ES2928778T3 - Lactuca Sativa (lechuga) con resistencia a Bremia Lactucae (Mildiu de la vid) - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una planta Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae, caracterizada porque el locus de resistencia a Bremia está ligado a un determinante genético y obtenible a partir del genoma de una planta Lactuca silvestre, preferentemente a partir del genoma de Lactuca serriola. La presente invención también se refiere a semillas y otros materiales vegetales que se pueden obtener de esta planta, así como a un método para obtener dicha planta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Lactuca Sativa (lechuga) con resistencia a Bremia Lactucae (Mildiu de la vid)

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la reproducción de plantas y, más específicamente, al desarrollo de lechugas resistentes al mildiu de la vid que tienen características agronómicas de élite.

Antecedentes

La lechuga cultivada, Lactuca sativa, es una planta de clima templado anual o bienal que se cultiva con mayor frecuencia como una verdura de hoja. La lechuga pertenece a la familia Asteraceae del aster o girasol. Otros miembros de esta familia incluyen la endibia, la achicoria, la alcachofa, el girasol y el cártamo. Está estrechamente relacionado con la lechuga nativa común o lechuga espinosa (L. serriola) y menos estrechamente relacionado con otras dos lechugas nativas (L. saligna y L. virosa). La lechuga cultivada y el girasol son los miembros genéticamente caracterizados de esta familia. Cuatro tipos principales de lechuga cultivada incluyen crisphead (principalmente iceberg), romana (cos), leaf y butterhead. Cada uno de estos grupos básicos está compuesto por numerosos cultivares, cada uno caracterizado por su propia morfología particular, adaptaciones culturales y resistencia a enfermedades. Los cultivares de lechuga pueden mostrar una serie de enfermedades causadas por el Mildiu de la vid, Sclerotinia Rot, Botrytis Rot, Corky Root Rot, Mancha foliar bacteriana de la lechuga, causada por Xanthomonas campestris pv. vitians y el virus del mosaico de la lechuga, entre otros. Entre las enfermedades fúngicas más importantes de la lechuga se encuentra el Mildiu de la vid, causado por Bremia lactucae. L. saligna muestra una resistencia cuantitativa a Bremia lactucae, por lo que generalmente se considera una planta no huésped de este oomiceto y se ha estudiado como una fuente potencial de resistencia genética a esta enfermedad. Persiste la necesidad en la técnica de proporcionar plantas que sean menos o no susceptibles a las diversas especies conocidas de Bremia lactucae.

Compendio de la invención

La presente invención tiene como objetivo proporcionar al menos una planta de Lactuca sativa que sea resistente a un amplio espectro de especies de Bremia lactucae, preferiblemente a al menos las especies de Bremia lactucae Bl:1 a Bl:28.

Por lo tanto, la presente invención proporciona, pero no se limita a, una planta de Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae, que comprende un locus de resistencia a Bremia que está vinculado a un determinante genético, dicho determinante genético puede obtenerse a partir del genoma de una planta de Lactuca nativa, preferiblemente a partir del genoma de Lactuca serriola según la reivindicación 1.

La presente invención también proporciona una semilla según la reivindicación 2 y partes de plantas según la reivindicación 3.

Además, la presente invención proporciona un marcador de DNA vinculado y co-segregado con un locus de resistencia a Bremia lactucae en una planta de Lactuca sativa según la reivindicación 4.

Finalmente, la presente invención también se refiere a un uso de marcadores según la reivindicación 6 o según la reivindicación 7.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una comparación entre una planta según la presente invención y una planta normal. Ambas fueron inoculadas con Bremia lactucae, solo la planta según la presente invención mostró resistencia.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a nuevas plantas resistentes a Bremia lactucae, preferiblemente a las especies Bl:1 a Bl:28 de Bremia lactucae, y a semillas de dichas plantas. La presente invención también se refiere a métodos para preparar dichas plantas y para producir semillas de las mismas. La invención se refiere además a los marcadores y al uso de estos últimos en la reproducción asistida por marcadores y en la identificación de las características de resistencia a Bremia.

Definiciones

A los términos y expresiones técnicas utilizadas dentro del alcance de esta solicitud se les debe dar generalmente el significado comúnmente aplicado a ellos en la técnica pertinente de la reproducción y el cultivo de plantas, a menos que se indique lo contrario a continuación en la presente memoria.

Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una o más plantas, y la referencia a "una célula" incluye mezclas de células, tejidos y similares.

"Aproximadamente", tal y como se usa en la presente memoria para referirse a un valor medible tal como un parámetro, una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de /-20 % o menos, preferiblemente /-10 % o menos, más preferiblemente /-5 % o menos, incluso más preferiblemente /-1 % o menos, y aún más preferiblemente /-0,1 % o menos de y desde el valor especificado, en la medida en que dichas variaciones sean apropiadas para realizar en la invención descrita. Sin embargo, debe entenderse que el valor al que se refiere el modificador "aproximadamente" también se describe específicamente.

"Comprender", "que comprende" y "comprende" y "compuesto por" como se usa en la presente memoria son sinónimos de "incluir", "que incluye", "incluye" o "contener", "que contiene", "contiene" y son términos inclusivos o abiertos que especifican la presencia de lo que sigue, por ejemplo, componente y no excluyen ni impiden la presencia de componentes, características, elementos, miembros, etapas adicionales no enumerados, conocidas en la técnica o descritas en ella.

El enunciado de intervalos numéricos por extremos incluye todos los números y fracciones incluidos dentro de ese intervalo, así como los extremos enunciados.

La expresión "% en peso" (porcentaje en peso), en la presente memoria y en toda la descripción, a menos que se defina de otro modo, se refiere al peso relativo del componente respectivo basado en el peso total de la formulación.

Se entiende por planta de "Lactuca sativa" cultivada dentro del alcance de la invención a una planta que ya no se encuentra en estado natural sino que ha sido desarrollada por el cuidado humano y para uso y/o consumo humano.

Se entiende por un "alelo" dentro del alcance de la invención las formas alternativas o variantes de varias unidades genéticas idénticas o asociadas a formas diferentes de un gen o de cualquier tipo de elemento genético identificable, que son alternativas en herencia porque están situadas en el mismo locus en cromosomas homólogos. Dichas formas alternativas o variantes pueden ser el resultado de polimorfismo de un solo nucleótido, inserciones, inversiones, translocaciones o deleciones, o la consecuencia de la regulación génica provocada, por ejemplo, por modificación química o estructural, regulación de la transcripción o modificación/regulación postraduccional. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen o elemento genético determinado suelen ocupar loci correspondientes en un par de cromosomas homólogos. Los alelos determinan características distintivas que pueden transmitirse de padres a hijos. El proceso por el cual se transmiten los alelos fue descubierto por Gregor Mendel y formulado en lo que se conoce como ley de segregación de Mendel.

Un alelo asociado con un gen R puede comprender formas alternativas o variantes de varias unidades genéticas, incluyendo aquellas que son idénticas o están asociadas con un solo gen o múltiples genes o sus productos, o incluso un gen alterado o controlado por un factor genético que contribuye al fenotipo representado por el locus.

Como se usa en la presente memoria, el término "marcador determinante" se refiere a una forma alternativa o variante de una unidad genética como se define en la presente memoria anteriormente, cuando se usa como un marcador para localizar loci genéticos que contienen alelos en un cromosoma que contribuyen a la variabilidad de las características fenotípicas.

Como se usa en la presente memoria, el término "reproducción", y sus variantes gramaticales, se refieren a cualquier proceso que genera una progenie individual. La reproducción puede ser sexual o asexual, o cualquier combinación de las mismas. Tipos ejemplares no limitantes de reproducciones incluyen cruces, ajustes, generación de derivados haploides dobles y combinaciones de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, la frase "población reproductora establecida" se refiere a una colección de parejas reproductoras potenciales producidas por y/o utilizadas como padres en un programa de reproducción; por ejemplo, un programa de reproducción comercial. Los miembros de la población reproductora establecida suelen estar bien caracterizados genética y/o fenotípicamente. Por ejemplo, se podrían haber evaluado varias características fenotípicas de interés, por ejemplo, en diferentes condiciones ambientales, en múltiples localizaciones y/o en diferentes momentos. Alternativamente o además, uno o más loci genéticos asociados con la expresión de las características fenotípicas podrían haber sido identificados y uno o más de los miembros de la población reproductora podrían haber sido genotipados con respecto a uno o más loci genéticos así como con respecto a uno o más marcadores genéticos que están asociados con uno o más loci genéticos.

Como se usa en la presente memoria, la frase "individuo diploide" se refiere a un individuo que tiene dos conjuntos de cromosomas, normalmente uno de cada uno de sus dos progenitores. Sin embargo, se entiende que en algunas realizaciones un individuo diploide puede recibir sus conjuntos de cromosomas "materno" y "paterno" del mismo organismo único, tal como cuando una planta se autofecunda para producir una generación posterior de plantas.

Se entiende que "homocigoto" dentro del alcance de la invención se refiere a alelos similares en uno o más loci correspondientes en el cromosoma homólogo.

Se entiende que "heterocigoto" dentro del alcance de la invención se refiere a alelos diferentes en uno o más loci correspondientes en cromosomas homólogos.

Se entiende que "retrocruzamiento" dentro del alcance de la invención se refiere a un proceso en el que una progenie híbrida se retrocruza repetidamente con uno de los padres. Se pueden utilizar diferentes progenitores recurrentes en retrocruzamientos posteriores.

Se entiende que "locus" dentro del alcance de la invención se refiere a una región en un cromosoma.

Como se usa en la presente memoria, "foco marcador" se refiere a una región en un cromosoma, que comprende una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos que está presente en el genoma de un individuo y que está asociada con uno o más loci de interés, que pueden comprender un gen o cualquier otro elemento o factor genético que contribuya a una característica. "Locus marcador" también se refiere a una región en un cromosoma, que comprende una secuencia de polinucleótidos complementaria a una secuencia genómica, tal como una secuencia de un ácido nucleico usado como sonda.

Se entiende que "enlace genético" dentro del alcance de la invención se refiere a una asociación de caracteres en herencia debido a la localización de genes en proximidad en el mismo cromosoma, medida por el porcentaje de recombinación entre loci (centi-Morgan, cM).

Para los fines de la presente invención, el término "co-segregación" se refiere al hecho de que el alelo de la característica y el (los) alelo(s) del marcador(es) tienden a transmitirse juntos debido a que están físicamente muy juntos en el mismo cromosoma (recombinación reducida entre ellos debido a su proximidad física) resultando en una asociación no aleatoria de sus alelos como resultado de su proximidad en el mismo cromosoma. La "co-segregación" también se refiere a la presencia de dos o más características dentro de una sola planta de las cuales se sabe que al menos una es genética y que no se puede explicar fácilmente por casualidad.

