CN102140517A

CN102140517A - 一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法

Info

Publication number: CN102140517A
Application number: CN 201110007410
Authority: CN
Inventors: 巩振辉; 黄炜; 吉姣姣; 逯明辉; 陈儒钢
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2031-01-14
Also published as: CN102140517B

Abstract

本发明公开了一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，该方法首先人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，以引物对辣椒线粒体DNA进行PCR扩增，并对扩增产物以0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，若电泳结果中出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是不育型细胞质植株；若电泳结果中没有出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是可育型细胞质植株。其步骤简单快捷、稳定可靠，鉴别结果与田间花器官育性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种，能够很好地提高选择效率，加速育种进程。

Description

一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法

技术领域

本发明属于辣椒育种领域，涉及一种植物分子标记方法，尤其涉及一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记辅助育种的方法。

背景技术

辣椒是一种重要的常异花授粉蔬菜作物，杂种优势非常明显。目前我国辣椒杂交种在生产上已占据主要地位，主要推广品种都是品种间或自交系间一代杂交种。这类杂交种子在生产上虽然增产潜力很大，但其制种时必须人工去雄，费工费时，而且由于辣椒雌雄同花同位，种子纯度很难保证，成本较高。辣椒雄性不育性状的利用，解决了杂种优势人工制种去雄这一难题，降低了生产成本，成为杂交种选育的有效途径。

辣椒雄性不育可分为细胞核雄性不育（GMS）和核质互作雄性不育（CMS），其中利用核质互作型辣椒雄性不育需要同时选育“三系”，包括雄性不育系，控制育性的基因型为S（msms），为不育型细胞质；保持系，控制育性的基因型为N（msms），为可育型细胞质；恢复系，控制育性的基因型为N（MsMs）或S（MsMs）。辣椒三系中不育系的不育性由核不育基因和细胞质内的不育因子互作控制，属于核质雄性不育（CMS）。只有核不育基因与细胞质不育因子共同存在时，才能引起雄性不育。这种类型的不育性既要筛选到保持系，又要找到恢复系，才能可以实现三系配套。然而辣椒核质互作雄性不育系在生产上的应用受到很多不利因素的限制。首先是育性恢复基因的分布不广泛，尤其在灯笼型辣椒类型中分布更少，配组自由度很低，大大限制了其应用，是目前不育系应用的最大阻碍。其次是不育源较少，选育周期长。这些已成为辣椒质核互作雄性不育性利用的瓶颈。

开展辣椒生物技术的研究，使之与常规育种技术更紧密地结合。辣椒CMS雄性不育系、保持系和恢复系的选育周期长，如果能找到与不育基因或恢复基因紧密连锁的标记，必将有助于缩短这个过程。近年来发展起来的DNA分子标记具有量大、中性、可在任何时期分析、不受植株生长发育环境条件的影响等优点，为利用分子标记辅助选择辣椒雄性不育系和CMS恢复系提供了可能。

发明内容

针对上述背景技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，该方法步骤简单快捷、稳定可靠，鉴别结果与田间花器官育性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种，能够很好地提高选择效率，加速育种进程。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，其特征在于，该方法按以下步骤进行：

1）人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中：

正向引物：5’-CCCACACAAGACACATCACA-3’；

反向引物：5’-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3’；

2）提取辣椒线粒体DNA，以步骤1）的引物对辣椒线粒体DNA进行PCR扩增，并对扩增产物以0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳；

3）对电泳结果进行分析，若电泳结果中出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是不育型细胞质植株；若电泳结果中没有出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是可育型细胞质植株。

上述PCR扩增的具体实现条件是：

（1）15 μL PCR反应体系：10倍PCR buffer 1.5 μL、25 mmol·L^-1 MgCl₂ 1.2 μL、5 U·μL^-1 Taq DNA聚合酶0.12 μL、5mmol·L^-1 dNTPs 0.3μL、20 μmol·L^-1正向引物1.0 μL、20μmol·L^-1反向引物1.0μL、40ng·μL^-1mtDNA 0.5μL以及ddH₂O 9.38μL；

（2）PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件是：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1 min，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min；于4℃保存备用。

上述辣椒线粒体DNA采用高盐-蛋白酶K法提取。

本发明的苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，采用人工设计合成特异核苷酸分子，以辣椒CMS雄性不育系、保持系线粒体DNA为模板扩增，创建和优化辣椒CMS雄性不育性状可育型细胞质与不育型细胞质的分子标记技术体系，开发出与辣椒CMS细胞质育性紧密连锁的分子标记，以期加快辣椒CMS雄性不育分子育种进程。这一方法用于辣椒苗期细胞质育性筛选，能极大地加速辣椒CMS雄性不育亲本系的选育及杂种一代的育种进程。

附图说明

图1是3个辣椒CMS雄性不育系及其3个保持系线粒体DNA PCR扩增产物0.8 %琼脂糖凝胶电泳分析示意图。

图2是本发明所提供的第一实施例中6个辣椒品系线粒体DNA PCR扩增产物0.8 %琼脂糖凝胶电泳分析示意图。

图3是本发明所提供的第二实施例中6个辣椒品系线粒体DNA PCR扩增产物0.8 %琼脂糖凝胶电泳分析示意图。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

