CN103740817B - 基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法 - Google Patents

基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属生物技术领域，涉及基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法，其步骤为：利用ALP（Amplified Length Polymorphism）分子标记技术的特异性引物进行PCR反应，扩增待测红麻样本的线粒体DNA，能扩增出与细胞质雄性不育系具有相同特异性条带的即为含红麻雄性不育细胞质的材料。所述特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示的引物。本发明还提供用于红麻雄性不育细胞质分子鉴定方法的分子标记HM138。本发明采用ALP分子标记技术对红麻雄性不育细胞质材料进行了分子水平多态性检测。该方法鉴定速度快、准确率高、操作简单，非常适用于红麻细胞质雄性不育系的鉴定和分子标记辅助育种。

Description

基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法。
背景技术
红麻又称“洋麻”，是锦葵科木槿属一年生韧皮纤维作物。因其在长江流域及其以北地区不能自然留种，北方麻区每年要从华南地区引入大量种子。红麻表现出强大的杂种优势，其杂种优势率高达35%-40%。长期以来，红麻杂种优势利用是国内外红麻育种的主攻目标。
2008年9月，广西大学周瑞阳发明的“红麻野败型细胞质雄性不育系的选育方法”获得国家发明专利（ZL 200510019454.4）。按此方法已选育出了K03A（见：桂科鉴字第[2004]152号）、福3A、P3A、917A、722A、763A和L23A（见：桂科鉴字第[2007]177号）等7个细胞质雄性不育系，红麻杂种优势利用取得突破性进展。
但在农业生产中，由单一细胞质雄性不育系组配的杂交种的大面积推广和长期利用存在某一病害大流行的风险，因为该细胞质雄性不育系组配的杂交种可能成为某一病原微生物生理小种的哺育品种。解决这一问题的基本途径是选育出多种细胞质来源的雄性不育系，并在生产中推广不同细胞质来源的三系杂交种。
为了选育新的雄性不育细胞质，一般利用现有雄性不育保持系与现有种质资源测交的方法筛选，不但工作量很大，而且带有很大的盲目性。
若能找到一种雄性不育细胞质的分子标签，则可利用这种标签对现有种质资源进行鉴定，以发掘出新的雄性不育细胞质资源，继而选育出新的雄性不育系。由此将极大地提高工作效率，并有利于现有雄性不育系及其杂交种的知识产权保护。
关于红麻雄性不育细胞质分子鉴定方法，国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是解决目前缺乏红麻雄性不育细胞质分子鉴定方法的问题，提供基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法。
ALP（Amplified Length Polymorphism：扩增长度多态性）技术是针对特定的位点设计特异引物，进行PCR扩增检测，PCR产物的多态性称为ALP。本发明的目的是利用ALP技术解决红麻雄性不育细胞质的鉴定问题，提供一种红麻雄性不育细胞质的分子鉴定方法。
本发明提供的基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法，具体步骤如下：
用ALP分子标记技术的特异性引物进行PCR反应，扩增待测红麻样本的线粒体DNA，能扩增出与细胞质雄性不育系具有相同特异性条带的即为含红麻雄性不育细胞质的材料；
所述特异性引物为atp8BQ引物对：
正向引物5’-CCAACGACGATCCTATCCTAAA-3’（如SEQ IDNo.1所示）
反向引物5’-CTCCACTTACTCGATACAGGCTTT-3’（如SEQ IDNo.2所示）。
其中，所述PCR的反应体系如下：
反应体系用双蒸水补足到总体积20μl。
其中，PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃ 30s，55℃20s，72℃ 20s，扩增35个循环，最后72℃终延伸3min。
本发明还提供用于鉴定红麻雄性不育细胞质的atp8BQ引物对：
正向引物5’-CCAACGACGATCCTATCCTAAA-3’（如SEQ IDNo.1所示）
反向引物5’-CTCCACTTACTCGATACAGGCTTT-3’（如SEQID No.2所示）。
本发明还提供用于鉴定红麻雄性不育细胞质的分子标记HM138，其为用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物扩增出长度为138bp的特异性条带。
