CN106244700B - 一种利用ssr标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法 - Google Patents

一种利用ssr标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用SSR标记技术对白蜡属绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法。该方法以绒毛白蜡和美国红梣双亲及其杂交种的基因组DNA为模版，利用构建的绒毛白蜡转录组数据库，设计SSR引物。筛选出多态性高、稳定且清晰、具有双亲互补带型SSR标记，对杂交种的植株进行鉴定，得到1对合适的SSR标记，该标记在杂交种后代中扩增出一条与父本相同的特异条带，具有父本特异条带的杂交种即为真实杂交种。本发明方法可以快速准确的鉴定绒毛白蜡和美国红梣杂交种的真实性，为白蜡属不同亲本组合杂交种的鉴定奠定了良好的基础。

Description

一种利用SSR标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快 速鉴定的方法
技术领域
本发明属于植物杂交种鉴定技术领域，具体涉及一种利用SSR标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法。
背景技术
绒毛白蜡(F.velutina Torr.)和美国红梣(F.pennsylvanica)为木犀科(Oleaceae)白蜡属落叶乔木，是我国从美国成功引种的白蜡属树种，由于其抗风、抗烟尘、耐盐碱、观赏性强，是我国盐碱地造林和城市园林绿化的重要树种。这些引进的白蜡属树种由于适应性以及观赏性等具有较大的优势，很快在我国北方地区尤其是盐碱地造林中占据了举足轻重的地位，其育种工作也随即展开。但白蜡属树种的品种改良研究进展缓慢，目前主要的育种方法仍然是传统的选择育种。2007年以来，东北林业大学报道了一些关于水曲柳杂交及杂交胚培养的研究。山东省林业科学研究院从20世纪80年代开始白蜡属种质资源的收集和优株选育工作，并获得7个新品种，课题组人员在此研究基础上，2010年以来开始探索用人工杂交育种方法培育白蜡新品种。以选育的耐盐绒毛白蜡和速生美国红梣的新品种为材料，研究了绒毛白蜡与美国红梣种间杂交及其绒毛白蜡无性系间的杂交，整合白蜡属的优良基因资源，使不同树种的优良性状相互补充，利用杂种优势筛选出杂种Fl基因型的优良植株，有望获得速生、耐盐碱性更强、品质更优良、杂种优势更明显的优良新品种，以满足种苗生产、造林绿化的需要，为今后更好开展白蜡属杂交育种提供依据。
在研究中发现白蜡属植物存在自交结实率的现象，有可能在杂交种后代中存在自交苗，为避免在育种选择和遗传分析中出现误差，因此必须准确鉴定真假杂交种植株。表型性状是鉴定杂交种的重要形态学标记，但是耗时、费力，且许多形态学特征受环境等因素的影响而不稳定，不利于杂交种的快速鉴定。然而，经检索目前国内外尚无利用SSR标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用SSR标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法。
本发明所述利用SSR标记技术对白蜡属绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法，步骤是：(1)待测的绒毛白蜡和/或美国红梣亲本及其杂交种植株基因组DNA的提取；(2)SSR-PCR反应；(3)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；(4)银染；(5)杂交种鉴定；
其中：
步骤(1)所述基因组DNA的提取是对待测的绒毛白蜡“鲁蜡3号”、美国红梣“鲁蜡5号”亲本及其杂交种植株提取DNA。
步骤(2)所述的SSR-PCR反应的方法是：
SSR-PCR反应体系为10μl：DNA 1μL(20ng·μL-1)，10×Buffer 1μL，25mmol·L-1的MgCl2 1.25μL，10mmol·L-1的dNTP 0.2μL，10μmol·L-1的鉴定绒毛白蜡和美国红梣杂交种的SSR标记特异上下游引物各0.25μL，10U·μL-1的ExTaq聚合酶0.05μL，灭菌水6μL；
反应程序：94℃预变性4min；94℃变性15s，60℃退火15s，每循环降低0.7℃，72℃延伸30s，15个循环；之后94℃变性15s，49.5℃退火15s，72℃延伸30s，15个循环；最后72℃延伸30min，4℃保存；
其中所述鉴定绒毛白蜡和美国红梣杂交种的SSR标记特异上下游引物为：
Primer1-F:5'-TAATAGATAAGCCTGCCTTTCCC-3'
Primer1-R:5'-ATTTGACAAGTTGTGGGTTCAAA-3'。
步骤(3)所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法是：
