CN104313149B - 一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蔬菜分子标记制备技术领域，具体涉及一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记及应用。本发明通过选择合适的亲本杂交得到F1植株，播种该F1种子，将F1植株套袋自交和回交得到F2及BC1分离群体，通过构建萝卜叶浅裂基因池和叶全裂基因池、设计特异引物、PCR以及回收、克隆、测序等步骤，筛选得到与萝卜叶缘缺裂基因紧密连锁的分子标记HY-18，该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示。本发明还公开了该分子标记的制备方法。本发明制备的分子标记可用于萝卜叶缺裂群体分析，为萝卜分子育种提了实用标记和方法。

Description

一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记及应用
技术领域
本发明属于蔬菜分子标记制备技术领域，具体涉及一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记及应用。所述的分子标记可以作为萝卜叶缘裂刻性状育种的标记，为培育遗传稳定的叶缘裂刻萝卜新品种提供分子标记。
背景技术
叶片是植物进行光合作用、呼吸作用和蒸腾作用的主要器官，影响植物的光合效率、产量及其品质等。植物叶片形态由叶形、叶尖、叶基及叶缘等几个部分组成，其中叶缘具有全缘、锯齿、裂刻、波浪等形状。叶缘的适度裂刻可改变植株的株型，提高群体的通风性、透光性及整个植株的光能利用率，同时在一定程度上抑制病虫害的发生，并且有利于植物对高温、干旱等逆境的适应性。
萝卜(RaphanussativusL.)为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，是重要的蔬菜作物。传统的萝卜叶形主要分为全缘叶和羽状裂叶，而叶缘裂刻全裂的萝卜叶形是萝卜种质资源多样性的表现，由于全裂叶对全缘叶的为显性表现，其可以作为萝卜杂交育种中假杂种筛选的辅助性状进行利用。与传统表型选择相比，可在植物生长的任何时期，不受环境条件的影响，并且可以排除等位基因互作而造成的干扰，具有快速、经济，高效，准确等优点。在萝卜叶缘全裂育种过程中，将分子标记技术和回交育种相结合是一种全新的萝卜育种途径，可以借助分子标记对叶缘全裂性状的基因型进行直接而快速地前景选择，排除环境和外界因素的影响。同时对背景进行选择，加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘。
植物叶缘裂刻目的性状的定位方面，主要集中在拟南芥和番茄等植物上，而对芸薹属植物中叶缘裂刻性状的研究还较少。惠麦侠等(惠麦侠等.白菜叶缘裂刻近等基因系的cDNA-AFLP分析及SCAR标记的转化.中国农业科学,2010，43(21):4447-4454)利用cDNA-ALP技术，开发了一条与裂刻紧密连锁的SCAR标记用于裂叶纯合和杂合的分子辅助选择。邓杰等(邓杰等.控制大白菜和白菜型油菜叶缘裂刻的QTL定位及分析.园艺学报,2012.，39(4):661-668)通过构建白叶缘裂刻BC2DH群体，在A03和A10上各存在一个与白菜叶缘裂刻相关的QTL。然而目前关于萝卜叶缘裂刻的分子标记尚未见报道，目前也没有利用分子标记辅助选择对萝卜叶缘裂刻的育种选择也未见报道。
发明内容
本发明的目的在于获得一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记。所述的分子标记可以作为萝卜叶缘裂刻育种标记，为培育遗传稳定的叶缘裂刻萝卜新品种提供分子标记。
本发明利用分子标记与集团混合法(BSA)相结合，寻找叶缘裂刻萝卜的AFLP标记，并将其转化为更稳定的显性SCAR标记，为萝卜叶缘裂刻性状的筛选提供一种简单、快速和有效的辅助选育方法。
本发明通过以下方案实现：
申请人通过试验获得一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的SCAR分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。
申请人提供了一种制备萝卜叶缘裂刻性状检测的SCAR分子标记的方法，其按照以下步骤：
1)F2分离群体的获得：以叶缘浅裂萝卜“武青一号”为母本(购自武汉市武蔬种业)，以叶缘全裂萝卜“新洲花叶”(购自武汉市新洲区惠农种子批发部)为父本，进行杂交得到F1，将F1植株套袋自交、回交，得到F2和BC1分离群体；
2)构建F2分离群体的基因池:
采用集团混合法(bulkedsegregationanalysis,简称BSA，参见文献MichelmoreRW等，Identificationofmarkerslinkedtodiseaseresistancegenebybulkedsegregantanalysis:arapidmethodtodetectmarkersinspecificgenomicregionsusingsegregatingpopulation,Pro.Natl.Acad.Sci.,USA,88:9829-9832)，构建叶浅裂DNA池和叶全裂DNA池两个基因池；