Como se usa en la presente memoria, el término "arquitectura genética en el locus del gen R" se refiere a una región genómica que se correlaciona estadísticamente con la característica fenotípica de interés y representa la base genética subyacente de la característica fenotípica de interés.

Como se usa en la presente memoria, las frases "cruce sexual" y "reproducción sexual" en el contexto del tema actualmente divulgado se refieren a la fusión de gametos para producir progenie (por ejemplo, por fertilización, tal como para producir semillas por polinización en plantas). Un “cruce asexual" o "fertilización cruzada" es en algunas realizaciones la fertilización de un individuo por otro (por ejemplo, polinización cruzada en plantas). El término "venta" se refiere en algunas realizaciones a la producción de semilla por auto-fertilización o auto-polinización; es decir, el polen y el óvulo son de la misma planta.

Como se usa en la presente memoria, la frase "marcador genético" se refiere a una característica del genoma de un individuo (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos que está presente en el genoma de un individuo) que está asociada con uno o más loci de interés. En algunas realizaciones, un marcador genético es polimórfico en una población de interés, o el locus ocupado por el polimorfismo, dependiendo de la competencia. Los marcadores genéticos incluyen, por ejemplo, polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), indeles (es decir, inserciones/deleciones), repeticiones de secuencia simple (SSRs), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLPs), DNAs polimórficos amplificados al azar (RAPDs), marcadores de secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS), marcadores de la tecnología de matrices de diversidad (DART) y polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLPs), entre muchos otros ejemplos. Los marcadores genéticos se pueden utilizar, por ejemplo, para localizar loci genéticos que contienen alelos en un cromosoma que contribuyen a la variabilidad de las características fenotípicas. La frase "marcador genético" también puede referirse a una secuencia de polinucleótidos complementaria a una secuencia genómica, tal como una secuencia de ácidos nucleicos utilizada como sonda.

Un marcador genético puede localizarse físicamente en una posición en un cromosoma que está dentro o fuera del locus genético con el que está asociado (es decir, es intragénico o extragénico, respectivamente). Dicho de otra manera, mientras que los marcadores genéticos se emplean normalmente cuando la localización en un cromosoma del gen o de una mutación funcional, por ejemplo, dentro de un elemento de control fuera de un gen, que corresponde al locus de interés no ha sido identificado y hay una velocidad de recombinación distinta de cero entre el marcador genético y el locus de interés, el tema divulgado actualmente también puede emplear marcadores genéticos que están físicamente dentro de los límites de un locus genético (por ejemplo, dentro de una secuencia genómica que corresponde a un gen tal como, pero no limitado a, un polimorfismo dentro de un intrón o un exón de un gen).

Se entiende que "Marcador de Microsatélite o SSRs (repeticiones de secuencia simple)" dentro del alcance de la invención se refiere a un tipo de marcador genético que consiste en numerosas repeticiones de secuencias cortas de bases de DNA, que se encuentran en loci a lo largo del genoma de la planta y tienen probabilidad de ser altamente polimórficas.

Como se usa en la presente memoria, el término "genotipo" se refiere a la constitución genética de una célula u organismo. El "genotipo para un conjunto de marcadores genéticos" de un individuo incluye los alelos específicos, para uno o más loci de marcadores genéticos, presentes en el haplotipo del individuo. Como se sabe en la técnica, un genotipo puede referirse a un solo locus o a múltiples loci, ya sea que los loci estén relacionados o no y/o estén vinculados o no. En algunas realizaciones, el genotipo de un individuo se refiere a uno o más genes que están relacionados porque uno o más de los genes están implicados en la expresión de un fenotipo de interés (por ejemplo, un gen R o cuantitativo como se define en la presente memoria). Por lo tanto, en alguna realización, un genotipo comprende un compendio de uno o más alelos presentes en un individuo en uno o más loci genéticos de un gen R o cuantitativo. En algunas realizaciones, un genotipo se expresa en términos de un haplotipo (definido más adelante en la presente memoria).

Como se usa en la presente memoria, el término "germoplasma" se refiere a la totalidad de los genotipos de una población u otro grupo de individuos (por ejemplo, una especie). El término "germoplasma" también puede referirse a material vegetal; por ejemplo, un grupo de plantas que actúan como depósito para varios alelos. La frase "germoplasma adaptado" se refiere a materiales vegetales de probada superioridad genética; por ejemplo, para un entorno o área geográfica dada, mientras que las frases "germoplasma no adaptado", "germoplasma crudo" y "germoplasma exótico" se refieren a material vegetal de valor genético desconocido o no probado; por ejemplo, para un entorno o área geográfica determinada; como tal, la frase "germoplasma no adaptado" se refiere en algunas realizaciones a materiales vegetales que no son parte de una población reproductora establecida y que no tienen una relación conocida con un miembro de la población reproductora establecida.

Como se usa en la presente memoria, los términos "híbrido", "planta híbrida" y "progenie híbrida" se refieren a un individuo generado a partir de progenitores genéticamente diferentes (por ejemplo, un individuo genéticamente heterocigoto o en su mayoría heterocigoto).

Tal como se usa en la presente memoria, la frase "híbrido F1 de cruce simple" se refiere a un híbrido F1 producido a partir de un cruce entre dos líneas endogámicas.

Como se usa en la presente memoria, la frase "línea endogámica" se refiere a una población genéticamente homocigota o casi homocigota. Una línea endogámica, por ejemplo, se puede derivar a través de varios ciclos de reproducción hermano/hermana o de autofecundación o en producción dihaploide. En algunas realizaciones, las líneas endogámicas se reproducen fielmente para una o más características fenotípicas de interés. Un "endogámico", "individuo endogámico o "progenie endogámica" es un individuo probado a partir una línea endogámica.

Como se usa en la presente memoria, el término "línea doble haploide (DH)", se refiere a líneas endogámicas estables emitidas desde otro cultivo. Algunos granos de polen (haploides) cultivados en medios y circunstancias específicos pueden desarrollar plántulas que contienen n cromosomas. Estas plántulas son entonces "dobles" y contienen 2n cromosomas. La progenie de estas plántulas se denomina "doble haploide" y esencialmente ya no segregan (estable).

Como se usa en la presente memoria, el término "vínculo", y variantes gramaticales del mismo, se refiere a la tendencia de los alelos en diferentes loci en el mismo cromosoma a segregarse juntos con más frecuencia de lo que se esperaría por casualidad si su transmisión fuera independiente, en algunas realizaciones como una consecuencia de su proximidad física.

Tal como se usa en la presente memoria, la frase "ácido nucleico" se refiere a cualquier cadena física de unidades monoméricas que se pueda corresponder con una cadena de nucleótidos, incluyendo un polímero de nucleótidos (por ejemplo, un polímero de DNA, cDNA o RNA típico), oligonucleótidos modificados (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden bases que no son típicas del RNA o DNA biológico, tales como oligonucleótidos 2'-O-metilados), y similares. En algunas realizaciones, un ácido nucleico puede ser monocatenario, bicatenario, multicatenario o combinaciones de los mismos. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular del objetivo de la materia actualmente divulgada comprende o codifica opcionalmente secuencias complementarias, además de cualquier secuencia explícitamente indicada.

Como se usa en la presente memoria, la frase "característica fenotípica" se refiere a la apariencia u otra característica detectable de un individuo, que resulta de la interacción de su genoma, proteoma y/o metaboloma con el medio ambiente.

Como se usa en la presente memoria, la frase "resistencia" se refiere a la capacidad de una planta para restringir el crecimiento y desarrollo de un patógeno específico y/o el daño que causan cuando se compara con plantas susceptibles bajo condiciones ambientales y presión patógena similares. Las plantas resistentes pueden mostrar algunos síntomas de enfermedades o daños bajo la presión de patógenos, por ejemplo, presión de patógenos fúngicos tales como la presión de patógenos de Bremia lactucae.

Como se usa en la presente memoria, la frase "susceptibilidad" se refiere a la incapacidad de una planta para restringir adecuadamente el crecimiento y desarrollo de un patógeno específico, por ejemplo un patógeno fúngico tal como Bremia lactucae.

Como se usa en la presente memoria, la frase "resistencia a Bremia" o "resistencia a especies Bremia" o "planta resistente a Bremia" se refiere a la capacidad de las plantas para resistir la colonización por el hongo Bremia lactucae, Bl:1 a Bl:28 aislados como se caracterizan y clasifican según al código SEXTET de IBEB (International Bremia Evaluation Board).

Las plantas resistentes no mostrarán o muy pocas neurosis con esporulación nula o muy escasa bajo las condiciones de prueba definidas en el Ejemplo 1 a continuación.

Como se usa en la presente memoria, el término "pluralidad" se refiere a más de uno. Así, una "pluralidad de individuos" se refiere a al menos dos individuos, en algunas realizaciones, el término pluralidad se refiere a más de la mitad del total. Por ejemplo, en algunas realizaciones una "pluralidad de una población" se refiere a más de la mitad de los miembros de esa población.

Como se usa en la presente memoria, el término "progenie" se refiere a los descendientes de un cruce particular. Por lo general, la progenie resulta de la reproducción de dos individuos, aunque algunas especies (particularmente algunas plantas y animales hermafroditas) pueden autofecundarse (es decir, la misma planta actúa como donante de gametos tanto masculinos como femeninos). Los descendientes pueden ser, por ejemplo, de la F1, la F2 o cualquier generación posterior.

Como se usa en la presente memoria, la frase "gen R" se refiere a una característica fenotípica que está controlada por uno o unos pocos genes que muestran efectos fenotípicos importantes. Debido a esto, los genes R generalmente se heredan simplemente. Los ejemplos en las plantas incluyen, pero no se limitan a, el color de la flor, el color de la fruta y varias resistencias a enfermedades conocidas, tal como, por ejemplo, la resistencia a las manchas de hongos.

Se entiende que "selección asistida por marcadores" dentro del alcance de la invención se refiere a, por ejemplo el uso de marcadores genéticos para detectar uno o más ácidos nucleicos de la planta, donde el ácido nucleico está asociado con una característica deseada para identificar plantas que portan genes para características deseables (o indeseables), para que esas plantas puedan usarse (o evitarse) ) en un programa de reproducción selectiva.

Dentro del alcance de la invención se entiende que "PCR (reacción en cadena de la polimerasa)" se refiere a un método para producir cantidades relativamente grandes de regiones específicas de DNA o subconjunto(s) del genoma, lo que hace posible varios análisis que se basan en esas regiones.

Se entiende que "cebador de PCR" dentro del alcance de la invención se refiere a fragmentos relativamente cortos de DNA monocatenario utilizados en la amplificación por PCR de regiones específicas de DNA.

Se entiende que "fenotipo" dentro del alcance de la invención se refiere a una característica o características distinguibles de una característica controlada genéticamente.