本发明的还一个目的在于提供所述基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法在红麻细胞质雄性不育系选育中的应用。
本发明的另一个目的在于提供用所述的标记或引物在鉴定红麻细胞质雄性不育系中的应用。
本发明采用ALP分子标记技术对含红麻雄性不育细胞质的红麻细胞质雄性不育系材料进行了分子水平的多态性检测，从本研究的结果中可以看出，两种标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此本发明的方法非常适用于对含红麻雄性不育细胞质的红麻细胞质雄性不育系材料进行鉴定和进行新红麻细胞质雄性不育系材料的分子标记辅助选育。
附图说明
图1为本发明实施例1中红麻UG93 CMS突变型P3A及其野生型UG93的atp8分子标记HM138电泳图。其中，M：marker，泳道1：P3A，泳道2：UG93。
图2为本发明实施例2中以分子标记HM138对多种红麻不育系、不育系杂交后代、保持系、恢复系检测的结果。其中泳道1-12依次为P3A，K03A，L23A，917A，722A，763A，F3A，（L23A/PA258）F1，B19，（K03A/B19）F1，（K03A/F3B）F1，（K03A/763B）F1；泳道13-25依次为UG93，P3B，K03B，L23B，917B，722B，763B，F3B，PA302，F302，PA258，PA299，992，泳道26-29依次为(P3A/992)F1，(917A/992)F1，(722A/992)F1，(P3A/992)F2，Maker为10bp DNAladder。
图3为本发明实施例3中以分子标记HM138检测结果的电泳图。图3a：Marker：10bp DNA ladder，泳道1：09-146自然（3迟），泳道2：P3A，泳道3：UG93，泳道4：MSI 135，泳道5：09-124自交（05-162选迟长粗），泳道6：09-124自然，泳道7：古巴8号，泳道8：ID85-1，泳道9：C1-7-1-1，泳道10：C1-7-1-2，泳道11：古巴6号-1，泳道12：古巴6号-2，泳道13：H094，泳道14：286，泳道15：福红航5号，泳道16：Y3-3-3-1，泳道17：96选，泳道18：09-154（5，迟粗长），泳道19：763B/K10-6（Tainling2）F1，泳道20：763B/制8R（福红航5号）F1，泳道21：（K03A/古巴6号）F2，泳道22：（K03A/NA126）F2，泳道23：（K03A/福3长花柱)F2，泳道24：ID85-2，泳道25：BG52-135，泳道26：85-339；图3b：泳道1：CK1（P3A），泳道2：NK11-83，泳道3：NK11-84，泳道4：NK11-70，泳道5：CK2（UG93），泳道6：NK11-69，泳道7：NK11-71，泳道8：NK11-72，泳道9：NK11-73，泳道10：NK11-75，泳道11：NK11-76，泳道12：NK11-77，泳道13：NK11-78，泳道14：NK11-79，泳道15：NK11-80，泳道16：NK11-81，泳道17：NK11-82，Marker：10bp DNA ladder；图3c：泳道1：KN142，泳道2：KN250，泳道3：ZB90，泳道4：P3A，泳道5：UG93，泳道6：辽34早-1，泳道7：辽259，泳道8：辽7435，泳道9：伊朗早熟，泳道10：航优1号，泳道11：ZH01，泳道12：浙萧麻1号，泳道13：7360A，泳道14：辽34早-2，泳道15：早熟红麻，泳道16：2-192，泳道17：F72，泳道18：ZF69，泳道19：ZF70，泳道20：ZF315，泳道21：09-87（C1-7-1-3），泳道22：09-88（Y3-3-3-2），泳道23：KB2-3，泳道24：C19-10-2，泳道25：粤152青皮，泳道26：莱阳红麻，泳道27：KN8裂选，泳道28：粤引751，泳道29：新会红麻，泳道30：09-7，泳道31：1D296，泳道32：K352，泳道33：9026-3，泳道34：KN325，泳道35：7804，泳道36：BG155，泳道37：AS226，Marker：10bp DNA ladder；图3d：Marker：10bp DNA