CN110184378B - 三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的分子鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的分子鉴定方法，其InDel分子标记为36bp的核苷酸序列缺失，InDel分子标记引物如SEQ ID NO.2‑3所示。采用InDel分子标记引物进行PCR扩增，如果片段长度为275bp的条带，则为不含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的材料；如果片段长度为239bp的条带，则为三裂棉细胞质雄性不育恢复基因位点纯合的恢复系材料；如果PCR产物电泳结果同时出现两条，片段长度为275bp和239bp的两条带，则为恢复基因杂合位点的材料。本发明可以加快恢复系选育和改良进程，缩短选育周期，同时保证恢复系种子和三系杂交种子的纯度，显著减少田间材料性状调查的工作量。

Description

三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的分子鉴定方法

技术领域

本发明属分子标记开发与育种应用领域，具体为一个InDel标记及其对应的引物对三裂棉细胞质雄性不育恢复基因鉴定和分子标记辅助育种的运用。

背景技术

棉花是世界上重要的经济作物，重要的纤维能源作物，也是重要的工业原料，棉花在世界农业生产中具有重要的地位和意义。棉花属于常异花授粉作物，常异花授粉为棉花的杂种优势的研究与利用提供了生物学基础。棉花杂种优势的研究和利用已经显著提高棉花产量、改良棉花品质、提高棉花多重抗性等。广泛存在于植物中的细胞质雄性不育现象是杂交育种和利用杂种优势的重要工具，也是作物最理想的育种材料，细胞质雄性不育可以获得彻底不育的母本，省去大面积繁殖制种过程中的去雄工作。降低杂交种生产成本，提高种子纯度，最大限度地提高经济效益。

目前，哈克尼西棉细胞质雄性不育和三裂棉细胞质雄性不育是研究得较多且有应用价值的两套三系相配套的材料。哈克尼西棉胞质不育三系已经用于生产实践，以哈克尼西棉细胞质雄性不育三系培育的杂交种已经通过国家审定并已经进行推广。有报道，哈克尼西棉细胞质雄性不育系相配套的三系所制的杂交种的不育胞质会产生一定的不良效应，其相配套的恢复系较少，且受光和温度影响较大，在长日照高温条件下恢复系出现少粉的现象导致花粉量不足，F2群体性状分离出现不育株，并且有衰退现象。三系配套杂交制种的种质资源匮乏，细胞质雄性不育恢复基因来源狭窄，强优势三系杂交组合选育缓慢，导致选育的三系杂交种品种通过审定推广的数量较少。

三裂棉细胞质雄性不育的三系遗传简单，不育系彻底败育易于恢复，不育系和保持系有一样的核遗传背景，恢复系的核基因具有恢复育性功能，恢复系恢复不育系的功能受一对显性基因控制。三裂棉细胞质雄性不育是配子体不育，当配子体内的核基因为rf时该配子不育。三裂棉细胞质雄性不育三系配套的不育系与恢复系杂交获得F₁代全部可育，保持系N(rf₂rf₂)与该F₁代回交获得BCF₁代，回交群体内全部可育没有性状分离现象；不育系与恢复系杂交获得F₂代植株也都是可育的，因此，三裂棉细胞质雄性不育三系的研究与利用可以降低杂交种利用的风险。三裂棉细胞质雄性不育在制种过程中如果恢复系混入杂合种子，为棉农造成的经济损失相对较小。

分子标记辅助选择育种可以忽略作物生长条件和环境条件，可以对无法或者很难通过传统育种方法做性状选择的表型进行鉴定加以选择，进而加快回交育种进程，消除不利性状基因位点的连锁，达到省时高效低成本的目的。同时，分子标记辅助育种的育种目标明确即获得恢复力强、综合农艺性状良好的恢复系，可以适量减少群体种植的规模。插入缺失(InDel，insertion-deletion)标记具有共显性、位点特异性、扩增产物稳定和易于检测等优点。InDel标记在基因组中密度大、数目众多、分布广泛且相对均匀。棉花参考基因组测序数据的公布，降低了开发与目标性状紧密连锁的InDel标记的成本。

本发明开发一个与三裂棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的InDel标记，用于优良恢复系的选育和杂交种的实践生产，为三裂棉细胞质雄性不育三系杂交种的选育提供分子标记辅助选择育种的稳定遗传的InDel标记，可缩减育种时间，以满足生产实践需求。

发明内容

本发明的目的是解决传统育种方法在三裂棉细胞质雄性不育恢复系选育过程中的田间工作量大，性状调查所需时间长且准确性差，时间物力财力消耗大等的问题，提供一种三裂棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的InDel分子标记、分子标记引物及分子鉴定方法，从而可以加快恢复系选育和改良进程，缩短选育周期，同时保证恢复系种子和三系杂交种子的纯度。

本发明首先提供了一种三裂棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的InDel分子标记，其特征是，在陆地棉染色体ChrD05：54213468-54213503有36bp核苷酸序列缺失(缺失序列为5’-TATTTGCACCCTAAGCAATAGTTTTAGAACAATTAA-3’，SEQ ID NO.1)，可通过琼脂糖凝胶电泳鉴定棉花单株是否含有三裂棉细胞质雄性不育恢复基因。

本发明还提供了一对与三裂棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的InDel分子标记引物，其特征是，其上游引物为：5’-AATCCCACCTCTCCTCTCCAA-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物为：5’-TCTATGACGGCAATCGCAACA-3’(SEQ ID NO.3)。