Como se usa en la presente memoria, la frase "característica fenotípica" se refiere a la apariencia u otra característica detectable de un individuo, que resulta de la interacción de su genoma, proteoma y/o metaboloma con el medio ambiente.

Se entiende que "polimorfismo" dentro del alcance de la invención se refiere a la presencia en una población de dos o más formas diferentes de un gen, marcador genético o característica heredada o un producto génico obtenible, por ejemplo, a través de empalme alternativo, metilación del DNA, etc.

Se entiende que "reproducción selectiva" dentro del alcance de la invención se refiere a un programa de reproducción que utiliza plantas que poseen o muestran características deseables como progenitores.

Se entiende por planta "probadora" dentro del alcance de la invención una planta del género Lactuca utilizada para caracterizar genéticamente una característica en una planta que se va a probar. Típicamente, la planta que se va a probar se cruza con una planta "probadora" y se puntúa la relación de segregación de la característica en la progenie del cruce.

"Sonda", como se usa en la presente memoria, se refiere a un grupo de átomos o moléculas que es capaz de reconocer y unirse a una molécula o estructura celular diana específica y, por tanto, permitir la detección de la molécula o estructura diana. En particular, "sonda" se refiere a una secuencia de DNA o RNA marcada que puede usarse para detectar la presencia de y cuantificar una secuencia complementaria mediante hibridación molecular.

"Homología de secuencia o Identidad de secuencia" se usa en la presente memoria de manera intercambiable. Los términos "identidad" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o proteínas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia, medidos usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Si dos secuencias que van a compararse entre sí difieren en longitud, la identidad de secuencia se refiere preferiblemente al porcentaje de restos de nucleótidos de la secuencia más corta que son idénticos a los restos de nucleótidos de la secuencia más larga. Cuando se usa Bestfit u otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene, por ejemplo, un 95 % de identidad con una secuencia de referencia de la presente invención, los parámetros se ajustan preferiblemente de manera que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud total de la secuencia de referencia y que se permitan huecos de homología de hasta el 5% del número total de los nucleótidos en la secuencia de referencia. Cuando se utiliza Bestfit, los llamados parámetros opcionales se dejan preferiblemente en sus valores preestablecidos ("predeterminados"). Las desviaciones que aparecen en la comparación entre una secuencia dada y las secuencias de la invención descritas anteriormente pueden deberse, por ejemplo, a la adición, eliminación, sustitución, inserción o recombinación. Tal comparación de secuencias puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un alineamiento BLAST de Smith-Waterman.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier etapa de desarrollo, particularmente una planta de semillas.

Una "célula vegetal" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una sola célula aislada o de una célula cultivada, o como parte de una unidad organizada superior tal como, por ejemplo, tejido vegetal, un órgano vegetal o una planta completa.

El "cultivo de células vegetales" significa cultivos de unidades vegetales tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diversas etapas de desarrollo.

"Material vegetal" o "material vegetal que se puede obtener de una planta" se refiere a hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos de células o tejidos, o cualquier otra parte o producto de una planta

Un "órgano vegetal" es una parte distinta y visiblemente estructurada y diferenciada de una planta, tal como una raíz, tallo, hoja, capullo de la flor o embrión.

“Tejido vegetal”, tal como se usa en la presente memoria, significa un grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional. Se incluye cualquier tejido de una planta o partes de una planta en cultivo. Este término incluye, pero no se limita a, plantas completas, órganos vegetales, semillas vegetales, cultivo de tejidos y cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de este término junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido vegetal como se indica anteriormente o de otro modo abarcado por esta definición no pretende ser exclusivo de ningún otro tipo de tejido vegetal.

Los términos "especie" o "especies" se refieren a cualquier grupo endogamia, incluyendo los subgrupos taxonómicos tales como las subespecies, subordinados taxonómicamente a una especie y superiores a una subespecie y marcados por un perfil predeterminado de factores latentes de características hereditarias.

El mildiu de la vid es una enfermedad fúngica causada por el hongo Bremia lactucae. Se produce en todo el mundo y representa un gran problema tanto para el rendimiento como para la calidad de la lechuga cultivada (Lactuca sativa). El hongo puede infectar la planta de lechuga en cualquier etapa de crecimiento, después de lo cual los primeros síntomas del mildiu de la vid se vuelven visibles como manchas amarillas cloróticas en la superficie de la hoja. Dentro de las 24 a 48 horas, un hongo blanco y esponjoso se vuelve visible en la superficie inferior de la hoja como una indicación de la formación de esporas. Durante la infección, las manchas de las lesiones se vuelven cada vez más grandes y más cloróticas hasta que las hojas se vuelven completamente marrones. La esporulación típica ocurre cuando las plántulas de la lechuga son susceptibles a Bremia lactucae. En caso de que las plantas sean homocigóticas para la característica de resistencia, no se observa esporulación. Cuando un gen de resistencia semidominante es heterocigoto, tampoco se observa esporulación, pero a menudo se puede puntuar el amarillamiento o el pardeamiento de los cotiledones en condiciones ideales de incubación de Bremia para el mildiu de la vid.

Bremia lactucae pertenece al grupo Oomycetes, una clase de hongos relativamente primitivos. Otros miembros de este grupo son, por ejemplo, Pythium y Phytophthora. B. laptucae contiene diferentes especies fisiológicas ("fisio’s"), se conoce como un patógeno muy variable y es específico del huésped. Los nuevos fisio’s se producen con relativa frecuencia a través de la mutación de los genes de virulencia durante la formación de esporas que precede a la propagación de B. lactucae. Actualmente hay 28 fisio’s conocidos para Bremia lactucae (Bl:01 a Bl:28).

Dentro del género Lactucae, al que pertenece la lechuga cultivada, existen diferentes especies resistentes a Bremia lactucae. La resistencia generalmente se basa en genes, conocidos como genes de resistencia Dm (Dm significa Downy mildew). El mecanismo de resistencia se conoce como mecanismo gen por gen basado en la interacción específica entre los productos del gen de virulencia específico de la planta y el gen de avirulencia específico del patógeno que da como resultado la resistencia de la planta de lechuga. Los genes R codifican proteínas con un sitio de unión de nucleótidos extracelulares (NBS), fusionado con una repetición rica en leucina (LRR) con diferentes dominios N-terminales (TIR tipo Toll, X, CC en espiral). Hasta la fecha, los genes R se agrupan en 4/5 clases según la organización del dominio conservado. Si un locus de Dm es dominante, no se observa esporulación de Bremia.

Debido a la gran variabilidad del patógeno, que se atribuye a la aparición de mutaciones frecuentes en los genes de avirulencia, la resistencia específica de la especie mediada por los diversos genes de resistencia de Dm suele romperse rápidamente por especies emergentes o fisios del patógeno de la Bremia lactucae.

Debido a la reducción del rendimiento y la calidad de la lechuga cultivada (L. sativa) provocada por la infestación de la planta de lechuga con el hongo Bremia lactucae, existe una necesidad insatisfecha de estrategias convenientes y económicamente sostenibles para proteger las plantas, por ejemplo, plantas de lechuga como Lactuca, contra la infestación de Bremia lactucae.

La presente invención aborda esta necesidad al proporcionar una planta de L. sativa, que es resistente a la infestación por Bremia lactucae y, por lo tanto, está protegida del daño causado por este patógeno. El suministro de lechuga resistente a Bremia lactucae es una alternativa ecológica para el uso de pesticidas y contribuirá al éxito de los programas de manejo integrado de plagas. Más preferiblemente, dicha presente invención se refiere a una planta y un método para proporcionar resistencia contra las especies Bl:1 a Bl:28 de Bremia lactucae en lechuga.

El problema técnico que subyace a la presente invención es, por lo tanto, proporcionar una planta de L. sativa resistente a Bremia lactucae, que muestre una resistencia mejorada, particularmente una resistencia general, no específica de especie a este patógeno en términos de especies conocidas a partir de la fecha de la presente solicitud, particularmente a (al menos) especies o aislados de Bremia Bl:01 a Bl:28 caracterizados y clasificados según el código SEXTET por IBEB (International Bremia Evaluation Board).

El problema técnico se resuelve mediante la provisión de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Además, ahora se encontró sorprendentemente dentro del alcance de la presente invención que la vinculación entre los genes responsables de los cambios morfológicos no deseados en la planta y el gen responsable de la resistencia a Bremia lactucae como está presente en el material de origen de tipo nativo, está rota y por lo tanto ya no está presente en la planta Lactuca sativa según la invención.

En una primera realización, la presente invención se refiere a una planta de Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae. La planta de Lactuca sativa según la presente invención comprenderá preferiblemente un locus de resistencia a Bremia lactucae, particularmente un locus de resistencia a Bremia, particularmente un locus de resistencia a Bremia lactucae de amplio espectro, vinculado a un determinante genético y que se puede obtener a partir del genoma de una planta de Lactuca nativa, particularmente del genoma de Lactuca serriola (escarola). En una realización específica de la invención, la resistencia a Bremia lactucae es una resistencia general, no específica de especie. En otra realización específica de la invención, se pretende reducir al mínimo la resistencia de la vinculación o la co-expresión de características agronómicas indeseables tales como, por ejemplo, enanismo. Este último se obtiene preferentemente por retrocruzamiento con el Padre recurrente, por ejemplo, L. Sativa ssp.

En una realización, la presente invención contempla una planta en la que el locus de resistencia a Bremia lactucae está presente en un estado homocigótico.

En una realización de la presente invención, dicho locus de resistencia a Bremia lactucae está localizado en un grupo de enlace específico. Preferiblemente, dicho locus de resistencia se localiza en el grupo de enlace 2.

Más preferiblemente, dicho locus de resistencia se co-segrega con una secuencia que tiene al menos un 99 %, lo más preferiblemente un 100 % de homología con una secuencia elegida de SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2.

En una realización adicional, la presente invención también contempla una planta según una cualquiera de las realizaciones anteriores en la que la presencia del locus de resistencia a Bremia lactucae se caracteriza por al menos un marcador de DNA o determinante en el cromosoma que está estadísticamente correlacionado y, por lo tanto, genéticamente vinculado a la característica de resistencia a Bremia lactucae.

Preferiblemente, dicho marcador de DNA o determinante tiene al menos un 99 %, lo más preferiblemente un 100 % de homología con una secuencia elegida de SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2.

En otra realización, la presente invención también se refiere a una planta de L. sativa según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en la que el locus de resistencia a Bremia lactucae en L. serriola está genéticamente vinvulado a al menos un locus marcador, que se co-segrega con la característica de resistencia a Bremia Lactucae. Preferiblemente, dicho loci marcadores comprende variaciones de bases de DNA tales como polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), microsatélites o repeticiones de secuencia simple (SSRs). Dichos loci marcadores tienen al menos un 99 %, lo más preferiblemente un 100 % de homología con una secuencia elegida de SEQ ID No. 1 o SEQ ID No.

