspensión de esporas se rocía sobre plantas de 1 semana de edad (en los cotiledones). 7 a 10 días después de la inoculación se puede hacer la observación/selección. En general, los cotiledones de las plantas susceptibles están completamente cubiertos de esporas. Dependiendo del aislado de Bremia utilizado, los cotiledones de las plantas resistentes no mostrarán nada o un poco de necrosis sin o con muy escasa esporulación.

Ejemplo 2: Breve Historia de Reproducción del cv. (LSA-1306/SATxSAT)-37-1-3:1-Femenino Masculino

LSA-1306 ..... x.................SATIVA 1996

F1... x..... SATIVA 1997

I BC1 F1 1998

1

BC1 F2 1999 252 selecciones de plantas individuales

1

BC1 F3 2000 453 selecciones de plantas individuales

1

BC1 F4 2001 113 selecciones de plantas individuales

1 ▼

BC1 F5 2002 Selección de la línea de reproducción

(LSA-1306/SATXSAT)-37 -1-3:1 -La línea de reproducción (LSA-1306 / SATXSAT) -37-1-3: 1- se originó en 1996 como resultado de un cruce de LSA-1306 = IVT1306 con una planta de Lactuca sativa. El objetivo era obtener una línea de reproducción que combinara rasgos agronómicos y resistencia al mildiu velloso procedente de IVT1306 como donante para extender la reproducción a todos los segmentos principales (lechuga romana, iceberg, Batavia, hoja de roble y cabeza de mantequilla).

Antes de comenzar la selección de pedigrí en 1998, se realizó un primer ciclo de retrocruzamiento para introducir el factor de resistencia a Bremia de IVT1306 (= CGN05315: Lactuca saligna silvestre originaria de Israel. Instituto Donante: Instituut voor de Veredeling van Tuinbouwgewassen, Wageningen, Países Bajos) que brinda resistencia a todas las razas oficiales de Bremia hasta la fecha publicada por IBEB.

La semilla BC1F2 se plantó en 1999 y las plántulas se inocularon con Bremia y las plantas resistentes se multiplicaron a ciegas para pasar a F3.

La semilla de BC1F3 se recolectó individualmente de las selecciones de plantas de BC1F2 en 2000. Cada F3 se sembró y se inoculó nuevamente con Bremia. Solo se continuó con las líneas F3 homocigotas para la resistencia. Las selecciones en estos F3 homocigóticos se realizaron en términos del mejor valor agronómico que se muestra en el campo abierto.

Las selecciones en BC1F4 se realizaron en 2001 en campo abierto de acuerdo con los mejores rasgos agronómicos en F3 homocigoto resistente.

El BC1F5 más uniforme que combina los rasgos agronómicos deseables y la resistencia a Bremia se seleccionó en 2002.

El método de reproducción empleado fue la selección de pedigrí, utilizando prácticas de selección de plantas individuales y de selección en masa.

Ejemplo 3: identificación del candidato a marcador

El SSR-BSA estándar se realizó utilizando 400 SSRs polimórficos amplificables: los lotes de BSA resistentes y susceptibles individuales consistían en 8 líneas F3 con cuatro individuos agrupados/línea obtenida de las 2 poblaciones de desarrollo de marcadores 3043 y 3045. Se identificaron dos SSRs (NL0918 y NL0920), que están vinculados al gen de resistencia Ls1. El enlace se confirmó sometiendo a ensayo plantas individuales de miembros a granel F3.

El genotipado de las poblaciones F2 "madre» 3043 y 3045 correspondientes mostró un enlace perfecto (0 cM) con las plantas F2 fijas (R y S) y hasta un 80% de enlace con plantas F2 heterocigotas (de las cuales las líneas F3 derivadas se segregan por resistencia). Una correlación más baja en plantas heterocigotas se puede explicar, en parte, por ensayos de enfermedad de Bremia menos fiables en la segregación de poblaciones F3, ya que otros genes de resistencia a Dm en el fondo perturban el fenotipado adecuado de Bremia. El ensayo renovado de Bremia F3 utilizando 4 razas Bremia específicas diferentes, tales como Bl20, Bl21, Bl24 y Bl25 confirman un estrecho enlace de 1-2 cM.

RR, SS y HR describe el genotipo del gen de resistencia (resistente a homocigotos, susceptible a homocigotos y resistente a heterocigotos, respectivamente), mientras que R, S e I describían las observaciones del ensayo de enfermedad (resistentes, susceptibles y resistentes intermedias, respectivamente).

Al someter a ensayo el panel de verificación específico con estos 3 SSRs en el secuenciador fluorescente de poliacrilamida ABI7330, se obtuvieron alelos únicos para todas las líneas resistentes (véase la tabla 2). Estos "alelos R" nunca están presentes en las líneas susceptibles sometidas a ensayo que muestran diferentes alelos únicos. Estos datos de verificación (extendidos con 96 líneas susceptibles) demuestran claramente que estos 3 marcadores de SSR muestran especificidad de alelos R y S, lo que potencialmente permite el desarrollo de marcadores Taqman co-dominantes generalmente aplicables en el germoplasma de lechuga.

Se confirmó que el enlace mutuo cercano de los dos SSRs (NL0918 y NL0920) estaba dentro de 2 cM en el grupo de enlace 8 mediante mapeo con líneas RIL del L. sativa cv. Salinas * L. serriola UC23US población de referencia pública. Esto sitúa el gen de resistencia a Bremia Ls1 en el grupo de enlace 8.

Se utilizaron secuencias de los 2 marcadores candidatos de SSR y 2 ESTs vinculados para el Desarrollo del Ensayo para el desarrollo del marcador Taqman co-dominante.

