CN112626262B - 一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记、引物及其应用 - Google Patents

一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记、引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记、引物及其应用，属于蔬菜品质育种和分子标记辅助育种技术领域。本发明与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示。其中，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与萝卜紫色花瓣性状高度连锁，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与萝卜白色花瓣性状高度连锁。本发明的与萝卜花瓣色泽基因连锁的分子标记更准确，有助于萝卜育种选择。本发明还提供了一种检测上述分子标记的引物组和检测萝卜花瓣色泽基因的试剂盒，及其在萝卜花瓣色泽育种中的应用，可快速准确鉴定萝卜花瓣色泽。

Description

一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记、引物及其 应用
技术领域
本发明属于蔬菜品质育种和分子标记辅助育种技术领域，尤其涉及一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记、引物及其应用。
背景技术
花瓣色泽是植物遗传的重要性状，主要吸引昆虫授粉。十字花科很多作物的花瓣色泽具有观赏价值，可以开发为旅游资源，促进经济发展。紫色花的主要色素是花青素，它是一种强抗氧化剂，可预防癌症、心血管疾病等，对人的身体健康十分有益。同时，花青素在吸引传粉者和种子散布者，以及保护高光胁迫和病原体攻击方面发挥重要作用。
随着分子生物学的发展，关于萝卜的研究不断深入。Luo Xiaobo等构建了覆盖1306.8cM的378738个InDels的超高密度遗传图谱，共检测到11个园艺性状的18个QTL。基于这些数据表明R2R3-MYB转录因子RsMYB90是决定萝卜紫色果皮重要候选基因。目前，在萝卜中关于颜色的研究主要是根茎的果皮和果肉颜色，关于花瓣色泽的遗传研究还尚未发现，尚无可用于萝卜花瓣色泽辅助选择的分子标记，特定花瓣色泽萝卜育种的选择效率和准确率都比较低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高的特点，可提高特定花瓣色泽萝卜育种的选择效率和准确率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述分子标记的引物组，所述分子标记的上游引物为InDel720F，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述分子标记的下游引物为InDel720R，核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明还提供了一种检测萝卜花瓣色泽基因的试剂盒，包括扩增上述InDel分子标记的引物或者包括上述引物组。
本发明还提供了上述分子标记、引物组和/或试剂盒在萝卜分子辅助育种中的应用。
优选的，所述萝卜分子辅助育种为萝卜花瓣色泽分子育种。
优选的，包括如下步骤：
采用上述的引物组对待选萝卜材料的基因组DNA进行PCR扩增；若扩增出121bp的条带代表紫色花瓣基因型，若扩增出78bp的条带代表白色花瓣基因型。
优选的，所述PCR扩增的反应体系按体积份数计包括：DNA 1份，InDel720F 1份，InDel720R 1份，2×Power Taq PCR MasterMix 12.5份，ddH2O 9.5份，其中DNA的浓度为100ng/μL，InDel720F和InDel720R的浓度均为10μmol/L。
优选的，所述PCR扩增的反应程序为：阶段1：94℃5min；阶段2：94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min，35个循环。
本发明还提供了一种上述分子标记、引物组和/或试剂盒在萝卜遗传图谱构建中的应用。
本发明还提供了一种上述分子标记、引物组和/或试剂盒在萝卜遗传多样性分析中的应用。
本发明有益效果：
本发明提供的InDel分子标记与萝卜花瓣色泽调控基因位点连锁紧密，可以简便、快速、高通量地应用于萝卜育种实践中，可用于萝卜不同色泽花瓣的品种选育，可使萝卜花瓣色泽的鉴定在苗期完成，对萝卜花瓣色泽性状分子标记辅助育种体系的建立帮助极大，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高的特点，可提高特定花瓣色泽萝卜育种的选择效率和准确率。
附图说明
图1为不同萝卜材质不同花瓣色泽照片，其中A为萝卜材料ZYR1，B为萝卜材料HYR3；
图2为本发明分子标记在亲本ZYR1和HYR3、F1及F2代植株中的多态性电泳图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示。
本发明通过利用BSA-seq技术鉴定InDels，根据鉴定的InDels和公布的萝卜基因组数据开发分子标记，并扫描F2分离群体，结合群体植株的花瓣色泽表型，开发出与萝卜花瓣色泽控制基因连锁更加紧密的InDel分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQID NO.2所示。
本发明还提供了上述分子标记的引物组，所述分子标记的上游引物为InDel720F，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述分子标记的下游引物为InDel720R，核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明还提供了一种检测萝卜花瓣色泽基因的试剂盒，包括扩增上述InDel分子标记的引物或者包括上述引物组。