2.

En una realización adicional, se proporciona una planta de L. sativa que comprende al menos un alelo en un locus del gen R en el genoma de L. sativa que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae, que está genéticamente vinculado a al menos un locus marcador, que se co-segrega con la característica de resistencia a Bremia lactucae y que puede identificarse mediante al menos un cebador oligonucleotídico de PCR o mediante cualquier otro marcador en el cromosoma que esté correlacionado estadísticamente y, por lo tanto, genéticamente vinculado a la característica de resistencia a Bremia lactucae. Preferiblemente, dicho locus se localiza en el grupo de enlace 2.

La secuencia de ácido nucleico de los marcadores, los marcadores vinculados o el locus de resistencia a Bremia lactucae puede determinarse mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende dicho locus de resistencia a Bremia lactucae o una parte del mismo que confiere resistencia puede aislarse de una planta donante resistente a Bremia lactucae fragmentando el genoma de dicha planta y seleccionando aquellos fragmentos que albergan uno o más marcadores indicativos de dicho locus de resistencia a Bremia lactucae. Posteriormente, o alternativamente, las secuencias de marcadores (o partes de las mismas) indicativas de dicho locus de resistencia pueden usarse como cebadores de amplificación (PCR), para amplificar (una) secuencia(s) de ácido nucleico que comprende dicho locus de resistencia de una muestra de ácido nucleico genómico o un fragmento de genoma obtenido de dicha planta. La secuencia de nucleótidos del locus de resistencia a Bremia lactucae, y/o de cualquier marcador adicional comprendido en el mismo, puede obtenerse mediante métodos de secuenciación estándar. Para más detalles, véase el ejemplo 3.

En una realización, dicho alelo en el locus de resistencia del gen (R) en el genoma de L. sativa que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae, se puede obtener de una planta que tiene los antecedentes genéticos de la línea AS-002 de Lactuca sativa, particularmente de una planta que tiene los antecedentes o la arquitectura genética en el locus del gen R de la línea AS-002 de L. sativa, pero especialmente de una línea AS-002 de Lactuca sativa, cuya semilla representativa está depositada en NCIMB con el número de registro NCIMB 42082, o de una progenie o un ancestro de la misma que comprende dicho locus del gen R.

En otra realización como se describe en la presente memoria, se proporciona una planta de Lactuca sativa que comprende al menos un alelo o parte del mismo en un locus del gen R en el genoma de L. sativa que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae, que es complementario al alelo correspondiente presente en una Línea AS-002 de Lactuca sativa, depositada con el número de registro NCIMB 42082, y vinculada genéticamente a al menos un locus marcador dentro del genoma de Lactuca serriola, que se co-segrega con la característica de resistencia a Bremia y puede identificarse mediante un marcador determinante en el cromosoma que está estadísticamente correlacionado y, por lo tanto, genéticamente vinculado a la característica de resistencia a Bremia lactucae como se describe. Dicho marcador determinante es homólogo o idéntico a SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2.

En otra realización, la presente invención también se refiere a una planta según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en la que dicha planta es un dihaploide o un híbrido.

En otra realización, también se contempla una planta según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en la que dicha planta es estéril masculina.

En un aspecto de la invención, la planta de L. sativa según la invención y como se describe en la presente memoria anteriormente es heterocigota para la característica de resistencia a Bremia lactucae.

En un aspecto de la invención, la planta de L. sativa según la invención y como se ha descrito anteriormente en la presente memoria es homocigótica para la característica de resistencia a Bremia lactucae.

Una realización específica de la invención se refiere a una planta de L. sativa según la invención y como se describe en la presente memoria anteriormente capaz de resistir infestaciones con Bremia lactucae, cuya planta es una planta de un grupo de cultivo seleccionado de butterhead, lechuga china, crisphead (formas Iceberg), Looseleaf, lechuga romana y summer crisp (lechuga trocadero).

En otra realización, la presente invención se refiere a material vegetal que puede obtenerse de una planta según una cualquiera de las realizaciones anteriores, incluyendo, pero sin estar limitado a, hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos de células o tejidos, o cualquier otra parte o producto de la planta que aún muestre el fenotipo resistente según la invención, en particular cuando se cultiva en una planta.

En otra realización como se describe en la presente memoria, se proporcionan partes de una planta según una cualquiera de las realizaciones anteriores incluyendo, pero sin estar limitado a, semillas vegetales, órganos vegetales tales como, por ejemplo, una raíz, tallo, hoja, capullo de la flor, o embrión, etc., óvulos, microsporas de polen, células vegetales, tejidos vegetales, cultivos de células vegetales tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivos celulares, células en tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diversas etapas de desarrollo, etc.; que todavía muestran el fenotipo resistente según la invención, particularmente cuando se cultiva en una planta.

En otra realización de la presente invención, también se proporciona una semilla de una planta homocigótica según una cualquiera de las realizaciones anteriores.

En otra realización, la presente invención contempla además semillas de una planta de L. sativa como se reivindica en una cualquiera de las realizaciones anteriores, particularmente semillas híbridas, que comprenden el determinante genético que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae.

En otra realización, la presente invención se refiere a semillas según una cualquiera de las realizaciones anteriores, depositadas en NCIMB Ltd. con el número de registro NCIMB 42082.

En una realización adicional, la presente invención proporciona semillas según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en las que dicho determinante genético contribuye a la resistencia a Bremia lactucae proporciona resistencia a al menos las especies Bl :1 a Bl:28 de Bremia lactucae. Preferiblemente, dicho determinante genético se localiza en el grupo de enlace 2.

La presente invención también contempla el uso de L. sativa para producir semillas que comprenden el determinante genético que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae, particularmente a al menos las especies Bl:1 a Bl:28 de Bremia lactucae.

En otra realización más de la presente invención, se proporciona un marcador de DNA que está vinculado al locus de resistencia a Bremia lactucae y puede ser amplificado por al menos un cebador oligonucleotídico o por cualquier otro marcador determinante en el cromosoma que esté correlacionado estadísticamente y, por lo tanto, vinculado genéticamente a la característica de resistencia a Bremia lactucae y que es capaz de amplificar un marcador de DNA vinculado al locus de resistencia a Bremia lactucae. En otra realización, la presente invención se refiere al tipo de haploide que puede detectarse mediante el uso del marcador mencionado anteriormente. Dicho marcador tiene una secuencia elegida entre SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2.

En una realización adicional, la presente invención también se refiere al uso de algunos o todos de estos marcadores de DNA para la selección diagnóstica de un locus de resistencia a Bremia en lechuga, particularmente el locus de resistencia a Bremia as002, en L. sativa.

En otra realización, la presente invención contempla además el uso de algunos o todos de estos marcadores de DNA para identificar en una planta la presencia del locus de resistencia a Bremia lactucae y/o para monitorear la introgresión del locus de resistencia a Bremia lactucae en lechuga en Lactuca sativa.

Por lo tanto, la presente invención se relaciona además en una realización con marcadores derivados, desarrollados a partir de un producto de amplificación según la invención y como se describe anteriormente en la presente memoria mediante métodos conocidos en la técnica, cuyos marcadores derivados están genéticamente vinculados al locus de resistencia a Bremia lactucae, particularmente al locus de resistencia de as002 de Bremia lactucae, en L. sativa.

Estos marcadores derivados pueden luego usarse para identificar plantas resistentes a Bremia lactucae, en donde los marcadores mencionados específicamente en la presente memoria se recombinan en relación con la resistencia y, por lo tanto, ya no están presentes en el genoma de la planta resistente que se usó para la introgresión.

También se describe un método para introducir al menos un alelo asociado con la resistencia a Bremia lactucae en un locus del gen R que contribuye a la resistencia a Bremia en una planta de L. sativa que carece de dicho alelo que comprende: a) obtener una primera planta de L. sativa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores; b) cruzar dicha primera planta de L. sativa con una segunda planta de L. sativa, en la que dicha segunda planta de L. sativa carece de dicho alelo; y c) identificar una planta resultante del cruce que muestra una mayor resistencia a Bremia lactucae y que comprende al menos un marcador determinante que se co-segrega con dicha resistencia a Bremia; y d) opcionalmente, aislar dicha planta y e) opcionalmente, retrocruzar dicha planta con la primera o segunda planta de L. sativa. Dicho marcador determinante tiene al menos un 99 %, lo más preferiblemente un 100 % de homología con una secuencia elegida de SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2.

Además se describe un método para obtener una planta de Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae, que comprende: a) obtener un híbrido F1 cruzando una planta de Lactuca serriola con una planta de Lactuca sativa, que es sensible a la infestación con Bremia lactucae; b) retrocruzar el híbrido F1 con dicha planta de Lactuca sativa; y c) identificar una planta resultante del cruce que muestre resistencia a Bremia lactucae y que comprenda al menos un marcador determinante que se co-segregue con dicha resistencia a Bremia, y d) opcionalmente, cultivar dicha planta. Dicho marcador determinante tiene al menos un 99 %, lo más preferiblemente un 100 % de homología con una secuencia elegida de SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria un método para obtener semillas según una cualquiera de las realizaciones anteriores que comprende las etapas de: a) obtener una primera planta de L. sativa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores; b) cruzar dicha primera planta de L. sativa con una segunda planta de L. sativa, en el que dicha segunda planta de L. sativa carece de dicho alelo; y c) identificar una planta resultante del cruce que muestra resistencia a Bremia lactucae y que comprende al menos un marcador determinante que se co-segrega con dicha resistencia a Bremia lactucae; y d) cosechar la semilla de la progenie de dicho cruce que comprende al menos un marcador determinante que se co-segrega con dicha resistencia a Bremia lactucae.

En otra realización, la presente invención también se refiere a un método según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que en la etapa c) la planta resultante de cualquiera de los cruces anteriores se identifica aplicando una selección fenotípica basada en las plantas que muestran una mayor resistencia a Bremia lactucae o mediante una combinación de una selección basada en PCR y fenotípica.

En otra realización, se proporciona en la presente memoria un método para proteger una planta de Lactuca sativa contra la infestación con Bremia lactucae, que comprende a) obtener una planta de Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae según una cualquiera de las realizaciones anteriores; y b) cultivar dicha planta en un área con alta presión de enfermedad (Bremia lactucae).

En otra realización de la presente invención, se contempla el uso de una semilla según una cualquiera de las realizaciones anteriores para cultivar una planta de Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae.

Plantas Derivadas de la línea AS-002 de Lactuca sativa mediante Ingeniería Genética

Muchas características útiles que se pueden introducir mediante el retrocruzamiento, así como directamente en una planta, son aquellas que se introducen mediante técnicas de transformación genética. Por lo tanto, la transformación genética puede usarse para insertar un transgén seleccionado en la línea de L. sativa de la invención o, alternativamente, puede usarse para la preparación de transgenes que pueden introducirse mediante retrocruzamiento. Los métodos para la transformación de plantas, incluyendo L. sativa, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las técnicas que pueden emplearse para la transformación genética de L. sativa incluyen, pero no se limitan a, electroporación, bombardeo con microproyectiles, transformación mediada por agrobacterias y captación directa de DNA por protoplastos.