ladder，泳道1：ky4-30，泳道2：ky4-32，泳道3：ky4-34，泳道4：ky4-35，泳道5：ky4-36，泳道6：金钱吊芙蓉F1，泳道7：P3A，泳道8：UG93，泳道9：P09-135-1，泳道10：P09-135-2，泳道11：P09-143-1，泳道12：P09-143-2，泳道13：P09-146-1，泳道14：P09-151-1，泳道15：P09-151-2，泳道16：P09-156-1，泳道17：P09-157-2，泳道18：P09-161-1，泳道19：P09-138-3，泳道20：P09-147，泳道21：P09-154，泳道22：P09-165；图3e：泳道1：UG93-2-2，泳道2：UG93-2-3/P3B，泳道3：26：09-84/09-20(古巴6号)F4，泳道4：UG93-2-3/763B单株，泳道5：UG93-2-3，泳道6：UG93-2-4，泳道7：UG93-2-6/11-26，泳道8：UG93-2-6/P3B，泳道9：UG93-2-6/763B，泳道10：UG93-2-6自然，泳道11：UG93-2-7自然，泳道12：UG93-2-8自然，泳道13：UG93-2-9自然，泳道14：UG93-2-11自然，泳道15：UG93-2-18，泳道16：UG93-2-23自然，泳道17：CK1（UG93），泳道18：UG93-2-12自然，泳道19：UG93-2-14自然，泳道20：L23BS/UG93-23，泳道21：UG93-2-17自然，泳道22：UG93-2ms-3/UG93-2-6//UG93-2-3全不育///GU93-2/3，泳道23：CK2（P3A），泳道24：UG93-2-22自交/P3B，泳道25：UG93-2-22自交/11-26，泳道26：UG93-2-22自交/763B，泳道27：UG93-2-22自然，Marker：10bp DNA ladder。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法
本实施例的试验材料为红麻细胞质雄性不育系P3A及其保持系P3B，均为公知公用品种，具体信息如下：
P3A：又名粤丰1号A，见发明专利ZL 200510019454.4（公开号CN100415083C）实施例3。
P3B：又名粤丰1号B，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系P3A的雄性不育保持系，见发明专利ZL 200510019454.4（公开号CN100415083C）实施例3。
1、红麻总DNA提取及纯化
①取0.1g新鲜红麻幼嫩叶片于研钵中，用液氮迅速研磨成粉末。
②将适量粉末转入2ml的EP管中，加入1ml预热至65℃的CTAB提取液（质量百分比2%的CTAB，100mM Tris-Hcl，20mM EDTA，1.4M Nacl，质量百分比2%的PVP，体积百分比2%的β-巯基乙醇），颠倒混匀，于65℃保温40-60min，其间摇动2-3次。
③取出EP管，稍冷却后，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1），颠倒混匀，4℃，12000r/min离心10min。
④取上清，加入1/10体积的CTAB/NaCl(10%CTAB in0.7M NaCl)溶液，65℃保温5-10min。加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比为24：1），颠倒混匀，4℃，12000r/min离心10min。
⑤重复步骤④，直至两相界面不出现白色蛋白层为止。
⑥取上清，加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，-20℃静置过夜（或-70℃静置30min），4℃，12000r/min离心15min。
⑦弃上清，用体积百分比75%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥后，加入600ul的ddH2O（含终浓度50ug/ml的RNase A），37℃保温30-45min。
⑧用等体积的氯仿/异戊醇（体积比为24：1）抽提2次，4℃，12000r/min离心10min。
⑨取上清，加入1/10体积3mol/L的NaAc，2倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置30min，4℃，12000r/min离心10min。
⑩弃上清，用体积百分比75%的乙醇洗涤沉淀2-3次，室温干燥后溶于20-30ul的ddH2O，-20℃保存备用。
2、基于atp8基因的分子标记
2.1引物
基于红麻UG93CMS突变型P3A中atp8基因的3’端比野生型多9个碱基，在此突变区两端的保守区设计一对特异引物：
atp8BQF：CCAACGACGATCCTATCCTAAA；
atp8BQR：CTCCACTTACTCGATACAGGCTTT。
据此开发的红麻雄性不育细胞质检测分子标记命名为HM138。
这个分子标记可以特异区别红麻雄性不育细胞质。
2.2PCR反应与检测
该分子标记PCR检测的20ul反应体系中包括20-50ng的DNA模板，2ul的10×Buffer，0.2mM dNTP，0.3uM的上下游引物，1U Taqplus，然后用ddH2O补足20ul。该反应混合物首先94℃预变性3min，然后94℃ 30s，55℃ 20s，72℃ 20s，扩增35个循环，最后72℃终延伸3min，PCR反应产物用质量百分比10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，上样量为0.8ul。