3)将两亲本间有差异的引物对，对上述步骤2)构建的两个基因池进行PCR扩增，选择在两个基因池中表现有差异的引物组合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4进一步对基因池间各单株的基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测，确定筛选出的引物组合EA1/MC8为叶缘裂刻性状的连锁标记，再对F2分离群体的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测；
其中：
两亲本间有差异的引物对的DNA序列如下所示：
上述引物对的序列与序列表SEQIDNO：4-69所示的引物序列向对应。
4)将步骤3)筛选得到的与萝卜叶缘缺刻性状紧密连锁的AFLP标记引物组合EA1/MC8的片段进行回收、克隆、测序，所得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示；
其中：EA1/MC8引物组合的序列如下：
EA1：5’-GACTGCGTACCAATTCAAA-3’，
MC8：5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’。
5)通过对步骤4)测序结果进行特异引物的设计，将筛选得到的与萝卜叶缘缺刻性状紧密连锁的AFLP标记转化为SCAR标记引物，该SCAR标记引物序列如下所示；
正向引物5’-ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3’，
反向引物5’-AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3’。
本发明的积极效果：
本发明成功得到用于检测萝卜叶缘裂刻性状的SCAR分子标记，运用该标记对叶缘裂刻萝卜辅助选择可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点，并可以减少育种工作量，缩短育种年限，加快叶缘裂刻萝卜新品种选育的进程。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
序列表SEQIDNO：1是本发明制备的用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记的核苷酸序列。序列长度为205个bp；在该序列的1-26bp和183-205bp的碱基是检测萝卜叶缘裂刻性状的引物序列。
序列表SEQIDNO：2和3是扩增和检测本发明分子标记的特异引物序列。
序列表SEQIDNO：4和69是检测萝卜两亲本间有差异的引物对的DNA序列(成对使用，如《发明内容》中的步骤3)所示的引物组合(即引物对))。
图1利用EA1/MC8引物组合在两亲本及两基因池上扩增效果图。图中标记：P1：亲本“新洲花叶”萝卜；B1：全裂叶基因池；P2：亲本“武青一号”萝卜；B2：浅裂叶基因池。
图2在构成基因池的各个单株中检测AFLP标记引物组合EA1/MC8的电泳图。图2中的A泳道为全裂叶基因池；B泳道为浅裂叶基因池。
图3本发明制备的SCAR标记引物HY-18在亲本及两基因池中扩增效果图。图中标记：P1泳道：亲本“新洲花叶”萝卜；P2泳道：亲本“武青一号”萝卜；B1泳道：全裂叶基因池；B2泳道：浅裂叶基因池；M泳道：100bpDNAladder(分子量标准)。
图4本发明制备的SCAR标记引物HY-18在构成基因池的各个单株中检测的电泳图。图中1-10泳道：全裂叶基因池；11-20泳道：浅裂叶基因池；M泳道：100bpDNAladder(分子量标准)。
具体实施方式
实施例1
1.构建萝卜叶缘裂刻分离群体：
在本实施例中，以萝卜“武青一号”作为母本，以萝卜“新洲花叶”作为父本杂交得到F1，将F1分别套袋自交和回交，产生F2和BC1。
2.叶缘裂刻表型鉴定：
在田间对萝卜叶形进行表型鉴定，调查F2群体和BC1群体各单株叶形分离比，利用卡方测验分析(x2)叶缘裂刻遗传规律。测验方法参考南京农业大学主编，田间试验和统计方法，中国农业出版社，1985，第二版。其结果是，(萝卜“武青一号”×萝卜“新洲花叶”)F1与亲本“武青一号”回交产生的BC1群体中，42株为叶浅裂，39株为叶全裂，x2检验其分离比符合1:1，与亲本“新洲花叶”萝卜回交产生的BC1后代87个单株全部为叶全裂；F1自交获得的F2群体，总株数为241，其中叶形表现为叶全裂的有185株，表现为叶浅裂有56株，x2检验其分离比符和3:1。因此萝卜叶缘裂刻的表型符合显性基因遗传模式，这些数据说明萝卜叶缘缺裂受单个遗传位点控制。结果见表1。
表1本发明中萝卜叶缘裂刻分离群体的表型分离
3.基因组DNA的提取
采用常用的CTAB方法提取步骤1中所得群体的单株及亲本的基因组DNA，具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法进行。