Para efectuar la transformación por electroporación, se pueden emplear tejidos friables, tales como un cultivo en suspensión de células o callos embriogénicos o, alternativamente, se pueden transformar embriones inmaduros u otro tejido organizado directamente. En esta técnica, se degradarían parcialmente las paredes celulares de las células elegidas exponiéndolas a enzimas degradadoras de pectina (pectoliasas) o enrollando mecánicamente tejidos de manera controlada.

Se ha establecido la producción de plantas de lechuga transgénica, incluyendo al menos Lactuca sativa. Un protocolo ejemplar para transformar L. sativa transgénica con Agrobacterium tumefaciens es descrito por Ian S. Curtis (Methods in Molecular Biology, volume 343, p. 449-458, 1 de junio de 2006).

Un método particularmente eficiente para suministrar segmentos de DNA transformantes a células vegetales es el bombardeo con microproyectiles. En este método, las partículas se recubren con ácidos nucleicos y se suministran a las células mediante una fuerza propulsora. Los ejemplos de partículas incluyen aquellas compuestas de tungsteno, platino y, preferiblemente, oro. Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran sobre filtros o medio de cultivo sólido. Alternativamente, los embriones inmaduros u otras células diana pueden disponerse en un medio de cultivo sólido. Las células a bombardear se colocan a una distancia adecuada por debajo de la placa de parada del macroproyectil.

Una realización ilustrativa de un método para suministrar DNA en células vegetales mediante aceleración es el Biolistics Particle Delivery System, que se puede usar para impulsar partículas recubiertas con DNA o células a través de una pantalla, tal como una pantalla de acero inoxidable o pantalla de Nytex, sobre una superficie cubierta con células diana de L. sativa. La pantalla dispersa las partículas para que no se suministren a las células receptoras en grandes agregados. Se cree que una pantalla que interviene entre el aparato de proyectiles y las células a bombardear reduce el tamaño del agregado de proyectiles y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación al reducir el daño infligido a las células receptoras por proyectiles que son demasiado grandes.

Las técnicas de bombardeo con microproyectiles son ampliamente aplicables y pueden usarse para transformar virtualmente cualquier especie de planta.

La transferencia mediada por Agrobacterium es otro sistema ampliamente aplicable para introducir loci de genes en células vegetales. Una ventaja de la técnica es que el DNA puede introducirse en tejidos vegetales completos, evitando así la necesidad de regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto. Los vectores de transformación de Agrobacterium modernos son capaces de replicarse en E. coli así como en Agrobacterium, lo que permite manipulaciones convenientes (Klee et al., 1985). Además, los recientes avances tecnológicos en vectores para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium han mejorado la disposición de los genes y los sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar varios genes que codifican polipéptidos. Los vectores descritos tienen regiones multi-enlazadoras convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión directa de genes que codifican los polipéptidos insertados. Además, Agrobacterium que contiene genes Ti armados y desarmados puede usarse para la transformación.

En aquellas cepas de plantas donde la transformación mediada por Agrobacterium es eficiente, es el método de elección debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia del locus del gen. El uso de vectores que integran plantas mediadas por Agrobacterium para introducir DNA en células vegetales es bien conocido en la técnica (Fraley et al., 1985; Patente americana U.S. Pat. No. 5,563,055).

La transformación de protoplastos vegetales también se puede lograr usando métodos basados en la precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol, electroporación y combinaciones de estos tratamientos (véase, por ejemplo, Potrykus et al., 1985; Omirulleh et al., 1993; Fromm et al., 1986; Uchimiya et al., 1986; Marcotte et al., 1988). La transformación de plantas y la expresión de elementos genéticos foráneos se ejemplifica en Choi et al. (1994) y Ellul et al. (2003).

Varios promotores tienen utilidad para la expresión de genes de plantas para cualquier gen de interés, incluyendo, pero no limitado a, marcadores seleccionables, marcadores puntuables, genes para tolerancia a plagas, resistencia a enfermedades, mejoras nutricionales y cualquier otro gen de interés agronómico. Los ejemplos de promotores constitutivos útiles para la expresión génica de plantas de L. sativa incluyen, pero no se limitan a, el promotor P-35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que confiere una expresión constitutiva de alto nivel en la mayoría de los tejidos vegetales (véase, por ejemplo, Odel et al., 1985), incluyendo las monocotiledóneas (véase, por ejemplo, Dekeyser et al., 1990; Terada y Shimamoto, 1990); una versión duplicada en tándem del promotor 35S de CaMV, el promotor 35S mejorado (P-e35S), el promotor de nopalina sintasa (An et al., 1988), el promotor de octopina sintasa (Fromm et al., 1989); y el promotor del virus del mosaico de la escrofularia (P-FMV) como se describe en la Patente americana U.S. Pat. No. 5,378,619 y una versión mejorada del promotor FMV (P-eFMV) donde la secuencia promotora de P-FMV se duplica en tándem, el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor, un promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar, un promotor del virus del moteado amarillo de la commelina y otros promotores de virus del DNA vegetal que se sabe que se expresan en células vegetales.

Una variedad de promotores de genes vegetales que se regulan en respuesta a señales medioambientales, hormonales, químicas y/o de desarrollo se pueden usar para la expresión de un gen unido operativamente en células vegetales, incluyendo los promotores regulados por (1) calor (Callis et al., 1988), (2) luz (por ejemplo, promotor de rbcS-3A de guisante, Kuhlemeier et al., 1989; promotor de rbcS de maíz, Schaffner y Sheen, 1991; o promotor de proteína de unión a/b de clorofila, Simpson et al., 1985), (3) hormonas, tal como el ácido abscísico (Marcotte et al., 1989), (4) heridas (por ejemplo, wunl, Siebertz et al., 1989); o (5) productos químicos tales como jasmonato de metilo, ácido salicílico o Safener. También puede ser ventajoso emplear promotores específicos de órganos (por ejemplo, Roshal et al., 1987; Schernthaner et al., 1988; Bustos et al., 1989).

Ejemplos de ácidos nucleicos que pueden introducirse en las líneas de L. sativa de esta invención incluyen, por ejemplo, secuencias de DNA o genes de otra especie, o incluso genes o secuencias que se originan con o están presentes en la misma especie, pero que se incorporan células receptoras mediante métodos de ingeniería genética en lugar de técnicas clásicas de reproducción o crianza. Sin embargo, el término "exógeno'' también pretende referirse a genes que normalmente no están presentes en la célula que se está transformando, o quizás simplemente no están presentes en la forma, estructura, etc., como se encuentran en el gen o segmento de DNA transformante, o genes que normalmente están presentes y que uno desea expresar de una manera que difiere del patrón de expresión natural, por ejemplo, sobreexpresar. Por tanto, el término gen o DNA "exógeno" pretende referirse a cualquier gen o segmento de DNA que se introduce en una célula receptora, independientemente de si un gen similar ya pueda estar presente en dicha célula. El tipo de DNA incluido en el DNA exógeno puede incluir DNA que ya está presente en la célula vegetal, DNA de otra planta, DNA de un organismo diferente o DNA generado externamente, tal como una secuencia de DNA que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una secuencia de DNA que codifica una versión sintética o modificada de un gen.

En una realización de la presente invención, el locus de resistencia identificado en Lactuca serriola puede aislarse de una planta Lactuca serriola e insertarse de manera estable mediante técnicas transgénicas adecuadas como se describe anteriormente en el genoma de una planta Lactuca sativa. Preferiblemente, el transgén transferido comprende tanto el locus de resistencia que lleva el locus as-002 como el locus del marcador vinculado genéticamente como se definió anteriormente.

Como se mencionó, la presente invención se refiere a nuevas plantas de Lactuca sativa, que son resistentes a la infestación por Bremia lactucae y, por lo tanto, están protegidas del daño causado por este patógeno. La presente invención también se refiere a métodos para preparar y usar tales plantas.

Las plantas según la invención pueden obtenerse cruzando dos o más genotipos parentales, al menos uno de los cuales puede tener uno o más alelos, particularmente uno o más alelos en los correspondientes loci del gen R que contribuyen a la resistencia a Bremia lactucae, cuyo(s) alelo(s) es/son deficientes en el otro genotipo parental o que complementa al otro genotipo para obtener una planta según la invención y como se describe en la presente memoria anteriormente. Si más de un loci del gen R contribuye a la expresión de la característica de resistencia y los dos genotipos parentales originales no proporcionan el conjunto completo de alelos, se pueden incluir otras fuentes en la población de reproducción. El otro genotipo parental puede contribuir con una característica deseable que incluye la calidad del cultivo exigida por el mercado tal como, por ejemplo, mayor tamaño y peso de la cabeza, mayor rendimiento de semillas, color exterior mejorado o verde intenso, tolerancia a la sequía y al calor, así como mejores cualidades agronómicas.

En la lechuga iceberg, por ejemplo, las características deseadas comprenden una cabeza apretada y densa que se asemeja a un repollo. Las lechugas iceberg son generalmente de sabor suave, proporcionan una textura crujiente y muestran un interior blanco o amarillo cremoso. Las lechugas Batavia están cerca de las iceberg y se caracterizan por una cabeza más pequeña y menos firme. En cuanto a la lechuga butterhead, éstas se caracterizan por tener una cabeza más pequeña mucho más suave y de textura aceitosa y mantecosa. Eventualmente, la lechuga romana tiene hojas alargadas y crujientes que forman una cabeza en forma de hogaza con hojas exteriores de color verde oscuro.

Además de la calidad del cultivo, características agronómicamente importantes tales como, por ejemplo, una buena arquitectura de la planta, alta productividad y resistencias básicas a enfermedades tales como, pero no limitado a, el virus del mosaico de la lechuga (LMV), Nasonovia, pulgones de raíz, Beet Western Yellow Virus (BMYV), virus del mosaico del nabo (TMV) son otras características deseadas.

En una realización particular de la invención, se ha identificado un gen de resistencia al mildiu de la vid en una lechuga Lactuca serriola nativa, que confiere resistencia total a todas las especies de Bremia conocidas hasta la fecha (28). Se introgresó por retrocruzamiento en L. sativa cultivada. Las pruebas extensivas de la enfermedad de las plántulas de Bremia en la población F2 y F3 indicaron que la resistencia es provocada por un gen principal (semi-)dominante. Esta resistencia derivada de L. serriola ("as002") puede combinarse con otras resistencias a Bremia conocidas en la técnica como R17, R18, R36, R38 o Dm3. Se encontró que dicho as002 estaba localizado en el grupo de enlace 2.