参见图1，图1是3个辣椒CMS雄性不育系及其3个保持系线粒体DNA经PCR扩增后，其R扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析示意图，其中，图中的标记分别是：

M表示Biomed DM09-50 bp Ladder DNA Marker泳道；1表示不育系200A的扩增产物泳道；2表示保持系200B的扩增产物泳道；3表示不育系201A的扩增产物泳道；4表示保持系201B的扩增产物泳道；5表示不育系202A的扩增产物泳道；6表示保持系202B的扩增产物泳道。

发明人给出以下的实施例，这些实施例仅是用于理解本发明，本发明不限于这些实施例。

实施例1：

1、人工设计合成一对特异核苷酸序列为引物，其中：

正向引物：5’-CCCACACAAGACACATCACA-3’

反向引物：5’-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3’

2、辣椒线粒体DNA的提取：采用高盐-蛋白酶K法（刘光照等，辣椒不育系和保持系线粒体差异基因获得及SNP分析[J]，中国农业大学学报，2010，15（5）：19~24）分别提取6个辣椒品系T130、P65、GS102、PB3、B40、L33的线粒体DNA。

3、以步骤1的引物分别对上述6个辣椒品系线粒体DNA进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，参见图2，T130、GS102、L33的植株可出现长度为270bp的特异条带，鉴别为不育型细胞质；而P65、PB3、B40的植株无此条带，鉴别为可育型细胞质；其中，M是Biomed DM09-50 bp Ladder DNA Marker泳道；1是T130的扩增产物泳道；2是P65的扩增产物泳道；3是GS102的扩增产物泳道；4是PB3的扩增产物泳道；5是B40的扩增产物泳道；6是L33的扩增产物泳道。

PCR扩增体系如下：

（1）15μL PCR反应体系：10倍PCR buffer：1.5 μL，25 mmol·L^-1 MgCl₂ 1.2μL，5 U·μL^-1 Taq DNA聚合酶0.12μL，5 mmol·L^-1 dNTPs 0.3μL，20μmol·L^-1正向引物1.0μL，20μmol·L^-1反向引物1.0μL，mtDNA 0.5μL（40 ng·μL^-1），ddH₂O 9.38μL。

（2）PCR扩增反应在ABI 2720型PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。随后于4℃保存备用。

上述6个辣椒品系在田间测交结果表明：品系T130、GS102、L33具有不育型细胞质，而品系P65、PB3、B40具有可育型细胞质。因此，利用本发明创制的鉴别苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记与植株真实性状相一致，适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种。

实施例2：

1、人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中：

正向引物：5’-CCCACACAAGACACATCACA-3’

反向引物：5’-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3’

2、辣椒线粒体DNA的提取：采用高盐-蛋白酶K法（刘光照等，辣椒不育系和保持系线粒体差异基因获得及SNP分析[J]，中国农业大学学报，2010，15（5）：19~24）分别提取6个辣椒品系P121、P134、K12、K35、FG42、M10的线粒体DNA。

3、以步骤1所述特异核苷酸序列为引物，分别对上述6个辣椒品系线粒体DNA进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，参见图3，P134、K35、FG42的植株可出现长度为270bp的特异条带，鉴别为不育型细胞质；而P121、K12、M10的植株无此条带，鉴别为可育型细胞质；其中，M是Biomed DM09-50 bp Ladder DNA Marker泳道；1是P121的扩增产物泳道；2是P134的扩增产物泳道；3是K12的扩增产物泳道；4是K35的扩增产物泳道；5是FG42的扩增产物泳道；6是M10的扩增产物泳道。

PCR扩增体系如下：

（1）15μL PCR反应体系：10倍PCR buffer：1.5 μL，25 mmol·L^-1 MgCl₂ 1.2 μL，5 U·μL^-1 Taq DNA聚合酶0.12μL，5 mmol·L^-1 dNTPs 0.3μL，20μmol·L^-1正向引物1.0μL，20μmol·L^-1反向引物1.0μL，mtDNA 0.5μL（40ng·μL^-1），ddH₂O 9.38μL。

（2）PCR扩增反应在ABI 2720型PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10 min。随后于4 ℃保存备用。

上述6个辣椒品系在田间测交结果表明：品系P134、K35、FG42具有不育型细胞质，而品系P121、K12、M10具有可育型细胞质。因此，利用本发明创制的鉴别苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记与植株真实性状相一致，适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种。

Claims

1.一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，其特征在于，该方法按以下步骤进行：

1）人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中：

正向引物：5’-CCCACACAAGACACATCACA-3’；

反向引物：5’-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3’；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件是：

（1）15 μL PCR反应体系：10倍PCR buffer 1.5 μL、25 mmol·L^-1 MgCl₂ 1.2 μL、5U·μL^-1 Taq DNA聚合酶0.12 μL、5mmol·L^-1 dNTPs 0.3 μL、20 μmol·L^-1正向引物1.0 μL、20 μmol·L^-1反向引物1.0 μL、40 ng·μL^-1mtDNA 0.5 μL以及ddH₂O 9.38 μL；

（2）PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件是：94℃预变性5min；94 ℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min；于4℃保存备用。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辣椒线粒体DNA采用高盐-蛋白酶K法提取。