PCR产物用8％的非变性PAGE电泳检测，具体步骤如下：
(1)清洗玻璃板：用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用双蒸水擦洗两遍，再用无水酒精擦洗，晾干。
(2)组装胶板：用无屑纸巾在晾干的长板上均匀涂抹0.2％Binding Silane，在短板上均匀涂抹2％Repel Silane。干燥5min之后，将长板涂有Binding Silane的一面与短板涂有Repel Silane的一面相扣，两侧用夹子夹紧，水平放置。
(3)灌胶：取21.6mL双蒸水，加入8mL 5×TBE，10.8ml的8％非变性胶，加入100μLTEMED和1000μL 10％的过硫酸氨(APS)，轻轻混匀，把胶沿灌胶口灌进，灌胶过程中注意防止出现气泡。然后插入梳子，静置使其聚合60min。
(4)加缓冲液：取出梳子，将聚合好的胶板组装到电泳槽上，然后将电泳槽连好导线并将导线接入电泳仪中，再将干净的1×TBE缓冲液加入电泳槽，注意让缓冲液没过梳子孔。插上电源，在60W恒功率预电泳30min。
(5)点样：用移液枪反复冲洗加样孔，然后将PCR产物加上溴酚蓝7μL点样，每一个加样孔点样量为1.5μl，Marker为1.5μl，电泳缓冲液为1×TBE。
(7)电泳：60W恒功率电泳150min。
步骤(4)所述银染即硝酸银法染色的具体步骤是：
(1)脱色：将玻璃板放入0.5％的冰醋酸，在转速为60rpm的摇床上轻摇12min至胶完全脱色，
(2)染色：加入染色液，在转速为60rpm的摇床上轻摇染色12min；
(3)漂洗：倒掉染色液后，加入漂洗液清洗30s,倒掉后再加入800ml双蒸水，进行第二次漂洗，洗30s后倒掉；
(4)显影：把胶板迅速转移至显影液中，轻摇，直至产物条带出现；
(5)观察照相，记录。
步骤(5)所述杂交种鉴定的方法是：利用绒毛白蜡和美国红梣为亲本培育出的杂交群体，在杂交后代的扩增产物中，若杂交植株中具有一个大小为250bp与父本相同的特异条带，即可确定为真实杂交种。
上述利用SSR标记技术对白蜡属绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法中，所述的绒毛白蜡优选是绒毛白蜡“鲁蜡3号”，所述的美国红梣优选是美国红梣“鲁蜡5号”。
本发明方法利用SSR分子标记对绒毛白蜡和美国红梣杂交种真实性进行鉴定，以PCR为基础的分子生物学技术是快速检测生物基因组差异的重要方法之一，直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到。具有快速、准确、重复性好，不受季节、环境因素的影响，且取材少，在苗期可以进行选择，从而大大提高育种效率。
本发明公开的利用SSR分子标记技术快速鉴定绒毛白蜡和美国红梣种间杂交种的方法是利用绒毛白蜡转录组测序获得的数据(原始数据已上传至National Center forBiotechnology Information，NCBI，登录号为SRR1037160。)设计SSR引物，利用开发得到的多态性高，必须是母本和父本都能扩增出差异明显的特征带，扩增条带清晰、非特异片段少、重复性好的SSR引物对鲁蜡3号和鲁蜡5号2个亲本基因组DNA及杂交种植株的基因组DNA进行PCR扩增，鉴定采用具有父本特异条带的杂交种即为真杂交种。本发明操作简便、重复性好、通用性好、不受环境因素的影响、可快速准确的鉴定子代的真实性。
附图说明
图1：8对引物在2个亲本中的扩增效果。
其中：M：1500bp DNA Marker；R：鲁蜡3号；H：鲁蜡5号。
图2：S81对亲本及杂种单株的扩增结果。
其中：M：Mark；H：父本Male Line；R：母本Female Line；169-175杂种箭头所指为特异带。
图3：S81对亲本及杂种单株的扩增结果。
其中：M：Mark；H：父本株Male Line；R：母本株Female Line；1-240杂种hybridseeds。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
一、材料与方法
1、材料
绒毛白蜡“鲁蜡3号”、美国红梣“鲁蜡5号”亲本及其杂交种植株为材料。
2、基因组DNA的提取
按照TIANGEN生产的植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，商标号DP305-03)的步骤提取：
1)取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨；
2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
3)加入700ul氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；
4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700ul缓冲液GP2，充分混匀；