Los genotipos parentales pueden cruzarse entre sí para producir semillas de progenie. Los genotipos parentales pueden ser líneas endogámicas desarrolladas mediante la autofecundación de plantas heterocigotas seleccionadas de campos con polinización abierta o no controlada y empleando procedimientos de selección recurrentes. Las plantas superiores se autofecundan y seleccionan en generaciones sucesivas. En las generaciones sucesivas, la condición heterocigota da paso a líneas homogéneas como resultado de la autopolinización y la selección. Con generaciones sucesivas de endogamia, la planta se vuelve cada vez más y más homocigótica y uniforme dentro de las plantas de la progenie. Por lo general, se pueden practicar de cinco a siete o más generaciones (F1 a F2; F3 a F4; F4 a F5) de autofecundación y selección de pedigrí para obtener líneas endogámicas que sean uniformes en las características de la planta y la semilla y que permanecerán uniformes bajo la autofertilización continua.

Durante la endogamia, muchos alelos indeseables en los loci heterocigotos serán reemplazados por alelos más favorables y los alelos desfavorables o no deseados serán eliminados de la progenie. Además, a través de la selección asistida por marcadores, el número de alelos favorables se puede maximizar en el sentido de que los alelos más desfavorables se identifican y se reemplazan sucesivamente por los alelos más favorables.

En un aspecto, la planta según la invención puede obtenerse mediante la introgresión de la característica de resistencia a Bremia de una planta ancestral, particularmente una planta ancestral nativa en una planta de lechuga cultivada, particularmente una planta de Lactuca sativa, más particularmente una planta de Lactuca sativa cultivada.

En una realización específica de la invención, el ancestro nativo, del que se puede obtener la característica de resistencia a Bremia lactucae, es Lactuca nativa, particularmente Lactuca serriola nativa o de una progenie o un ancestro de la misma que comprende dicho locus del gen R. La característica de resistencia según la presente invención, que confiere a una planta que expresa esta característica, resistencia a las infestaciones con el hongo Bremia lactucae, puede, como alternativa, obtenerse de la línea AS-002 de Lactuca sativa, cuya semilla representativa se deposita en NCIMB con el número de registro NCIMB 42082, o de una progenie o ancestro de la línea AS-002 que comprende la característica de resistencia a Bremia lactucae.

Por consiguiente, en una realización específica de la invención, el genotipo parental que contribuye a la característica o características de resistencia es una línea endogámica que tiene las propiedades relevantes de la invención de la línea AS-002 de Lactuca sativa depositada, es decir, sustancialmente la misma arquitectura del genoma en el locus del gen R asociado con la resistencia a Bremia, cuyas muestras de semillas se depositaron el 13 de noviembre de 2012 en NCIMB con el número de registro NCIMB 42082.

Para determinar la utilidad de la línea endogámica y su potencial para contribuir genéticamente a la progenie híbrida, se hace un cruce de prueba con otra línea endogámica y la progenie resultante se devalúa fenotípicamente.

En otra realización específica de la invención, el genotipo parental que contribuye a la(s) característica(s) de resistencia es un híbrido que tiene las propiedades relevantes de la invención de la línea AS-002 de Lactuca sativa depositada, es decir, sustancialmente la misma arquitectura del genoma en el locus del gen R asociado con la resistencia a Bremia, cuyas muestras de semillas se depositaron el 13 de noviembre de 2012 en NCIMB con el número de registro NCIMB 42082.

La línea AS-002 de Lactuca sativa resultó de un cruce de una Lactuca serriola nativa, como la donante de la característica de resistencia, con una línea endogámica de Lactuca sativa. La progenie resistente a Bremia de este cruce se cruzó con otras líneas endogámicas de diferentes antecedentes genéticos para finalmente obtener la línea AS-002 de Lactuca sativa.

En consecuencia, la línea AS-002 de Lactuca sativa o cualquier otra línea de plantas que contenga la característica de resistencia a Bremia puede usarse como material de origen para introducir dicha característica de resistencia en cualquier antecedente genético deseado para obtener una planta de lechuga que sea altamente resistente a las infestaciones con el hongo del género Bremia, más particularmente a las infestaciones con Bremia lactucae, puede contener además una o más características deseables tales como las características de calidad del cultivo exigidos por el mercado. Además de la calidad del cultivo, características agronómicamente importantes tales como, por ejemplo, una buena arquitectura de la planta, alta productividad y resistencias básicas a patógenos relevantes tales como el virus del mosaico de la lechuga (LMV), Nasonovia, pulgones de raíz, virus del amarilleo occidental de la remolacha (BMYV), virus del mosaico del nabo (TMV) son otras características deseadas.

Basándose en la descripción de la presente invención, el experto en la materia que esté en posesión de la línea AS-002 de Lactuca sativa, una muestra de la cual se haya depositado en NCIMB Ltd con el número de registro NCIMB 42082 o de una progenie o antecesor de la misma que contenga un locus del gen R en el grupo de enlace asociado con la resistencia a Bremia, como se describe en la presente memoria, no tiene dificultad para transferir la característica de resistencia a Bremia de la presente invención a otras plantas de lechuga de varios tipos usando técnicas de reproducción bien conocidas en la técnica. La característica de la presente invención puede transferirse, por ejemplo, a plantas de lechuga de los siguientes grupos de cultivos: butterhead, lechuga china, crisphead (formas Iceberg), losseleaf, Romana, summer crisp. Por consiguiente, en una realización, una planta de la presente invención es una planta de L. sativa capaz de resistir infestaciones con Bremia, planta que es una planta del grupo de cultivos seleccionado del grupo que consiste en butterheas, lechuga china, crisphead (formas Iceberg), losseleaf, Romana y summer crisp. En una realización de la invención, las plantas de lechuga antes mencionadas se cultivan para la producción de semillas (híbridas) o de lechuga comercial.

Por consiguiente, en otra realización, la presente invención describe un método para transferir la característica de resistencia a Bremia lactucae según la presente invención a una planta de lechuga que carece de dicha característica que comprende a) obtener una planta que comprende dicha característica; b) cruzarla con una planta que carece de dicha característica; c) obtener plantas del cruce de la etapa b); d) seleccionar una planta de la etapa c) que sea capaz de resistir infestaciones con Bremia lactucae según la presente invención. En una realización, el método comprende además e) retrocruzar una planta resultante de la etapa d) con una planta de lechuga, y f) seleccionar una planta de lechuga que sea capaz de resistir infestaciones con Bremia lactucae según la presente invención. En una realización, el método comprende además obtener una planta de lechuga endogámica, que es capaz de resistir infestaciones con Bremia según la presente invención y, en una realización, el método comprende además cruzar dicha planta de lechuga endógama con otra planta de lechuga para producir una planta de lechuga híbrida, que es capaz de resistir infestaciones con Bremia lactucae según la presente invención. En una realización, se selecciona una planta de lechuga para determinar la presencia o ausencia del hongo, como se describe en la presente memoria. En una realización preferida, la planta de la etapa a) que comprende dicha característica es la línea AS-002 de Lactuca sativa, cuya semilla representativa está depositada en NCIMB con el número de registro NCIMB 42082, o una progenie o ancestro de dicha planta.

En ciertas realizaciones de la invención, se usa un Ensayo de Resistencia estandarizado, tal como el que se describe en el Ejemplo 1 de la presente memoria a continuación, para determinar la presencia o ausencia de resistencia contra Bremia lactucae en las plantas de la progenie resultantes de uno de los cruces anteriores y para seleccionar aquellas plantas de la progenie para la reproducción posterior que son resistentes a Bremia lactucae.

Como alternativa, se puede emplear la reproducción asistida por marcadores para identificar aquellos individuos que contienen el locus de resistencia a Bremia lactucae y/o loci de marcadores flanqueantes o loci de marcadores vinculados genéticamente a los mismos, como se describe en la presente memoria.

La selección asistida por marcadores ya puede usarse en las primeras fases del desarrollo endogámico, a menudo en combinación con métodos de selección que se basan en gran medida en características fenotípicas que pueden determinarse visualmente y están relacionadas con índices clave de rendimiento tales como, por ejemplo, el vigor de la planta, longitud de entrenudos, ramificaciones, resistencia a insectos u hongos, tal como resistencia a infestaciones de Bremia, resistencias a virus, etc., que son relevantes para la idoneidad de la planta para ser utilizada en la producción de híbridos comerciales. La selección también puede basarse en marcadores moleculares, que pueden o no estar vinculados a características de interés.

En particular, la selección asistida por marcadores se puede aplicar en combinación con o seguida de una selección fenotípica para identificar aquellos individuos en los que todos los loci relevantes de la invención descritos anteriormente en la presente memoria tienen genotipos homocigóticos favorables.

Hay varios tipos de marcadores moleculares que se pueden usar en la selección asistida por marcadores, incluyendo, pero no limitado a, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), amplificación aleatoria de DNA polimórfico (RAPD), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción amplificados (AFLP), repeticiones de secuencia simple (SSR) y polimorfismo de nucleótido único SNPs.

El RFLP implica el uso de enzimas de restricción para cortar el DNA cromosómico en sitios de restricción cortos específicos, los polimorfismos resultan de duplicaciones o deleciones entre los sitios o mutaciones en los sitios de restricción.

La RAPD utiliza la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de baja rigurosidad con cebadores individuales de secuencia arbitraria para generar matrices específicas de cepa de fragmentos de DNA anónimos. El método requiere solo pequeñas muestras de DNA y analiza una gran cantidad de loci polimórficos.

El AFLP requiere la digestión del DNA celular con enzimas de restricción antes de usar PCR y nucleótidos selectivos en los cebadores para amplificar fragmentos específicos. Con este método, utilizando técnicas de electroforesis para visualizar los fragmentos obtenidos, se pueden medir hasta 100 loci polimórficos por combinación de cebadores y solo se requiere una pequeña muestra de DNA para cada prueba.

El análisis SSR se basa en secuencias de microsatélites de DNA (repetición corta) que están ampliamente dispersas por todo el genoma de los eucariotas, que se amplifican selectivamente para detectar variaciones en repeticiones de secuencias simples. Solo se requieren pequeñas muestras de DNA para un análisis SSR. Los SNPs usan ensayos de extensión de PCR que detectan mutaciones puntuales de manera eficiente. El procedimiento requiere poco DNA por muestra. Uno o dos de los métodos anteriores se pueden utilizar en un programa de reproducción típico de selección asistida por marcadores.

El método más preferido para lograr la amplificación de fragmentos de nucleótidos que abarcan una región polimórfica del genoma de la planta emplea la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") ( Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quaint. Biol. 51:263273 (1986)), utilizando pares de cebadores que incluyen un cebador directo y un cebador inverso que son capaces de hibridarse con las secuencias proximales que definen un polimorfismo en su forma de doble cadena.

