CN109207628A - 一种适用于检测紫色萝卜的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于蔬菜分子标记技术领域，具体涉及一种适用于检测紫色萝卜性状的分子标记及应用。本发明通过选择合适的亲本杂交得到F₁植株，播种该F₁种子，将F₁植株套袋自交得到F₂分离群体，通过构建紫色萝卜基因池和白色萝卜基因池、集团分析法（BSA）与AFLP技术相结合筛选得到与萝卜紫色基因紧密连锁的分子标记RA‑20，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可用于紫色萝卜群体分析，为萝卜分子育种提了实用标记和方法。

Description

一种适用于检测紫色萝卜的分子标记及应用

技术领域

本发明属于蔬菜分子标记制备技术领域，具体涉及一种适用于检测紫色萝卜性状的分子标记及应用。所述的分子标记可以作为紫色萝卜育种标记选择，为培育遗传稳定的紫色萝卜新品种提供分子标记。

背景技术

花青素广泛存在于被子植物中，是自然界广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，也是植物主要的呈色物质。花青素是一种是迄今为止所发现最有效的抗氧化剂，最强效的自由基清除剂，具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等多种生理功能。花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、化妆、医药等方面有着巨大的应用潜力。

萝卜(Raphanus sativus L.)为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，是重要的蔬菜作物。目前萝卜肉质根主要颜色有白色、红色和绿色，而肉质根紫色萝卜是萝卜种质资源多样性的表现，由于肉质根紫色对白色为显性表现，其可以作为萝卜杂交育种中假杂种筛选的辅助性状进行利用。与传统表型选择相比，可在植物生长的任何时期，不受环境条件的影响，并且可以排除等位基因互作而造成的干扰，具有快速、经济，高效，准确等优点。在紫色萝卜育种过程中，将分子标记技术和回交育种相结合是一种全新的萝卜育种途径，可以借助分子标记对萝卜紫色性状的基因型进行直接而快速地前景选择，排除环境和外界因素的影响。同时对背景进行选择，加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘。

研究人员已经广泛开展了植物花青素相关基因的克隆，而对萝卜花青素的研究还较少。付卫民等(付卫民等.心里美萝卜肉质根内花青素相关基因的EST-SSR标记的筛选，中国园艺学会十字花科蔬菜分会学术研讨会.2012.)利用EST-SSR技术，开发了一条与心里美萝卜肉质根内花青素的相关的分子标记。孙玉燕等(孙玉燕,段蒙蒙,邱杨,等.心里美萝卜花青素合成酶基因RsANS克隆及花青素生物合成相关基因表达分析[J].植物遗传资源学报,2016,17(5):889-896.)通过从心里美萝卜中克隆了花青素合成酶基因RsANS。利用分子标记技术筛选出与目标性状基因紧密连锁的分子标记，利用标记在早期筛选出所需要的目标性状，辅助常规育种，从而达到提高育种效率、加快育种进程的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于检测紫色萝卜的分子标记及引物对。利用分子标记与集团混合法(BSA)相结合，寻找紫色萝卜的AFLP标记，并将其转化为更稳定的显性SCAR标记，为紫色萝卜育种提供一种简单、快速和有效的辅助选育方法。所述的分子标记可以作为紫色萝卜育种标记选择，为培育遗传稳定的紫色萝卜新品种提供分子标记。

本发明的另一个目的在于提供一种检测萝卜紫色性状的方法。利用该标记在苗期即可鉴定区分紫色萝卜与非紫色萝卜，从而淘汰非目标植株，提高选择的效率。

为了实现上述目的，本发明通过以下方案实现：

一种适用于检测紫色萝卜性状的分子标记RA-20，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。按照下述方法获得：

1)F₂分离群体的获得：以白色萝卜“短叶13”为母本(购自武汉市武蔬种业)，以紫色萝卜“紫到心”(购自武汉市大东门种子批发部)为父本，进行杂交得到F₁，将F₁植株套袋自交，得到F₂分离群体；