5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃掉废液。(吸附柱容积700ul左右，可分次加入离心)；
6)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
7)向吸附柱CB3加入600ul漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8)重复操作步骤7；
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
3、SSR-PCR反应体系
利用筛选得到的鉴定绒毛白蜡和美国红梣杂交种的SSR标记特异引物S81：
Primer1-F:5'-TAATAGATAAGCCTGCCTTTCCC-3'
Primer1-R:5'-ATTTGACAAGTTGTGGGTTCAAA-3'
进行杂交种的鉴定；SSR-PCR反应体系为10μl：DNA 1μL(20ng·μL-1)，10×Buffer1μL，25mmol·L-1的MgCl2 1.25μL，10mmol·L-1的dNTP 0.2μL，10μmol·L-1的上下游引物各0.25μL，10U·μL-1的ExTaq聚合酶0.05μL，灭菌水6μL。
反应程序：94℃预变性4min；94℃变性15s，60℃退火15s，每循环降低0.7℃，72℃延伸30s，15个循环；之后94℃变性15s，49.5℃退火15s，72℃延伸30s，15个循环；最后72℃延伸30min，4℃保存。
4、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
PCR产物用8％的非变性PAGE电泳检测，具体步骤如下：
(1)清洗玻璃板：用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用双蒸水擦洗两遍，再用无水酒精擦洗，晾干。
(2)组装胶板：用无屑纸巾在晾干的长板上均匀涂抹0.2％Binding Silane，在短板上均匀涂抹2％Repel Silane。干燥5min之后，将长板涂有Binding Silane的一面与短板涂有Repel Silane的一面相扣，两侧用夹子夹紧，水平放置。
(3)灌胶：取21.6mL双蒸水，加入8mL 5×TBE，10.8ml的8％非变性胶，加入100μLTEMED和1000μL 10％的过硫酸氨(APS)，轻轻混匀，把胶沿灌胶口灌进，灌胶过程中注意防止出现气泡。然后插入梳子，静置使其聚合60min。
(4)加缓冲液：取出梳子，将聚合好的胶板组装到电泳槽上，然后将电泳槽连好导线并将导线接入电泳仪中，再将干净的1×TBE缓冲液加入电泳槽，注意让缓冲液没过梳子孔。插上电源，在60W恒功率预电泳30min。
(5)点样：用移液枪反复冲洗加样孔，然后将PCR产物加上溴酚蓝7μL点样，每一个加样孔点样量为1.5μl，Marker为1.5μl，电泳缓冲液为1×TBE。
(6)电泳：60W恒功率电泳150min。
5、银染
硝酸银法进行染色，具体步骤为：
(1)脱色：将玻璃板放入0.5％的冰醋酸，在转速为60rpm的摇床上轻摇12min至胶完全脱色，
(2)染色：加入染色液，在转速为60rpm的摇床上轻摇染色12min；
(3)漂洗：倒掉染色液后，加入漂洗液清洗30s,倒掉后再加入800ml双蒸水，进行第二次漂洗，洗30s后倒掉；
(4)显影：把胶板迅速转移至显影液中，轻摇，直至产物条带出现；
(5)观察照相，记录。
上述试剂配制：
溴酚蓝：0.125g溴酚蓝，20g蔗糖，溶解为50ml的双蒸水中，双层过滤，放于4℃冰箱保存
固定液：900ml双蒸水+100ml无水乙醇+5ml冰醋酸；
染色液：800ml双蒸水+1.6g硝酸银；
漂洗液：800ml双蒸水+200ul硫代硫酸钠；
显影液：800ml双蒸水+12g氢氧化钠+6.4ml甲醛；
8％非变性聚丙烯酰胺凝胶500ml：145gAcrylamide，5g甲叉双丙烯酰胺，加双蒸水定容到500ml。
6、杂交组合亲本间多态性SSR引物筛选
SSR引物为本研究通过绒毛白蜡转录组测序开发合成的特异性引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。随机选取SSR引物，对杂交组合亲本间多态性进行筛选，选择扩增带型清晰、主带明显、稳定、多态性、重复性好的SSR标记用于真假杂种鉴定。
7、杂交后代株系SSR鉴定
根据筛选得到的亲本间共显性多态性引物，分析鉴定鲁蜡3号和鲁蜡5号杂交种单株。由于SSR标记具有遗传共显性的特点，杂交样品中若具有父本的带型，可判断为真杂交种，否则为假杂交种。
二、实验结果
1、SSR多态性引物的筛选