4.构建叶浅裂DNA池和叶全裂DNA两个DNA池：采用集团混合法(bulkedsegregationanalysis,简称BSA，参见文献MichelmoreRW等，Identificationofmarkerslinkedtodiseaseresistancegenebybulkedsegregantanalysis:arapidmethodtodetectmarkersinspecificgenomicregionsusingsegregatingpopulation,Pro.Natl.Acad.Sci.,USA,88:9829-9832)，在F2群体中，根据表型分析结果，分别取10个叶浅裂单株和10个叶全裂单株的基因组DNA，分别将其DNA进行等量混合，构建成叶浅裂DNA池和叶全裂DNA。
5.集团分析法(BSA)与AFLP技术相结合筛选与萝卜叶缘裂刻基因紧密连锁的分子标记
利用AFLP引物组合(EA/MC和EA/MG组合，AFLP接头和引物序列设计均按照Vos等(Vosetal.,AFLP:anewtechniqueforDNAfingerprinting.NucleicAcidsRes,1995,23:4407-4414)报道的方法进行，所述的引物由武汉天一辉远生物有限公司合成(引物序列见后)，在亲本与两个基因池间进行筛选，3对AFLP引物在两个基因池间表现出多态性。将筛选出具有多态性的引物在组成叶浅裂DNA池和叶全裂DNA池的20个单株基因组DNA中进行验证，进一步分析表明，AFLP引物组合EA1/MC8具有较好稳定性和重现性，该引物组合扩增产生片段大小为251bp，与萝卜叶缘裂刻基因紧密连锁。
上述相关的引物组合的DNA序列如下：
AFLP引物：
EA1：5’-GACTGCCTACCAATTCAAA-3’；
MC8：5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’。。
AFLP分析：
1)总DNA的酶切与连接按表2配制反应体系：总DNA500ng，5UEcoRI和5UMseI(MBIFermentas,Lithuania)限制性内切酶，终体积为20μl。先在37℃水浴16hrs-18hrs，后转入65℃水浴45min，酶切完成后于85℃灭活10min。之后加入5μl连接混合液，将酶切与连接混合液置于22℃连接过夜。连接完毕，70℃灭活10min，再用ddH2O将反应液稀释10倍作为PCR预扩增的底物；
2)AFLP连接反应
接头和引物序列设计均按Vos等(1995)报道方法进行，由上海生物工程技术公司合成。接头制备(AFLP接头序列见表3)：先将EcoRI、MseI接头的左右引物(F、R)按照OD值得多少加入一定数量灭菌ddH2O统一溶解稀释为100μmol/L，后将等体积的左右(或称正向引物、反向引物)引物(F、R)混合于同一灭菌0.5ml离心管中，进行复性。复性参数为65℃10min→37℃10min→25℃1min→-20℃保存。配制体系见表2，接头引物见表3。
表2本发明的DNA酶切、连接体系设计
表3AFLP接头与预扩增引物
3)预扩增反应
预扩增反应体系见表4，在该反应体系中，含有0.125mmol/LdNTPs，1UTaqpolymerase，1.35mmol/LMgCl2,1×PCRbuffer(四者均购自MBIFermentas,Lithuania)，50ngEA和50ngMC(或者MG)预扩引物，3μl酶切连接产物(引物序列见表2)。PCR反应参数为：4℃5min，一个循环；94℃30s，56℃30s，72℃1min，共计20个循环，PTC-225PCR仪上完成，PCR结束后取5μl预扩增产物于1.0％的琼脂糖凝胶上检测，扩增产物分子量在50-800bp之间，无拖尾现象。然后将剩余预扩增产物稀释30-40倍作为选择性扩增的模板。预扩增引物序列见表3。
4)选择性扩增：
选择性扩增反应体系见表4，在该反应体系中，含有3μl预扩增稀释产物，37.5ngEA+2引物(为EA预扩引物另加2个选择性碱基，以下类似)和37.5ngMC/MG+2引物，0.15mmol/LdNTPs，0.75UTaqpolymerase，0.45mmol/LMgCl2,1×PCRbuffer(后四者均购自MBIFermentas,Lithuania)。PCR反应参数为：94℃5min，一个循环；94℃30s，65℃30s，72℃1min，此后每个循环复性温度下降0.7℃，共计13个循环；然后94℃30s，56℃30s，72℃1min共23个循环，PTC-225PCR仪上完成，选择性扩增引物序列和编号见表5。
表4预扩增及选择性扩增反应体系
表5本发明的AFLP所用引物
注：英文简称为EA,MC,MG的引物序列请参见表3。
(5)扩增产物的电泳检测
用洗涤剂(即普通家用洗洁精)将电泳玻璃彻底洗净，先以去离子水淋洗，后用无水乙醇淋洗并晾干。在长胶板上用光滑的餐巾纸均匀涂抹2ml硅化液(AMRESCO)。在短胶板上均匀涂1ml反硅化液(95％乙醇，0.5％冰乙酸，2ul反硅化剂)，5min后用95％乙醇轻轻擦洗，除去多余的硅化液和反硅化液并晾干5min。将玻璃装配好并以边条(0.4mm)隔开，装配好电泳系统图。用注射器将80ml变性凝胶液(6％丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5×TBE缓冲液，灌胶前加入300ulTEMED并迅速混匀)从制胶夹底部小孔欢欢注入，最后插入梳子并加夹子保护，凝聚2hrs后即可电泳。