2.3红麻雄性不育细胞质的特有标记
基于UG93 CMS突变型P3A中atp8基因3’端发现9bp的插入突变，而野生型正常。因此，在缺失突变的两端设计特异引物对atp8BQ，开发了一个以PCR为基础的ALP分子标记，该分子标记在红麻UG93 CMS突变型P3A中扩增出138bp条带，故将此分子标记命名为HM138，而野生型UG93扩增出129bp条带（图1）。由于不育细胞质线粒体atp8基因3’端有9bp碱基插入，而可育细胞质表现正常，因此，电泳时不育细胞质的出现条带的位置离点样口较近，而可育细胞质出现条带的位置则相对较远，从而将不育细胞质（以MSC表示）与可育细胞质（以MFC表示）区别开来。
实施例2对已知不育细胞质和可育细胞质的检测
选择2类材料进行检测：（1）现有红麻细胞质雄性不育系（图2：泳道1-12）及由细胞质雄性不育系为母本与恢复系组配的杂交F1代和F2代（图2：泳道26-29），均为雄性不育细胞质；（2）现有保持系和恢复系，均为可育细胞质（图2：泳道13-25）。
具体的试验材料如下：
（1）红麻细胞质雄性不育系（具红麻雄性不育细胞质）
P3A：又名粤丰1号A，见发明专利ZL 200510019454.4（公开号CN100415083C）实施例3。
F3A：又名福红3号，见发明专利ZL 200510019454.4，公开号CN100415083C，实施例4。
917A：桂科鉴字[2004]第152号，广西大学周瑞阳老师等选育的细胞质雄性不育系，以UG93为细胞质供体，917为细胞核供体，经饱和回交选育而成，裂叶叶，茎秆浅红色。
722A：桂科鉴字第[2004]152号，广西大学周瑞阳老师等选育的细胞质雄性不育系，以UG93为细胞质供体，722为细胞核供体，经饱和回交选育而成，完全叶，茎秆绿色。
763A：桂科鉴字第[2004]152号，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系，以UG93为细胞质供体，泰红763为细胞核供体，经饱和回交选育而成，花为紫色，茎秆浅红色。
L23A：桂科鉴字第[2007]177号，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系。
K03A：桂科鉴字第[2004]152号，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系，见发明专利ZL 200510019454.4（公开号CN100415083C）。
UG93A：UG93是原产于乌干达的红麻野生种（从中国农业科学院麻类研究所引进）。2001年周瑞阳从海南种植的UG93中发现了雄性不育突变体，以该突变体为母本，以栽培品种为父本通过饱和回交的方法选育出了系列细胞质雄性不育系；同时，以该突变体为母本，以UG93中能保持雄性不育特性的株系UG93-2-6为细胞核供体，通过饱和回交选育而成的细胞质雄性不育系UG93A，其保持系（UG93-2-6）即为UG93B。
B19：以K03A为细胞质供体，以原产法国的红麻品种F305为细胞核供体（该品种为常规栽培品种，引自中国农业科学院麻类研究所），通过饱和回交选育而成的细胞质雄性不育系，命名为B19。
（2）红麻细胞质雄性不育系杂交后得到的F1代、F2代（理论上与亲本不育系具有相同的雄性不育细胞质）
（L23A/PA258）F1：即以L23A为母本，以PA258为父本杂交，得到的杂交一代种子即（L23A/PA258）F1种子，种植得到（L23A/PA258）F1植株。
（P3A/992）F1：即以P3A为母本，以992（又名福红992）为父本杂交，得到的杂交一代种子即（P3A/992）F1种子，种植得到（P3A/992）F1植株。
（P3A/992）F2：即种植（P3A/992）F1植株，隔离自由授粉，收获结出的种子，种植即得到（P3A/992）F2植株。
（917A/992）F1：即以917A为母本，以992为父本杂交，得到的杂交一代种子即（917A/992）F1种子，种植得到（917A/992）F1植株。
（722A/992）F1：即以722A为母本，以992为父本杂交，得到的杂交一代种子即（722A/992）F1种子，种植得到（722A/992）F1植株。
（K03A/B19）F1：即以K03A为母本，以B19为父本杂交，得到的杂交一代种子即（K03A/B19）F1种子，种植得到（K03A/B19）F1植株。
（K03A/F3B）F1：即以K03A为母本，以F3B为父本杂交，得到的杂交一代种子即（K03A/F3B）F1种子，种植得到（K03A/F3B）F1植株。
（K03A/763B）F1：即以K03A为母本，以763B为父本杂交，得到的杂交一代种子即（K03A/763B）F1种子，种植得到（K03A/763B）F1植株。