以鲁蜡3号和鲁蜡5号2个亲本基因组DNA为模板进行PCR扩增，从150对SSR引物中进行筛选，必须是母本和父本都能扩增出差异明显的特征带，扩增条带清晰、非特异片段少、重复性好的引物。筛选得到了S62、S78、S80、S81、S82、S83、S92、S144共8对SSR引物(引物序列见表1，图1)，多态性引物百分比为5.33％。并利用8对引物对供试材料进行扩增，扩增结果用于F1代杂交种的鉴定和杂交种群体多态性分析。
表1：SSR引物序列
2、SSR标记一致性和多态性验证
由于SSR标记具有较丰富的多态性，同一品种的不同单株间也有可能存在差异条带。在不同杂交单株间对父母本的特异性条带能否同时出现是决定SSR引物是否适合鉴定杂交种纯度的关键。因此，为了确保鉴定结果的准确性，采用筛选出的8对引物对亲本间以及7个杂交种单株的一致性和多态性条带的稳定性进行验证。
验证筛选出1对SSR引物S81，由图2可见，利用该标记能清晰区别杂种及其亲本，而且在父母本间的特异条带为250bp处，父本H在250bp处有明显条带，而母本在此处缺失条带。杂交种遗传表现为双亲型互补条带，个别为缺失型潜带，故可作为鉴别白蜡杂交种及其亲本间的主要区别。
3、杂交种鉴定
为了确保鉴定结果的准确性，选用亲本间共显性多态性强，重复性好的S81SSR引物，对杂交组合的240个单株及其亲本材料进行PCR扩增，部分扩增结果见图3，共得到真杂种196个，占杂交种总数的81.7％。
从SSR标记扩增结果分析，196个杂交单株既具有母本R特异谱带也具有父本H在250bp处有明显特异谱带，属于真实的杂交种，其余44个单株缺少父本H在250bp处特异谱带，与母本扩增谱带一致，为假杂交种。
本发明技术方案可以快速准确的鉴定绒毛白蜡和美国红梣杂交种的真实性，可以实现对杂交群体的早期筛选。
序列表
<110> 山东省林业科学研究院
<120> 一种利用SSR标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法
<141> 2019-3-10
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物Primer1-F核苷酸序列
<400> 1
taatagataa gcctgccttt ccc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Primer1-R核苷酸序列
<400> 2
atttgacaag ttgtgggttc aaa 23

Claims (1)

1.一种利用SSR标记技术对白蜡属绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法，步骤是：（1）待测的绒毛白蜡和美国红梣亲本及其杂交种植株基因组DNA的提取；（2）SSR-PCR反应；（3）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；（4）银染；（5）杂交种鉴定；
其特征在于：
步骤（2）所述的SSR-PCR反应的方法是：
SSR-PCR反应体系为10 µl： 20ng•µL-1的DNA 1 µL ，10×Buffer 1 µL，25 mmol•L-1 的MgCl2 1.25 µL ，10 mmol•L-1的dNTP 0.2µL，10 µmol•L-1的鉴定绒毛白蜡和美国红梣杂交种的SSR标记特异上下游引物各0.25 µL，10 U•µL-1的ExTaq聚合酶0.05 µL，灭菌水6 µL；
反应程序：94℃预变性4min；94℃变性15 s，60℃退火15 s，每循环降低0.7℃，72℃延伸30 s，15个循环；之后94℃变性15s，49.5℃退火15 s，72℃延伸30 s，15个循环；最后72℃延伸30 min，4℃保存；
其中所述鉴定绒毛白蜡和美国红梣杂交种的SSR标记特异上下游引物为：
Primer1-F: 5'-TAATAGATAAGCCTGCCTTTCCC-3'
Primer1-R: 5'-ATTTGACAAGTTGTGGGTTCAAA-3' ；
步骤（5）所述杂交种鉴定的方法是：利用绒毛白蜡和美国红梣为亲本培育出的杂交群体，在杂交后代的扩增产物中，若杂交植株中具有一个大小为250bp与父本相同的特异条带，即可确定为真实杂交种；
其中：所述的绒毛白蜡是绒毛白蜡“鲁蜡3号”，所述的美国红梣是美国红梣“鲁蜡5号”，所述父本是“鲁蜡5号”。
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CN104046697A (zh) * 2014-07-04 2014-09-17 山东省林业科学研究院 基于绒毛白蜡转录组测序信息开发的ssr引物组及其在种质鉴定中的应用
CN104164503A (zh) * 2014-08-04 2014-11-26 山东省林业科学研究院 一种利用ssr指纹图谱鉴别白蜡种的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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