将电泳槽底部的制胶板取下，擦净电泳槽玻璃外侧，将其垂直固定于底座上，上槽和下槽分别加0.5×TBE缓冲液1000ml和500ml，将梳子拨出后立即冲洗点样孔，接通电源120W电泳预热30min，电泳所用仪器为sequencingcell(Bio-Rad,USA)。选择性扩增产物加入等体积的上样缓冲液(98％去离子甲酰胺，10mmol/LEDTA,0.005％二甲苯青FF,0.005％溴酚蓝)，95℃变性5min后立即冰浴冷却，点样2.2ul。85w左右电泳，单二甲苯青FF跑过2/3胶板时中止电泳(约需2hrs)。
电泳完毕，小心剥下胶板，将其浸入到2L固定液(10％冰乙酸)中，轻轻摇动30min或至指示剂消失为止，然后用去离子水漂洗胶板2次，每次5min。洗毕，转至2L染色液中(0.1％AgNO3,0.056％HCHO)中轻轻摇动染色30min。取出胶板，在双蒸水中迅速漂洗10s，马上转入到2L预冷(10℃)显影液(3％NaCO3,0.056HCHO,2mg/LNa2S2O3.5H2O)中，轻轻摇动至条带清晰可见，后取出放回固定液(10％冰乙酸)停止显影，再用第二次漂洗的双蒸水漂洗5min，室温下自然晾干，拍照保存。
7.将筛选到的与萝卜叶缘裂刻紧密连锁的AFLP标记转化为SCAR标记
(1)目标片段回收：
在PAGE胶上回收在双亲中产生的AFLP差异片段，放入0.5ml离心管中，加入20μlddH2O并用一次性无菌枪头捣碎，在95℃保温10min自然冷却，离心后取2ul上清液为模板重新进行PCR扩增，扩增所用引物与反应条件与AFLP相同。取20μlPCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上检测，将扩增出的目标片段用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术公司)进行回收。操作程序按该试剂盒说明书提供的方法：用刀片从1.0％的琼脂糖胶上挖出目标片段放入2.0ml的离心管，按照每100mg琼脂糖胶加入300μl结合液B，置于55℃水浴中加热10min，每隔2min混匀一次；将融化的胶溶液转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，3,000rpm离心30sec；倒掉收集管中的废液，加入500μl洗脱液，8,000rpm室温离心30sec，此步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将GenCleanColumn(吸附柱)放入同一个收集管中，10,000rpm离心1min；将GenCleanColumn(吸附柱)放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μlElutionBuffer，室温放置2min；10,000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
(2)目的片段的测序
取上述回收的目标DNA片段2μl作模板，用相应的引物组合(即EA1/MC8,其序列如表5所示)进行PCR扩增，在1.0％的琼脂糖胶检测扩增的DNA片段是否为所需的目标片段。如果不是则需要重新扩增回收；如果扩增的DNA片段长度与上述步骤中扩增的结果相同，可进行下一步的T-A克隆。
将回收的目标片段连接在pMDT-18载体上(购自宝生物工程大连有限公司，即TaKaRa)。操作程序按该试剂盒的说明书介绍的方法：在使用前，先将试剂进行短暂离心，使其收集在管底部；在0.5ml的离心管中进行连接反应，连接反应体系为：目标片段DNA2.0μl，pMDT-18载体0.5μl和SolutionI2.5μl。用移液管来回吸几次混匀，置4℃冰箱进行过夜连接反应。
准备LB液体培养基和LB固体培养基(含100mg/ml氨苄青霉素，24mg/ml的异丙基-硫代β-D-半乳糖苷和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)；将感受态细胞从-70℃冰箱中取出，放在冰上等其自然解冻(约5min)；取2μl连接反应液加入到一个已经灭菌的1.5ml离心管(放在冰上预冷)；用手指轻弹装有感受态细胞的管底以混匀，取50μl感受态细胞加入装有2μl连接反应液的1.5ml离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上20min；在42℃水浴中热激90sec(勿摇动)，然后放在冰上静置5min；再加入500μl的LB液体培养基，放在37℃振荡培养1h(150rmp/min)；吸取振荡培养后的转化液200μl涂在无菌的LB固体培养基上，在37℃放置16-20h；进行蓝、白斑筛选，挑选24个阳性克隆在无菌的液体LB培养基(含50ug/ml的氨苄青霉素)中振荡培养16-20h(150rmp/min)；取振荡培养后的菌液2μl作PCR模板，用M13作引物(正向引物:5'-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3'；反向引物：5'-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3')扩增，扩增结果在1.0％的琼脂糖凝胶上检测目标片段是否转化成功。如果扩增的DNA片段比目标DNA片段大200bp左右，说明转化成功，选8份转化成功的菌液各吸取100μl送至武汉天一辉远生物有限公司进行序列测定。剩余400μl浑浊菌液加400μl50％无菌的甘油在2ml无菌的离心管中于-70℃编号保存。