本发明对于检测萝卜花瓣色泽基因的试剂盒中的其他组成成分没有特殊限定，即包含本领域技术人员公知的检测萝卜花瓣色泽基因时会用到的其他组分，比如DNA提取液，PCR反应液，标准阳性模板，阴性质控标准品等。
本发明还提供了上述分子标记、引物组和/或试剂盒在萝卜分子辅助育种中的应用。
在本发明中，所述萝卜分子辅助育种优选的为萝卜花瓣色泽分子育种。本发明对于萝卜花瓣色泽分子育种的方法没有特殊限定，优选的包括如下步骤：采用上述的引物组对待选萝卜材料的基因组DNA进行PCR扩增；若扩增出121bp的条带代表紫色花瓣基因型，若扩增出78bp的条带代表白色花瓣基因型。
本发明对于萝卜的品种没有特殊限定，在本发明优选的实施例中，花瓣颜色为紫色的萝卜种质材料的代号为ZYR1，花瓣颜色为白色的萝卜种质材料的代号为HYR3，以及ZYR1和HYR3的子代。本发明对于萝卜材料基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域公知的提取基因组DNA方法均可，优选的为利用CTAB法提取萝卜植株总DNA。本发明对于PCR扩增所使用的仪器、材料等没有特殊限定，采用本领域常规进行PCR扩增的仪器、材料等均可。在本发明优选的实施例中，所述PCR扩增的反应体系优选的按体积份数计包括如下组分：DNA 1份，InDel720F 1份，InDel720R1份，2×Power Taq PCR MasterMix 12.5份，ddH2O9.5份，其中DNA的浓度为100ng/μL，InDel720F和InDel720R的浓度均为10μmol/L；所述PCR扩增的反应程序优选的为：阶段1：94℃5min；阶段2：94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min，35个循环。
采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物组对待选萝卜材料的基因组DNA进行PCR扩增后，需对所述PCR扩增产物进行测序以获得测序结果，或对PCR产物进行电泳图谱分析。在本发明中，电泳图谱分析，优选的包括如下步骤：对扩增产物进行凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，具体的若扩增出121bp的条带代表紫色花瓣基因型，若扩增出78bp的条带代表白色花瓣基因型。
本发明对于凝胶电泳的方式没有特殊限定，优选的采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，更优选的采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明对于显影、染色的具体方式没有特殊限定，采用本领域常规显影、染色的方式均可。
本发明还提供了一种上述分子标记、引物组和/或试剂盒在萝卜遗传图谱构建中的应用。
本发明还提供了一种上述分子标记、引物组和/或试剂盒在萝卜遗传多样性分析中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
萝卜种质材料ZYR1的花瓣颜色为紫色，萝卜种质材料HYR3的花瓣颜色为白色，如图1所示。以ZYR1和HYR3为亲本，杂交获得F1代植株，F1代植株自交构建F2分离群体。
CTAB法提取亲本、F1及F2分离群体的叶片总DNA：
取上部幼嫩叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热的800μl CTAB提取缓冲液，65℃水浴30min；加入等体积氯仿异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混匀后12000r/min离心15min；将上清液转入新的离心管，加等体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴1h以上；12000r/min离心15min；倒去上清液，用体积分数为75％的乙醇冲洗沉淀两次，干燥后，加入TE缓冲液200μl溶解后，加入10μg/ml的RNA酶去除RNA，37℃水浴30min；在0.8％琼脂糖凝胶电泳，以50ng/μl的λDNA为标准，计算所得DNA的浓度；用TE稀释终浓度为100ng/μl，存于-20℃备用。
在已种植F2分离群体中，选取30株紫花花瓣植株，取幼嫩叶片，分别抽提DNA后等量混合形成紫色花瓣池；同样的方法，选30株白色花瓣植株，取幼嫩叶片，分别抽提DNA后等量混合形成白色花瓣池；用Illumina平台的Hiseq2500双末端测序技术对两个混合池进行DNA-seq测序，其中pair end(双末端)各125bp，测序深度约为60x，每个池的测序数据约为6G，共12G；然后，用已开发好的程序(perl语言编写的脚本，Marker_SNPs_V1.pl)对两个池的DNA-seq数据进行分析，流程如下：将两个混合池的RNA-seq数据通过Bowtie2软件与萝卜参考基因组(http://www.icugi.org)进行比对，再利用Tophat、Samtools软件寻找两个池中等位基因的SNPs；
根据鉴定的SNPs位点及其在参考基因组上的侧翼序列设计引物，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，以抽提的双亲本、F1和F2分离群体DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃5min，35个循环的94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min。对PCR产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。
其中各试剂配制如下：
5×TBE：Tris-base 53.9g；EDTA 3.72g；硼酸27.5g；用蒸馏水定容至1L。
40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺193.34g；甲叉双丙烯酰胺6.66g；用蒸馏水定容至500mL。
8％聚丙烯酰胺凝胶：40％聚丙烯酰胺溶液10Ml；5×TBE 5mL；10％过硫酸铵(APS)200μL；四甲基乙二胺(TEMED)80μL；蒸馏水22mL。