Se pueden emplear métodos alternativos para amplificar fragmentos, tales como la "reacción en cadena de la ligasa" ("^pC^r ") (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 189 193 (1991)), que utiliza dos pares de sondas de oligonucleótidos para amplificar exponencialmente una diana específica. Las secuencias de cada par de oligonucleótidos se seleccionan para permitir que el par para hibridar con secuencias contiguas de la misma cadena de la diana. Dicha hibridación forma un sustrato para una ligasa dependiente de la plantilla. Al igual que con la PCR, los productos resultantes sirven como plantilla en ciclos posteriores y se obtiene una amplificación exponencial de la secuencia deseada.

La LCR se puede realizar con oligonucleótidos que tienen las secuencias proximal y distal de la misma cadena de un sitio polimórfico. En una realización, cualquiera de los oligonucleótidos se diseñará para incluir el sitio polimórfico real del polimorfismo. En dicha realización, las condiciones de reacción se seleccionan de manera que los oligonucleótidos puedan ligarse entre sí solo si la molécula diana contiene o carece del nucleótido específico que es complementario al sitio polimórfico presente en el oligonucleótido. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden seleccionarse de manera que no incluyan el sitio polimórfico (véase, Segev, PCT Application WO 90/01069).

Otro método que puede emplearse alternativamente es el "Oligonucleotide Ligation Assay" ("OLA") (Landegren et al., Science 241:10771080 (1988 )). El protocolo OLA utiliza dos oligonucleótidos que están diseñados para ser capaces de hibridarse con secuencias contiguas de una sola cadena de una diana. El OLA, como LCR, es particularmente adecuado para la detección de mutaciones puntuales. Sin embargo, a diferencia de LCR, OLA da como resultado una amplificación "lineal" en lugar de exponencial de la secuencia diana.

Otro método que puede emplearse alternativamente es el "ensayo invasor" que utiliza una endonucleasa de aleta específica de estructura (FEN) para escindir un complejo tridimensional formado por hibridación de oligonucleótidos superpuestos específicos de alelo para dirigir el DNA que contiene un sitio de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). La hibridación del oligonucleótido complementario al alelo de SNP en la molécula diana desencadena la escisión del oligonucleótido por la cleavasa, una FEN termoestable. La escisión se puede detectar mediante varios enfoques diferentes. Más comúnmente, el producto de escisión desencadena una reacción de escisión secundaria en un casete de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para liberar una señal fluorescente. Como alternativa, la escisión se puede detectar directamente mediante el uso de sondas de polarización de fluorescencia (FP) o mediante espectrometría de masas. La reacción de escisión invasiva es altamente específica, tiene una baja tasa de fallos y puede detectar cantidades de zeptomol del DNA diana. Si bien el ensayo se ha utilizado tradicionalmente para interrogar a un SNP en una muestra por reacción, se han probado enfoques novedosos basados en microesferas o chips para hacer que este ensayo eficiente y preciso se adapte a la multiplexación y al genotipado de SNP de alto rendimiento.

Nickerson et al. han descrito un ensayo de detección de ácido nucleico que combina atributos de PCR y OLA (Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 89238927 (1990)). En este método, la PCR se utiliza para lograr la amplificación exponencial del DNA diana, que después se detecta mediante OLA.

También se conocen esquemas basados en la ligación de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de un ácido nucleico que tiene la secuencia del "dioligonucleótido" resultante, amplificando así el dioligonucleótido (Wu et al., Genomics 4:560 569 (1989)), y puede adaptarse fácilmente a los fines de la presente invención. En una realización, un marcador molecular es un fragmento de DNA amplificado por PCR, por ejemplo, un marcador de SSR o un marcador de RAPD. En una realización, la presencia o ausencia de un fragmento de DNA amplificado es indicativa de la presencia o ausencia de la propia característica o de un alelo particular de la característica. En una realización, una diferencia en la longitud de un fragmento de DNA amplificado es indicativa de la presencia de un alelo particular de una característica y, por lo tanto, permite distinguir entre diferentes alelos de una característica.

En una realización específica de la invención, se usan marcadores de repetición de secuencia simple (SSR) para identificar alelos relevantes para la invención en las plantas parentales y/o sus ancestros, así como en las plantas de la progenie resultantes de un cruce de dichas plantas parentales. Las repeticiones de secuencia simple son secuencias de DNA cortas y repetidas y están presentes en los genomas de todos los eucariotas y consisten de varias a más de cien repeticiones de un motivo de nucleótido dado. Dado que el número de repeticiones presentes en una localización particular del genoma a menudo difiere entre las plantas, los SSRs se pueden analizar para determinar la ausencia o presencia de alelos específicos.

En otra realización de la invención, los marcadores de SNP se usan para identificar alelos relevantes para la invención en las plantas parentales y/o sus ancestros, así como en las plantas de la progenie resultantes de un cruce de dichas plantas parentales.

En la presente invención, se puede usar un marcador o un conjunto de dos o más marcadores que comprenden un par de cebadores de oligonucleótidos de PCR que consisten en un cebador directo y un cebador inverso, cebadores que conducen a un producto de amplificación en una reacción de PCR que muestra un peso molecular o una secuencia de nucleótidos, que es esencialmente idéntica o puede considerarse como un alelo de un producto de amplificación de PCR correspondiente que se puede obtener a partir de la línea AS-002 de Lactuca sativa en una reacción de PCR con pares de cebadores idénticos.

Preferiblemente, dicho marcador tiene un 100 % de homología con una secuencia elegida de SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2. Más preferiblemente, dicho marcador es un marcador de SNP

En una primera etapa, se obtienen muestras de DNA o cDNA a partir de material vegetal adecuado, tal como tejido de hoja, por extracción de DNA o RNA utilizando técnicas conocidas. Los cebadores que flanquean una región que contiene SSR dentro del locus del gen R relevante para la invención antes o dentro de una región vinculada al mismo se usan después para amplificar la muestra de DNA usando el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocido por los expertos en la técnica. Básicamente, el método de amplificación por PCR implica el uso de un cebador o un par de cebadores que comprenden dos secuencias cebadoras oligonucleotídicas cortas que flanquean el segmento de DNA a amplificar o secuencias adaptadoras ligadas a dicho segmento de DNA. Los ciclos repetidos de calentamiento y desnaturalización del DNA son seguidos por la hibridación de los cebadores a sus secuencias complementarias a bajas temperaturas, y la extensión de los cebadores hibridados con polimerización del DNA. Los cebadores se hibridan con cadenas opuestas de las secuencias diana de DNA. La hibridación se refiere a la hibridación de cadenas de DNA complementarias, donde complementario se refiere a la secuencia de los nucleótidos de manera que el nucleótido de una cadena puede unirse con el nucleótido de la cadena opuesta para formar estructuras de doble cadena. Los cebadores están orientados de manera que la síntesis de DNA por la polimerasa procede bidireccionalmente a través de la secuencia de nucleótidos entre los cebadores. Este procedimiento duplica efectivamente la cantidad de ese segmento de DNA en un ciclo. Debido a que los productos de PCR son complementarios y capaces de unirse a los cebadores, cada ciclo sucesivo duplica la cantidad de DNA sintetizado en los ciclos anteriores. El resultado de este procedimiento es la acumulación exponencial de un fragmento diana específico, que es aproximadamente 2<n>, donde n es el número de ciclos.

A través de la amplificación por PCR se realizan millones de copias del segmento de DNA flanqueado por los cebadores. Las diferencias en el número de secuencias repetidas o inserciones o deleciones en la región que franquea dichas repeticiones, que se localizan entre los cebadores flanqueantes en diferentes alelos, se reflejan en variaciones de longitud de los fragmentos de DNA amplificados. Estas variaciones pueden detectarse, por ejemplo, separando electroforéticamente los fragmentos de DNA amplificados en geles o utilizando un secuenciador capilar. Al analizar el gel o el perfil, se puede determinar si la planta contiene el alelo deseado en un estado homocigoto o heterocigoto o si el alelo deseado o no deseado está ausente del genoma de la planta.

Como alternativa, la presencia o ausencia del alelo deseado puede determinarse mediante PCR en tiempo real utilizando colorantes de DNA de doble cadena o el método de sonda informadora fluorescente. Debe enfatizarse que lo mencionado anteriormente se proporciona simplemente como un ejemplo y de ninguna manera debe interpretarse como una limitación de la presente invención.

El análisis de marcadores se puede realizar temprano en el desarrollo de la planta utilizando muestras de DNA extraídas del tejido de la hoja de plantas muy jóvenes o de semillas. Esto permite identificar plantas con una composición genética deseable al comienzo del ciclo de reproducción y descartar las plantas que no contienen los alelos deseados relevantes para la invención antes de la polinización, reduciendo así el tamaño de la población de reproducción y reduciendo los requisitos de fenotipado.

Además, mediante el uso de marcadores moleculares, podría ser posible distinguir entre plantas homocigotas que portan dos copias del alelo deseado relevante para la invención ('alelo as-002') en el locus cualitativo de resistencia a Bremia y plantas heterocigotas que portan solo una copia y plantas que no contienen ninguna copia del alelo o alelos favorables.

Por lo tanto, pueden desarrollarse marcadores alternativos mediante métodos conocidos por los expertos y usarse para identificar y seleccionar plantas con un alelo o un conjunto de alelos de un locus o loci del gen R según la presente invención y como se describe en la presente memoria anteriormente.

Por ejemplo, los expertos en la técnica pueden obtener la secuencia de nucleótidos del producto de amplificación obtenido en la amplificación por PCR usando un par de cebadores de oligonucleótidos de PCR que consisten en un cebador directo y un cebador inverso y se pueden diseñar nuevos cebadores o pares de cebadores en base a la nueva secuencia de nucleótidos determinada del producto de amplificación por PCR. En consecuencia, los marcadores que se pueden usar en la presente invención también se pueden usar en la identificación y/o el desarrollo de marcadores nuevos o adicionales asociados con el locus de resistencia a Bremia, que a su vez se pueden usar en la reproducción asistida por marcadores y/o la búsqueda de recombinantes que flanquean el locus de resistencia a Bremia lactucae, y/o mapeo fino, y/o clonación del locus de resistencia a Bremia lactucae.

Existen varios métodos o enfoques disponibles, conocidos por los expertos en la materia, que pueden utilizarse para identificar y/o desarrollar marcadores en desequilibrio de ligamiento y/o enlazados y/o localizados en la región de interés, así como marcadores que representan las mutaciones causales reales que subyacen al gen R. Como se usa en la presente memoria, "desequilibrio de ligamiento" es la asociación no aleatoria de alelos en dos o más loci, que pueden estar o no en el mismo cromosoma. Sin ser totalmente exhaustivos, algunos enfoques, conocidos por los expertos en la materia, incluyen:

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques de PCR para identificar otra secuencia en la región de interés: secuencias de cebadores como se describen en la presente memoria y/o marcador/-secuencias de genes (candidatos) (o parte de las mismas) que pueden determinarse usando las secuencias de cebadores como se describen se pueden usar como cebadores de amplificación (PCR) para amplificar una secuencia de ácido nucleico/un gen que flanquea y/o se vincula y/o se asocia con y/o es específico para la región del locus de resistencia a Bremia de una muestra de ácido nucleico genómico y/o RNA o muestra de cDNA o grupo de muestras aislado o no de un tejido vegetal específico y/o después de un tratamiento específico de la planta y de pimiento o, en principio, de cualquier otro organismo con suficiente homología.