(3)SCAR标记的转化
根据测序得到的DNA片段的核苷酸序列(序列表SEQIDNO：1所示)，利用报道的PrimerPremier5.0软件(http://www.PremierBiosoft.com)设计引物，引物设计原则为：GC含量为40％-70％，Tm值为60-70，引物内无二级结构，引物间不能相互配对，SCAR引物的正反两个方向(Forward,Reverse)长度26bp，由武汉天一辉远生物有限公司合成。
(4)SCAR标记反应体系
PCR反应体系：1×PCRbuffer，1.35mmol/LMgCl2,1.0UTaqpolymerase(0.08mmol/LdNTPs(MBIFermentas,Lithuania公司)，50ngDNA，0.45μmol/L正反向引物，ddH2O补充使得最终体积20μl。PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，58℃45s，72℃60s，35个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存，反应在PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.0％琼脂糖凝胶(含EB)分离，使用1×TAE缓冲液，电压3V/cm，电泳1.5hrs左右。电泳完毕后，用凝胶成像系统拍照保存。
8.SCAR标记技术分析
将转化成功的SCAR标记首先在双亲和两个基因池中进行PCR扩增，发现该引物表型出多态性，表明该标记已发展成了一个显性的SCAR标记，将其命名为HY-18。HY-18标记的特征见表6所示。
表6本发明设计的引物对核苷酸序列
用SCAR标记引物HY-18对F2群体中241个单株进行扩增，结果185个叶全裂单株中有179个单株都能观察到此特异带，而6个单株没有出现该特异带；56个叶浅裂单株中，54个单株不能扩增出该特异带，而2个单株能够扩增出此带。
表7SCAR标记引物HY-18在F2的分析结果
注：-/+特异带有无
表7表明，本发明制备的SCAR标记引物HY-18与萝卜叶缘裂刻基因紧密连锁，可以成功应用于萝卜叶缘裂刻材料的鉴定等辅助选择中。

Claims (5)

1.一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。
2.一种扩增权利要求1所述的分子标记的引物对，其DNA序列如下所示：
正向引物5’-ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3’，
反向引物5’-AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3’。
3.一种筛选萝卜叶缘裂刻性状的分子标记的方法，其特征在于包含下列步骤：
1)以萝卜“武青一号”为母本，以萝卜“新洲花叶”为父本进行杂交得到杂种F1，将所得的F1植株套袋自交、回交，得到F2和BC1分离群体；
2)采用集体混合法构建萝卜叶浅裂DNA池和叶全裂DNA池；
3)将两亲本间有差异的引物对，对上述步骤2)构建的两个基因池进行PCR扩增，选择在两个基因池中表现有差异的引物组合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4进一步对基因池间各单株的基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测，确定筛选出的引物组合EA1/MC8为叶缘裂刻性状的连锁标记，再对F2分离群体的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测；
其中：
两亲本间有差异的引物对的DNA序列如下所示：
4)将步骤3)筛选得到的与萝卜叶缘缺刻性状紧密连锁的AFLP标记引物组合EA1/MC8的片段进行回收、克隆、测序，所得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示；
其中：EA1/MC8引物组合的序列如下：
EA1：5’-GACTGCGTACCAATTCAAA-3’，
MC8：5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’。
5)通过对步骤4)测序结果进行特异引物的设计，将筛选得到的与萝卜叶缘缺刻性状紧密连锁的AFLP标记转化为SCAR标记引物，该SCAR标记引物的DNA序列如下所示；
正向引物5’-ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3’，
反向引物5’-AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3’。
4.权利要求1所述的分子标记在辅助选择萝卜叶缘裂刻性状中的应用。
5.权利要求2所述的引物对在辅助选择萝卜叶缘裂刻性状中的应用。
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