银染液：硝酸银1g；冰醋酸5mL；无水乙醇50mL；用去离子水定容至500mL。
显影液：氢氧化钠15g；甲醛(37％)2.5mL；用去离子水定容至500mL。
凝胶板准备：
玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子。在洗瓶内配置8％聚丙烯酰胺凝胶溶液，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子，等待溶液充分凝固。
电泳：
将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNA LoadingBuffer，混匀后取0.8μL加入点样孔内，260V电泳35min。
染色和显影：
电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15min，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10s；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上观察并拍照保存。
带型判读：
将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，观察两亲本条带的位置差异，其中部分结果如图2所示。
实施例2
检查InDel720分子标记的两种基因型在30个F2群体中的分布情况，如表1所示，其中A代表母本带型，扩增产物大小为121bp；B代表父本带型，扩增产物大小为78bp；H代表杂合基因型。
结果如表1所示，分子标记InDel720的基因型在6份白花株系中都为A；在24份紫花株系中，有18份为B，6份为H。
表1InDel720在F2群体中的鉴定和验证
Figure BDA0002901863180000061
Figure BDA0002901863180000071
Figure BDA0002901863180000081
分子标记InDel720的基因型为A的6个株系6个是白花，而在基因型为B的24个株系都是紫花，其基因型鉴定的准确率达到100％。
综上所述，通过分子标记InDel720来预测萝卜花瓣色泽，即区分紫色花瓣和白色花瓣，可以提高花瓣色泽育种的选择效率，从而加速育种进程。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南省农业科学院园艺研究所
<120> 一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记、引物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacgggtttc tcatttcaac aacagcttcg agcggcttag tcagaatctt ggtttccttg 60
tctgaaccgt gctccacggt tttagcatct gttctaacct caggcgttgt gaaagagccg 120
t 121
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacgggtttc tcatttcaac aacagcttct ccacggtttt agcatctgtt ctaacctcag 60
gcgttgtgaa agagccgt 78
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacgggtttc tcatttca 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acggctcttt cacaacg 17

Claims (9)

1.一种与萝卜花瓣色泽基因连锁的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求1所述分子标记的引物组，其特征在于，所述分子标记的上游引物为InDel720F，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述分子标记的下游引物为InDel720R，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种检测萝卜花瓣色泽基因的试剂盒，其特征在于，包括扩增权利要求1所述InDel分子标记的引物或者包括权利要求2所述引物组。
4.一种权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物组和/或权利要求3所述试剂盒在萝卜花瓣色泽分子育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
采用权利要求2所述的引物组对待选萝卜材料的基因组DNA进行PCR扩增；若扩增出121bp的条带代表紫色花瓣基因型，若扩增出78bp的条带代表白色花瓣基因型。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系按体积份数计包括：DNA 1份，InDel720F 1份，InDel720R 1份，2×Power Taq PCR MasterMix 12.5份，ddH2O 9.5份，其中DNA的浓度为100ng/μL，InDel720F和InDel720R的浓度均为10μmol/L。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：阶段1：94℃5min；阶段2：94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min，35个循环。
8.一种权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物组和/或权利要求3所述试剂盒在萝卜遗传图谱构建中的应用。
9.一种权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物组和/或权利要求3所述试剂盒在萝卜遗传多样性分析中的应用。
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