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques de PCR para identificar otra secuencia en la región de interés: las secuencias de nucleótidos/genes de uno o más marcadores pueden determinarse después de que los cebadores internos para dichas secuencias marcadoras puedan diseñarse y usarse para determinar aún más la secuencia flanqueante /genes dentro de la región del locus de resistencia a Bremia y/o vinculados genéticamente y/o asociados con la característica.

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques de mapeo y/o mapeo comparativo para identificar marcadores en la(s) misma(s) región(es) (posicionamiento del locus de resistencia a Bremia en otros mapas): basado en información posicional y/o información del marcador como se describe en la presente memoria, marcadores, de cualquier tipo, puede identificarse mediante enfoques de mapeo genético, eventualmente (si ya es necesario) mediante el posicionamiento de los marcadores descritos (mediante mapeo genético o extrapolación basada en marcadores comunes en todos los mapas) en mapas genéticos (de alta densidad), y/o mapas genéticos integrados o de consenso. Los marcadores ya conocidos y/o nuevos marcadores ligados genéticamente y/o colocados en las proximidades de los marcadores descritos y/o la región del locus de resistencia a Bremia pueden identificarse y/u obtenerse y eventualmente usarse en el mapeo (fino) y/o clonación del locus de resistencia a Bremia y/o aplicaciones de reproducción MAS.

- uso de secuencias/marcadores descritos en enfoques 'in-silico' para identificar secuencias/marcadores/genes (candidatos) adicionales: secuencias de cebadores como se describen en la presente memoria y/o secuencias de marcadores/genes (candidatos) (o parte de las mismas) que se pueden determinar usando las secuencias de los cebadores tal como se describen en la presente memoria o basados en los marcadores vinculados se pueden utilizar en métodos 'in-silico' para buscar secuencias o bases de datos de proteínas (por ejemplo, BLAST) para secuencias/genes/y/o diversidad alélica flanqueantes y/o homologas (adicional) (tanto secuencias genómicas y/o de cDNA o incluso proteínas como originadas a partir de pimiento y/o cualquier otro organismo) vinculadas genéticamente y/o asociadas con las características descritas en la presente memoria y/o localizadas en la región del locus de resistencia a Bremia.

- uso de secuencias/marcadores descritas en enfoques de mapeo físico (posicionamiento del locus de resistencia a Bremia en el mapa físico o secuencia genómica): secuencias de cebadores como se describe en la presente memoria y/o secuencias de genes/marcadores (o parte de las mismas) que pueden determinarse usando las secuencias de cebadores tal como se describe en la presente memoria o utilizando otros marcadores genéticamente vinculados a los marcadores descritos en la presente memoria y/o localizados en la región del locus de resistencia a la Bremia, se puede colocar en un mapa físico y/o en la secuencia del genoma (completa) en principio de cualquier organismo con homología suficiente para identificar secuencias/marcadores/genes (candidatos) aplicables en (mapeo fino) y/o clonación del locus de resistencia a Bremia y/o aplicaciones de reproducción MAS.

- uso de secuencias/marcadores descritos para posicionar el locus de resistencia de Bremia lactucae en otros mapas (físicos) o genomas (en especies de lechuga, otras especies de Asteraceae pueden usarse como especies modelo): secuencias de cebadores como se describen en la presente memoria y/o secuencias de marcadores/genes (o parte de las mismas) que puede determinarse usando las secuencias de los cebadores como se describe en la presente memoria puede usarse en enfoques de mapeo genómico o de síntesis comparativo para identificar regiones homólogas y secuencias/genes (candidatos) homólogas y/u ortólogas vinculados genéticamente y/o localizados en la región del locus de resistencia a Bremia lactucae y aplicable en (mapeo fino) y/o clonación del locus de resistencia a Bremia lactucae y/o aplicaciones de reproducción MAS.

- uso de secuencias/marcadores descritos para seleccionar a los individuos apropiados que permitan la identificación de marcadores en la región de interés mediante enfoques genéticos: las secuencias de cebadores y/o marcadores como se describen en la presente memoria pueden usarse para seleccionar individuos con alelos diferentes/de contraste que, por ejemplo, en enfoques de asociación genética y/o análisis de segregantes en bruto (BSA, Michelmore et al., PNAS, 88, 9828-9832, 1991) pueden usarse para identificar marcadores/genes en la región específica de interés y/o asociados o genéticamente vinculados a las características descritas.

Para el genotipado, el mapeo o el mapeo de asociación, el DNA se extrae de material vegetal adecuado tal como, por ejemplo, tejido de hojas. En particular, se recogen masas de hojas de una pluralidad de plantas. Las muestras de DNA se genotipifican utilizando una pluralidad de SSRs polimórficos, SNPs o cualquier otro tipo de marcador adecuado que cubra todo el genoma de la lechuga.

El análisis conjunto de los datos genotípicos y fenotípicos se puede realizar usando software estándar conocido por los expertos en la técnica. Las introducciones de plantas y el germoplasma pueden examinarse en busca de los alelos en el locus de resistencia a Bremia lactucae correspondiente descrito en la presente memoria, basándose en la(s) secuencia(s) de nucleótidos del marcador(es) en el locus/loci del marcador vinculado a dicho locus de resistencia a Bremia lactucae o cualquier otro marcador que se sabe que está localizado en el cromosoma responsable de la resistencia a Bremia lactucae, y el peso molecular del (de los) alelo(s) utilizando una o más de las técnicas descritas en la presente memoria o conocidas por los expertos en la técnica.

La secuencia de ácido nucleico de los marcadores, los marcadores vinculados o el locus de resistencia a Bremia lactucae puede determinarse mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende dicho locus de resistencia a Bremia lactucae o una parte del mismo que confiere resistencia puede aislarse de una planta donante resistente a Bremia lactucae mediante fragmentación del genoma de dicha planta y selección de aquellos fragmentos que albergan uno o más marcadores indicativos de dicho locus de resistencia a Bremia lactucae. Posteriormente, o alternativamente, las secuencias marcadoras (o partes de las mismas) indicativas de dicho locus de resistencia pueden usarse como cebadores de amplificación (PCR), para amplificar (una) secuencia(s) de ácido nucleico que comprende dicho locus de resistencia de una muestra de ácido nucleico genómico o un fragmento de genoma obtenido de dicha planta. La secuencia de nucleótidos del locus de resistencia a Bremia lactucae, y/o de cualquier marcador adicional comprendido en el mismo, puede obtenerse mediante métodos de secuenciación estándar.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislado (preferiblemente DNA pero sin limitarse a DNA) que comprende un locus de resistencia a Bremia de la presente invención, o una parte del mismo que confiere resistencia. Los marcadores identificados pueden usarse para la identificación y el aislamiento de uno o más marcadores o genes de lechuga u otros cultivos vegetales, particularmente cultivos de Asteraceae que están vinculados o codifican la resistencia a la Bremia.

La invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes que ilustran aún más la invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención ni deben interpretarse como tales.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Prueba de enfermedad

Las pruebas se realizan en una cámara climática con alta humedad. La duración del día es de 16 horas y durante el día la temperatura es de 18°C y la RH aproximadamente del 85%. Durante la noche la temperatura es de 15°C y la RH ronda el 100%. Antes de la inoculación de una prueba, las esporas del patógeno Bremia se multiplican en variedades susceptibles. La elección de una variedad susceptible para un aislado de Bremia se hace a partir del conjunto oficial de huéspedes diferenciales y de un conjunto interno. Las pruebas enfermedad para la resistencia a Bremia se realizaron utilizando todas las cepas o aislados de Bremia actualmente conocidos (BI01-BI28). El rendimiento de AS-002 se comparó con las variedades de Lactuca actualmente conocidas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una planta Lactuca sativa resistente a Bremia lactucae, que comprende un locus de resistencia a Bremia que está vinculado a un determinante genético, dicho determinante genético puede obtenerse a partir del genoma de una planta de Lactuca nativa, preferiblemente a partir del genoma de Lactuca serriola,

a. en el que dicho locus de resistencia es un locus de amplio espectro, que proporciona resistencia a las especies Bl: 1 a Bl:28 de Bremia lactucae, dicho locus de resistencia se co-segrega con una secuencia que tiene al menos un 99% de homología con SEQ ID No. 1 y con una secuencia que tiene al menos un 99% de homología con SEQ ID No. 2, y en donde

b. dicha planta se puede obtener a través del cruce de AS-002 de Lactuca sativa, cuya semilla representativa se ha depositado en NCIMB Ltd. con el número de registro NCIMB 42082, y cualquier otra planta de Lactuca sativa susceptible, seguido de la selección de plantas que muestren dicha resistencia a Bremia lactucae.

2. La semilla de

a. una planta según la reivindicación 1, en la que el locus de resistencia está presente en un estado homocigoto; o

b. una planta de Lactuca sativa como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende el determinante genético que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae; o

c. una planta con antecedentes genéticos de NCIMB 42082, que comprende el determinante genético que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae,

caracterizado por que dicho determinante genético que contribuye a la resistencia a Bremia lactucae proporciona resistencia a las especies Bl: 1 a Bl:28 de Bremia lactucae.

3. Partes de plantas de una planta según la reivindicación 1, pero sin limitarse a ellas, semillas vegetales, órganos vegetales tales como, por ejemplo, una raíz, tallo, hoja, capullo de la flor o embrión, óvulos, microsporas de polen, células vegetales, tejido vegetal, cultivos de células vegetales tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diversas etapas de desarrollo, que todavía muestran resistencia a Bremia, particularmente cuando se cultiva en una planta como en la reivindicación 1.

4. Partes de plantas según la reivindicación 3, en las que dichas partes de plantas son cogollos u hojas de plantas de lechuga cultivadas según la reivindicación 1.

5. Un marcador de DNA vinculado a y que se co-segrega con un locus de resistencia a Bremia lactucae en una planta de Lactuca sativa, caracterizado por que dicho marcador tiene una secuencia según SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2.

6. El uso de marcadores con secuencia de DNA SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2 que se vinculan y se co-segregan con un locus de resistencia a Bremia lactucae en una planta de Lactuca sativa para identificar plantas de lechuga con una resistencia a las especies BL:1 a BL:28 de Bremia lactucae.