（3）红麻保持系、恢复系（具可育细胞质）
P3B：又名粤丰1号B，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系P3A的雄性不育保持系，见发明专利ZL 200510019454.4（公开号CN100415083C）实施例3。
F3B：广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系F3A的雄性不育保持系，见发明专利ZL 200510019454.4，公开号CN100415083C，实施例4。
917B：又名917，中国农业科学院麻类研究所选育的红麻品种，为917A的轮回亲本（细胞核供体亲本），917A的相应保持系。
722B：又名722，中国农业科学院麻类研究所选育的红麻品种，为722A的轮回亲本（细胞核供体亲本），722A的相应保持系。
763B：又名泰红763，为763A的轮回亲本（细胞核供体亲本），为763A的相对应保持系。
L23B：L23A的轮回亲本（细胞核供体亲本），为L23A的相对应保持系。
K03B：广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系K03A的雄性不育保持系，见发明专利ZL 200510019454.4（公开号CN100415083C）。
992：又名福红992，福建农林大学选育，2007年7月通过全国麻类品种鉴定委员会鉴定，品种鉴定编号：国品鉴麻2007005。
PA302：常用红麻品种，见《红麻野败型CMS胞质SNP分子标签的发掘》（金刚，周瑞阳，中国科技论文在线）。
F302：常用红麻品种，见《红麻野败型CMS胞质SNP分子标签的发掘》（金刚，周瑞阳，中国科技论文在线）。
PA299：常用红麻品种，见《红麻野败型CMS胞质SNP分子标签的发掘》（金刚，周瑞阳，中国科技论文在线）。
PA258：常用红麻品种，引自中国农业科学院麻类研究所，原产于巴基斯坦。
1、基于分子标记HM138的检测
选用分子标记HM138，操作方法参见实施例1，所用引物对为atp8BQF/atp8BQR。
电泳时，泳道1-12依次为P3A，K03A，L23A，917A，722A，763A，F3A，L23A/PA258，B19，K03A/B19，K03A/F3B，K03A/763B；泳道13-25依次为UG93A，P3B，K03B，L23B，917B，722B，763B，F3B，PA302，F302，PA258，PA299，992，泳道26-29依次为(P3A/992)F1，(917A/992)F1，(722A/992)F1，(P3A/992)F2，Maker为10bpDNA ladder。
结果显示，所有含不育细胞质材料的带型位置均无一例外地离点样口相对较近；而含可育细胞质材料的带型位置相对较远，与图1所标位置完全一致。说明该分子标签完全可用于不育细胞质和可育细胞质的鉴别。
实施例3对未知细胞质育性的红麻品种资源的细胞质检测
检测了119份红麻材料（25份来自UG93的株系，和94份红麻种质资源或从中选育的株系）。具体如下：
09-146自然（3迟），P3A，UG93，MSI 135，09-124自交（05-162选迟长粗），09-124自然，古巴8号，ID85-1，C1-7-1-1，C1-7-1-2，古巴6号-1，古巴6号-2，H094，286，福红航5号，Y3-3-3-1，96选，09-154（5，迟粗长），763B/K10-6（Tainling2）F1，763B/制8R（福红航5号）F1，（K03A/古巴6号）F2，（K03A/NA126）F2，（K03A/福3长花柱)F2，BG52-135，85-339；NK11-83，NK11-84，NK11-70，NK11-69，NK11-71，NK11-72，NK11-73，NK11-75，NK11-76，NK11-77，NK11-78，NK11-79，NK11-80，NK11-81，NK11-82，KN142，KN250，ZB90，辽34早-1，辽34早-2，辽259，辽7435，伊朗早熟，航优1号，ZH01，浙萧麻1号，7360A，早熟红麻，2-192，F72，ZF69，ZF70，ZF315，09-87（C1-7-1-3），09-88（Y3-3-3-2），KB2-3，C19-10-2，粤152青皮，莱阳红麻，KN8裂选，粤引751，新会红麻，09-7，1D296，K352，9026-3，KN325，7804，BG155，AS226，ky4-30，ky4-32，ky4-34，ky4-35，ky4-36，金钱吊芙蓉F1，P09-135-1，P09-135-2，P09-143-1，P09-143-2，P09-146-1，P09-151-1，P09-151-2，P09-156-1，P09-157-2，P09-161-1，P09-138-3，P09-147，P09-154，P09-165