2)构建F₂分离群体的基因池:采用集团混合法，构建紫色萝卜DNA池和白色萝卜DNA池两个基因池；

3)利用步骤2)构建的F₂分离群体的基因池，筛选与紫色萝卜紧密连锁的AFLP标记(所用引物如表4所示)；将两亲本间有差异的引物对(序列如表5所示)对步骤2)中构建的两个基因池进行PCR扩增，筛选出两个基因池间有差异的引物(EA3/MC5,EA5/MC4,EA7/MC6,EA8/MC7序列如表4所示)，再将其基因池中的各个单株的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测，确定选出的引物(EA7/MC6,序列如表4所示)为该性状连锁标记，再对F₂分离群体的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测；

4)将步骤3)筛选得到的与紫色紧密连锁的AFLP标记的片段进行回收、克隆、测序，该片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

5)通过对步骤4)测序结果进行特异引物设计，将筛选到的与紫色萝卜基因紧密连锁的AFLP标记转化为SCAR标记，该SCAR标记的引物如下所示:

正向引物5’-AGAATCTCGAACCTTCCGTGGA-3’，

反向引物5’-ATTATCATCACGAGGGACAGCG-3’。

一种检测紫色萝卜性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测萝卜的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增；

(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增产物中出现221bp特征条带(序列如SEQID NO：1所示)，则为紫色萝卜。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明成功得到用于检测紫色萝卜性状的SCAR分子标记，运用该标记对紫色萝卜辅助选择可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点，并可以减少育种工作量，缩短育种年限，加快紫色萝卜新品种选育的进程。该标记为显现标记，具有检测方便快速、扩增稳定等优点，能够快速筛选具有紫色性状的植株，用于紫色萝卜品种的选育。同时利用该分子标记还可以避免环境对萝卜颜色的影响，提高选择的准确性。此外利用该标记还能提高紫色萝卜的选择效率。在传统的紫色萝卜鉴定过程中，必须等到萝卜成熟后才能对萝卜肉质根颜色进行观察，因此紫色萝卜的选育效率低，育种周期长。利用本发明的分子标记，在苗期即可鉴定出紫色和非紫色萝卜植株，从而淘汰非目标植株，因此利用该分子标记可以极大的提高育种效率，加快育种进程。

附图说明

图1 EA7/MC6在两亲本及两基因池上扩增效果图。图中标记：P1：亲本“紫到心”萝卜；B1：紫色萝卜基因池；P2：亲本“短叶13”萝卜；B2：白色叶基因池。

图2 RA-20(SCAR)标记在亲本及两基因池中扩增效果图。图中标记：P1泳道：亲本“紫到心”萝卜；P2泳道：亲本“短叶13”萝卜；B1泳道：紫色基因池；B2泳道：白色基因池；M泳道：100bp DNAladder(分子量标准)。

图3 RA-20(SCAR)标记在构成基因池的各个单株中检测的电泳图。图中1-10泳道：紫色基因池；11-20泳道：白色基因池；M泳道：100bp DNAladder(分子量标准)。

具体实施方式

实施例1

1.构建紫色萝卜分离群体：

在本实施例中，以萝卜“短叶13”(购自武汉市武蔬种业)作为母本，以萝卜“紫到心”(购自武汉市大东门种子批发部)作为父本杂交得到F₁，将F₁分别套袋自交，产生F₂群体。

2.基因组DNA的提取

采用常用的CTAB方法提取步骤1中所得群体的单株及亲本的基因组DNA，具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法进行。

3.构建紫色DNA池和白色DNA两个DNA池：采用集团混合法(bulked segregationanalysis,简称BSA，参见文献Michelmore RW等，Identification of markers linked todisease resistance gene by bulked segregant analysis:a rapid method to detectmarkers in specific genomic regions using segregating population,Pro.Natl.Acad.Sci.,USA,88:9829-9832)，在F₂群体中，根据表型分析结果，分别取10个紫色单株和10个叶白色单株的基因组DNA，分别将其DNA进行等量混合，构建成紫色DNA池和白色DNA。