Tabla 1 Secuencia de Cebadores para Marcadores de SSR

Tabla 2: Tamaño de diferentes alelos de NL0918 y NL920

Ejemplo 4: Desarrollo del ensayo

Utilizando líneas 4 R y 4 S del panel de verificación específico, los alelos SSR han sido secuenciados, lo que resulta en haplotipos alélicos basados en patrones observados de SNP.

SSR NL0920:

Las líneas R muestran 1 haplotipo (A), mientras que las líneas S muestran 2 haplotipos: Se han desarrollado dos ensayos Taqman basados en SNP 305 # y 430.

SSR NL0918:

Las líneas R muestran 1 haplotipo (A), así como las líneas S (B): se han desarrollado dos ensayos Taqman basados en los SNPs n°s 217 y 272. No se pudo obtener una amplificación específica con SNP 217; sin embargo, el marcador Taqman basado en SNP 272 muestra una correlación perfecta con un panel de verificación específico. Ejemplo 5: Verificación y ensayo de Robustez

Dos marcadores Taqman desarrollados co-dominantes de los dos SSRs NL0918 y NL0920 fueron verificadas en cuanto a la correlación con líneas de reproducción fenotipadas.

SSR NL0918:

Para SSR NL0918, el marcador Taqman basado en SNP n° 217 no mostró correlación con las líneas en el panel de verificación tanto global como específico. Sin embargo, el marcador Taqman basado en SNP n° 272 muestra una correlación completa con los fenotipos de todas las líneas.

El ensayo del protocolo Taqman de NL0918 mostró una separación discriminativa y una clasificación de los 3 genotipos observados, homocigotos resistentes, heterocigotos y homocigotos susceptibles (datos no mostrados). SSR NL0920:

Para SSR NL0920, los marcadores Taqman basados tanto en SNP n° 305 como 430 muestran una correlación completa con los fenotipos de todas las líneas.

El ensayo del protocolo Taqman demostró que SNP n° 430 proporciona una separación discriminativa y la clasificación de los 3 genotipos observados, homocigotos resistentes, heterocigotos y homocigotos susceptibles. • Se han desarrollado dos marcadores de PCR Taqman co-dominantes derivados de SSR-BSA para la selección diagnóstica del locus de lechuga Ls1 de resistencia a Bremia.

• Los marcadores discriminan el alelo Ls1 susceptible del alelo LS1 resistente, basándose en una mutación SNP específica en ambos marcadores.

• Los marcadores muestran una correlación perfecta con los fenotipos de las líneas (líneas Ls1 resistentes y susceptibles) y el panel global.

Ejemplo 6:_____ Lectura de Punto Final co-dominante (EPR) de lechuga Ls1 de resistencia a Bremia

Se identificaron tres SNPs, SNP-A, SNP-B y SNP-C, mediante análisis segregante a granel como segregantes con el locus de resistencia. Materiales a granel fueron seleccionados por los resultados del rastreo con múltiples aislados de Bremia, tales como Bl20, Bl21, Bl24 y Bl25,, sometidos a ensayo en familias F3 derivadas por autofecundación de plantas F2 individuales de una planta F1 de un cruce entre la fuente de resistencia y Cobham Green, una línea con resistencia a Bremia no conocida. Se determinó un vínculo estrecho entre SNP-A y el locus de resistencia y/o entre SNP-B y el locus de resistencia (en el mejor de los casos, 0,6 cM, pero no más de 5 cM ) en tres poblaciones F3 independientes que segregan en cuanto a la resistencia.

La siguiente tabla indica los cebadores y las sondas para los marcadores de SSR y SNP:

Ejemplo 7: Desarrollo de Línea

La resistencia de Lactuca saligna está vinculada a varios rasgos no deseados, tales como plantas pequeñas, hojas de espesor de craqueo, hojas de color demasiado oscuro. Al cruzar Lactuca saligna con Lactuca sativa, el gen se transfiere a Lactuca sativa (lechuga normal). Por retrocruzamiento con Lactuca sativa y selecciones posteriores en el campo se rompió el enlace entre estos genes no deseados y el gen de resistencia.

Cruces y retrocruces con L sativa mostrando introgresión del rasgo desde la fuente hacia la L sativa diana.

Se han desarrollado diversas variedades de Lactuca sativa que muestran introgresión del alelo resistente de Ls1 de L. saligna.

Depósito:

La siguiente muestra de semillas de la línea de Lactuca sativa line LSA - (1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1 fue depositada en NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Escocia, RU el 11 de junio de 2009 en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest a nombre de Syngenta Participations AG:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un marcador de ADN que está vinculado al locus de resistencia a Bremia lactucae y puede ser amplificado en una reacción PCR con un par de cebadores oligonucleótídicos de PCR seleccionados de

e. par de cebadores 5 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 10

2. Uso del marcador de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 para identificar en una planta la presencia del locus de resistencia a Bremia lactucae y/o para controlar la introgresión del locus de resistencia de la lechuga a Bremia lactucae en Lactuca sativa.

3. Polinucleótido obtenible en una reacción de PCR por amplificación de un fragmento de ADN con un par de cebadores oligonucleotídicos de PCR seleccionados de

e. par de cebadores 5 representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 10,

producto de amplificación corresponde a un producto de amplificación obtenible de la línea de Lactuca sativa LSA -(1306/SAT x SAT) - 37 - 1 - 3:1, cuya semilla representativa está depositada en NCIMB bajo el N° de Acceso NCIMB 41625, en una reacción PCR con cebadores o pares de cebadores idénticos, con la condición de que el locus marcador respectivo siga estando presente en dicha planta de Lactuca sativa.