，UG93-2-2，UG93-2-3/P3B，09-84/09-20(古巴6号)F4，UG93-2-3/763B单株，UG93-2-3，UG93-2-4，UG93-2-6/11-26，UG93-2-6/P3B，UG93-2-6/763B，UG93-2-6自然，UG93-2-7自然，UG93-2-8自然，UG93-2-9自然，UG93-2-11自然，UG93-2-18，UG93-2-23自然，UG93-2-12自然，UG93-2-14自然，L23BS/UG93-23，UG93-2-17自然，UG93-2ms-3/UG93-2-6//UG93-2-3全不育///GU93-2/3，UG93-2-22自交/P3B，UG93-2-22自交/11-26，UG93-2-22自交/763B，UG93-2-22自然。
基于分子标记HM138的检测
选用分子标记HM138，操作方法参见实施例1，所用引物对为atp8BQF/atp8BQR。
结果显示，其中筛选出15份与不育细胞质一致的资源，这15份资源分别为：09-146自然（3迟）（图3a），NK11-83，NK11-84（图3b），KN142，KN250，ZB90（图3c），包括4个与红麻同属不同种的金钱吊芙蓉为母本与红麻栽培品种杂交的F1代ky4-32、ky4-34、ky4-35、ky4-36（图3d），和UG93-2-22及其与保持系回交材料：UG93-2-22自交/P3B，UG93-2-22自交/11-26，UG93-2-22自交/763B，UG93-2-22自然（图3e）。UG93-2-22是UG93野生型材料，在田间表现为可育，但检测显示其为不育细胞质，说明UG93-2-22具有恢复基因。利用上述不育细胞质资源为母本，以现有保持系为父本，已成功选育出了新的雄性不育系。由此表明上述标签用于鉴别红麻细胞质育性是可靠的。利用本标签同时检测到了8份红麻种质资源既有与不育胞质一致的条带又有与可育胞质一致的条带（以MS/FC表示）。这8份资源分别为：NK11-70（图3b），7804，BG55，AS226（图3c），Ky4-30（图3d），UG93-2-14自然，UG93-2-17自然，L23BS/UG93-23，UG93-2-12自然（图3e），这种既有不育条带又有可育条带的材料是否能作为不育细胞质材料使用，尚不明确
综上所述，本发明采用ALP分子标记技术对含红麻雄性不育细胞质的红麻细胞质雄性不育系材料进行了分子水平的多态性检测，从本研究的结果中可以看出，分子标记HM138鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此本发明的方法非常适用于对含红麻雄性不育细胞质的红麻细胞质雄性不育系材料进行鉴定和进行新红麻细胞质雄性不育系材料的分子标记辅助选育。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法，其特征在于，具体步骤如下：
用ALP分子标记技术的特异性引物进行PCR反应，扩增待测红麻样本的线粒体DNA，能扩增出与细胞质雄性不育系具有相同特异性条带的即为含红麻雄性不育细胞质的材料；
所述特异性引物为atp8BQ引物对：
正向引物5’-CCAACGACGATCCTATCCTAAA-3’(如SEQ ID No.1所示)
反向引物5’-CTCCACTTACTCGATACAGGCTTT-3’(如SEQ ID No.2所示)。
2.如权利要求1所述的基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法，其特征在于，其PCR反应体系如下：
反应体系用双蒸水补足到总体积20μl。
3.如权利要求1所述的基于红麻atp8基因鉴定雄性不育细胞质的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃20s，72℃20s，扩增35个循环，最后72℃终延伸3min。
4.用于权利要求1所述红麻雄性不育细胞质分子鉴定方法的atp8BQ引物对，其特征在于，其为：
正向引物5’-CCAACGACGATCCTATCCTAAA-3’(如SEQ ID No.1所示)
反向引物5’-CTCCACTTACTCGATACAGGCTTT-3’(如SEQ ID No.2所示)。
5.用于权利要求1所述红麻雄性不育细胞质分子鉴定方法的分子标记HM138，其为用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物扩增出长度为138bp的特异性条带。
6.如权利要求1-3任一项所述的红麻雄性不育细胞质分子鉴定方法在红麻细胞质雄性不育系选育中的应用。
7.如权利要求4所述的引物在鉴定红麻细胞质雄性不育系中的应用。
8.如权利要求5所述的分子标记在鉴定红麻细胞质雄性不育系中的应用。
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