4.集团分析法(BSA)与AFLP技术相结合筛选与紫色萝卜基因紧密连锁的分子标记

利用AFLP引物组合(EA/MC和EA/MG组合，AFLP接头和引物序列设计均按照Vos等(Vos et al.,AFLP:a new technique for DNA finger printing.Nucleic Acids Res,1995,23:4407-4414)报道的方法进行)，所述的引物由武汉天一辉远生物有限公司合成(引物序列见后)，在亲本与两个基因池间进行筛选。在亲本之间有差异的引物对见表5，为了检测这些引物在白色群体和紫色群体间是否有差异，将这些引物在两个基因池中进行检测，其中只有4对AFLP引物(EA3/MC5,EA5/MC4,EA7/MC6,EA8/MC7)在两个基因池间表现出多态性。为了检测筛选出的4对AFLP引物的稳定性与重现性，将筛选出具有多态性的引物在组成紫色DNA池和白色DNA池的20个单株基因组DNA中进行验证，进一步分析表明，AFLP引物EA7/MC6在基因池的单株检测中具有较好稳定性和重现性，该引物扩增产生片段大小为221bp。此外在F₂群体的检测中，该引物在单株间有差异，与萝卜紫色基因紧密连锁。

AFLP分析：

1)总DNA的酶切

按表1配制酶切反应体系：总DNA 500ng，5U EcoRI和5U MseI(MBI Fermentas,Lithuania)限制性内切酶，终体积为20μl。先在37℃水浴16hrs-18hrs，后转入65℃水浴45min，酶切完成后于85℃灭活10min。

2)AFLP连接反应

接头和引物序列设计均按Vos等(1995)报道方法进行，由上海生物工程技术公司合成。接头制备(AFLP接头序列见表2)：先将EcoRI、MseI接头的左右引物(F、R)配制成100μmol/L，后将等体积的左右(或称正向引物、反向引物)引物(F、R)混合于同一灭菌0.5ml离心管中，进行复性。复性参数为65℃10min→37℃10min→25℃1min→-20℃保存。

在步骤1)的酶切反应液中加入5μl连接混合液(见表1)并置于22℃连接过夜，将酶切片段与接头连接。连接完毕，70℃灭活10min，再用ddH₂O将反应液稀释10倍作为PCR预扩增的底物。

表1 DNA酶切、连接体系设计

表2 AFLP接头与预扩增引物

3)预扩增反应

预扩增反应体系见表3，在该反应体系中，含有0.125mmol/L dNTPs，1U Taqpolymerase，1.35mmol/L MgCl₂，1×PCR buffer(四者均购自MBI Fermentas,Lithuania)，50ng EA和50ng MC(或者MG)预扩增引物，3μl酶切连接产物(预扩增引物序列见表2)。PCR反应参数为：4℃5min，一个循环；94℃30s，56℃30s，72℃1min，共计20个循环，PTC-225PCR仪上完成，PCR结束后取5μl预扩增产物于1.0％的琼脂糖凝胶上检测，扩增产物分子量在50-800bp之间，无拖尾现象。然后将剩余预扩增产物稀释30-40倍作为选择性扩增的模板。

4)选择性扩增

选择性扩增反应体系见表3，在该反应体系中，含有3μl预扩增稀释产物，37.5ngEA+2引物(为EA预扩引物另加2个选择性碱基，以下类似)和37.5ng MC/MG+2引物，0.15mmol/L dNTPs，0.75U Taq polymerase，0.45mmol/L MgCl₂，1×PCR buffer(后四者均购自MBI Fermentas,Lithuania)。PCR反应参数为：94℃5min，一个循环；94℃30s，65℃30s，72℃1min，此后每个循环复性温度下降0.7℃，共计13个循环；然后94℃30s，56℃30s，72℃1min共23个循环，PTC-225PCR仪上完成，选择性扩增引物序列和编号见表4。

表3预扩增及选择性扩增反应体系

表4选择性扩增引物

表5本发明中亲本间有差异的AFLP引物对

5)扩增产物的电泳检测

用洗涤剂(洗洁精)将电泳玻璃彻底洗净，先以去离子水淋洗，后用无水乙醇淋洗并晾干。在长胶板上用光滑的餐巾纸均匀涂抹2ml硅化液(AMRESCO)。在短胶板上均匀涂1ml反硅化液(95％乙醇，0.5％冰乙酸，2ul反硅化剂)，5min后用95％乙醇轻轻擦洗，除去多余的硅化液和反硅化液并晾干5min。将玻璃装配好并以边条(0.4mm)隔开，装配好电泳系统图。用注射器将80ml变性凝胶液(6％丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5×TBE缓冲液，灌胶前加入300ul TEMED并迅速混匀)从制胶夹底部小孔缓缓注入，最后插入梳子并加夹子保护，凝聚2hrs后即可电泳。

将电泳槽底部的制胶板取下，擦净电泳槽玻璃外侧，将其垂直固定于底座上，上槽和下槽分别加0.5×TBE缓冲液1000ml和500ml，将梳子拨出后立即冲洗点样孔，接通电源120W电泳预热30min，电泳所用仪器为Sdequi-cell(Bio-Rad,USA)。选择性扩增产物加入等体积的上样缓冲液(98％去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA,0.005％二甲苯青FF,0.005％溴酚蓝)，95℃变性5min后立即冰浴冷却，点样2.2ul。85w左右电泳，单二甲苯青FF跑过2/3胶板时中止电泳(约需2hrs)。

电泳完毕，小心剥下胶板，将其浸入到2L固定液(10％冰乙酸)中，轻轻摇动30min或至指示剂消失为止，然后用去离子水漂洗胶板2次，每次5min。洗毕，转至2L染色液中(0.1％AgNO₃,0.056％HCHO)中轻轻摇动染色30min。取出胶板，在双蒸水中迅速漂洗10s，马上转入到2L预冷(10℃)显影液(3％Na₂CO₃,0.056HCHO,2mg/L Na₂S₂O₃·5H₂O)中，轻轻摇动至条带清晰可见，后取出放回固定液(10％冰乙酸)停止显影，再用第二次漂洗的双蒸水漂洗5min，室温下自然晾干，拍照保存。

5.将筛选到的与萝卜紫色紧密连锁的AFLP标记转化为SCAR标记

(1)目标片段回收

在PAGE胶上回收在双亲中产生的AFLP差异片段，放入0.5ml离心管中，加入20μlddH₂O并用一次性无菌枪头捣碎，在95℃保温10min自然冷却，离心后取2ul上清液为模板重新进行PCR扩增，扩增所用引物与反应条件与AFLP选择性扩增相同。取20μl PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上检测，将扩增出的目标片段用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术公司)进行回收。操作程序按该试剂盒说明书提供的方法：用刀片从1.0％的琼脂糖胶上挖出目标片段放入2.0ml的离心管，按照每100mg琼脂糖胶加入300μl BindingSolution B(结合液B)，置于55℃水浴中加热10min，每隔2min混匀一次；将融化的胶溶液转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，3,000rpm离心30sec；倒掉收集管中的废液，加入500μl Wash Solution(洗脱液)，8,000rpm室温离心30sec，此步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将GenClean Column(吸附柱)放入同一个收集管中，10,000rpm离心1min；将GenClean Column(吸附柱)放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μlElution Buffer，室温放置2min；10,000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

(2)目的片段的测序

取上述回收的目标DNA片段2μl作模板，用相应的引物(EA7/MC6，序列如表5所示)进行PCR扩增，在1.0％的琼脂糖胶检测扩增的DNA片段是否为所需的目标片段。如果不是则需要重新扩增回收；如果扩增的DNA片段长度与上述步骤中扩增的结果相同，可进行下一步的T-A克隆。

将回收的目标片段连接在pMDT-18载体上(购自宝生物工程大连有限公司，即TaKaRa公司)。操作程序按该试剂盒的说明书介绍的方法：在使用前，先将试剂进行短暂离心，使其收集在管底部；在0.5ml的离心管中进行连接反应，连接反应体系为：目标片段DNA2.0μl，pMDT-18载体0.5μl和Solution I 2.5μl。用移液管来回吸几次混匀，置4℃冰箱进行过夜连接反应。

准备LB液体培养基和LB固体培养基(含100mg/ml氨苄青霉素，24mg/ml的异丙基-硫代β-D-半乳糖苷和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)；将感受态细胞从-70℃冰箱中取出，放在冰上等其自然解冻(约5min)；取2μl连接反应液加入到一个已经灭菌的1.5ml离心管(放在冰上预冷)；用手指轻弹装有感受态细胞的管底以混匀，取50μl感受态细胞加入装有2μl连接反应液的1.5ml离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上20min；在42℃水浴中热激90sec(勿摇动)，然后放在冰上静置5min；再加入500μl的LB液体培养基，放在37℃振荡培养1h(150rmp/min)；吸取振荡培养后的转化液200μl涂在无菌的LB固体培养基上，在37℃放置16-20h；进行蓝、白斑筛选，挑选24个阳性克隆在无菌的液体LB培养基(含50ug/ml的氨苄青霉素)中振荡培养16-20h(150rmp/min)；取振荡培养后的菌液2μl作PCR模板，用M13作引物(正向引物:5'-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3'；反向引物：5'-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3')扩增，扩增结果在1.0％的琼脂糖凝胶上检测目标片段是否转化成功。如果扩增的DNA片段比目标DNA片段大200bp左右，说明转化成功，选8份转化成功的菌液各吸取100μl送至武汉天一辉远生物有限公司进行序列测定。剩余400μl浑浊菌液加400μl 50％无菌的甘油在2ml无菌的离心管中于-70℃编号保存。

(3)SCAR标记的转化

根据测序得到的DNA片段的核苷酸序列(序列表SEQ ID NO.1所示)，利用报道的Primer Premier 5.0软件(http://www.PremierBiosoft.com)设计引物，引物设计原则为：GC含量为40％-70％，Tm值为60-70，引物内无二级结构，引物间不能相互配对，SCAR引物的正反两个方向(Forward,Reverse)长度22-28bp(引物序列见表6)，由武汉天一辉远生物有限公司合成。

表6本发明设计的引物对核苷酸序列

(4)SCAR标记反应体系

PCR反应体系：1×PCR buffer，1.35mmol/L MgCl₂,1.0U Taq polymerase0.08mmol/L dNTPs(MBI Fermentas,Lithuania公司)，50ng DNA，0.45μmol/L正反向引物，ddH2O补充使得最终体积20μl。PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，58℃45s，72℃60s，35个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存，反应在PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.0％琼脂糖凝胶(含EB)分离，使用1×TAE缓冲液，电压3V/cm，电泳1.5hrs左右。电泳完毕后，用凝胶成像系统拍照保存。

6.SCAR标记技术分析

将转化成功的SCAR标记首先在双亲和两个基因池中进行PCR扩增，发现该引物表型出多态性，表明该标记已发展成了一个显性的SCAR标记，将其命名为RA-20，序列长度为221个bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

用SCAR标记RA-20对F₂群体中281个单株进行扩增，结果216个紫色单株中有212个单株都能观察到此特异带，而4个单株没有出现该特异带；65个白色单株中，62个单株不能扩增出该特异带，而3个单株能够扩增出此带。

表7 RA-20标记在F₂的分析结果

表7表明，本发明制备的SCAR标记RA-20与萝卜紫色基因紧密连锁，可以成功应用于萝卜紫色材料的鉴定等辅助选择中。

序列表

<110> 武汉市农业科学院

<120> 一种适用于检测紫色萝卜的分子标记及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 221

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaatctcga accttccgtg gaggctaacg accgagccag gagatgggga tccaggctga 60

cgtatggtga cgttcgtgac gtttccagta ccgctcataa cgcaaacgcc gcgctggcgc 120

ctgcgtgcga aagtggccac gctgtcgact agatcgcagc cgtcaccaat ctccatcacg 180

tgggttcgaa gcgcgtttgc gctgtccctc gtgatgataa t 221

Claims (4)

1.一种适用于检测紫色萝卜性状的分子标记RA-20，其特征在于，RA-20核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于检测权利要求1所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物5’-AGAATCTCGAACCTTCCGTGGA-3’，

反向引物5’-ATTATCATCACGAGGGACAGCG-3’。

3.一种检测紫色萝卜性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测萝卜的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，采用权利要求2所述引物进行PCR扩增；

(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增产物中出现221bp特征条带，则为紫色萝卜。

4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述引物在辅助选择紫色萝卜中的应用。