本发明还提供了上述的InDel分子标记引物对三裂棉细胞质雄性不育恢复基因位点的鉴定。

本发明还提供了上述的InDel分子标记引物在三裂棉细胞质雄性不育恢复系材料的选育方面的应用。

本发明还提供了一种三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的分子鉴定方法，其特征是：

1)采用上述的InDel分子标记引物对待测的三裂棉细胞质雄性不育三系棉花材料的基因组DNA进行PCR扩增；

2)对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分析；

PCR产物电泳结果一条带，如果片段长度为275bp的条带，则为不含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的材料(保持系或者不育系)；如果片段长度为239bp的条带，则为三裂棉细胞质雄性不育恢复基因位点纯合的恢复系材料；

如果PCR产物电泳结果同时出现两条，片段长度为275bp和239bp的两条带，则为三裂棉细胞质雄性不育恢复基因杂合位点的材料。

优选的，PCR反应体系(20μl)为：ddH₂O 13.4μl，dNTPs 1.6μl，10x buffer 2μl，Taq(5U/μl,全式金公司)0.4μl，上游引物(10μM)0.8μl，下游引物(10μM)0.8μl，DNA(50-300ng/μl)1μl。

PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；然后72℃终延伸2min，4℃保存。

本发明把InDel分子标记转化为InDel分子标记引物，通过简单的PCR、琼脂糖凝胶电泳等操作即可，可以加快田间三裂棉细胞质雄性不育优良恢复系的选育，准确高效的鉴定恢复系的种子，成功地将分子标记辅助选择育种技术应用于棉花新恢复系选育和三系杂交种的制种工作中。

本发明提供的方法，可以用来鉴定三裂棉细胞质雄性不育相配套的恢复系的种质资源，促进三裂棉细胞质雄性不育恢复系材料的选育和改良，缩短育种时间，显著减少田间材料性状调查的工作量，提高准确性，提高鉴定效率，确保恢复系材料和恢复系种子的纯度，减少育种投入成本。本发明为三裂棉细胞质雄性不育杂交种用于实践生产提供恢复基因鉴定以及追踪的稳定遗传的InDel标记。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)目前对于哈克尼西棉细胞质雄性不育三系的分子标记研究较多，但是对于三裂棉的分子标记鲜有报道，本发明首次提供了一种三裂棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的InDel分子标记、引物及分子鉴定方法，可以促进三裂棉细胞质雄性不育恢复系材料的选育和改良，进而促进三裂棉细胞质雄性不育三系运用于实践生产杂交种的进程，降低杂交种利用的风险(相比目前采用哈克尼西棉细胞质雄性不育三系杂交种)。同时本发明的扩增引物的条带清晰，两条带间隔距离明显，容易判读，实用性好。

2)准确率高：InDel标记具有位点特异性、扩增产物稳定等优点，本发明利用一对InDel标记引物，能够从DNA水平上鉴定三裂棉细胞质雄性不育恢复基因，且不受植株生育时期和环境因素的影响，提高了恢复基因鉴定的准确性。

3)操作简单，鉴定快速：该InDel标记对三裂棉细胞质雄性不育恢复系材料的选育和三系杂交种种子纯度鉴定方面具有重要应用价值。与常规育种相比，InDel标记辅助选择育种节约了大量人力、物力。在恢复系改良、构建新的恢复系以及三系杂交制种过程中，不再需要大量田间性状调查，可减少回交试验。鉴定过程为提取待测材料基因组DNA，用该InDel引物特异性扩增后通过琼脂糖凝胶电泳就可鉴定，整个鉴定过程短时高效。

4)简单实用：已报道的与三裂棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的RAPD、STS、SSR等标记，这些标记特异性差，不能稳定遗传，特异性扩增之后电泳技术要很高，操作繁琐，鉴定过程耗时费力。InDel标记检测过程简单快速，成本低，对仪器设备和技术要求较低，在琼脂糖凝胶电泳技术平台上即可进行。以InDel标记引物进行PCR扩增时，没有非特异性条带。本发明的InDel分子标记应用三裂棉细胞质雄性不育恢复系的分子辅助选择育种研究中具有重要作用。

附图说明

图1为三裂棉细细胞质雄性不育相配套的三系材料(不育系A、保持系B、恢复系R)，用该标记的引物特异性扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；

图2为InDel标记对三裂棉细胞质雄性不育三系构建的回交群体编号为1425-1448单株的基因组DNA为模板，用该引物特异性扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。编号为1的带型为不含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的单株，在275bp位置出现特异条带；编号为2的带型为三裂棉细胞质雄性不育恢复基因位点杂合的单株，同时出现275bp和239bp的目标条带。其中13泳道即植株编号为1437为含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因纯合位点单株，鉴定为群体内的杂株。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：

本发明的InDel分子标记，为缺失36bp的缺失序列5’-TATTTGCACCCTAAGCAATAGTTTTAGAACAATTAA-3’(SEQ ID NO.1)。所述InDel标记的缺失位点在陆地棉染色体ChrD05：54213468-54213503(参考南京农业大学的陆地棉测序结果，下载网址为http:// mascotton.njau.edu.cn/info/1054/1118.htm)。

在该标记的上下游根据该InDel位点、序列和PCR引物设计原则，设计引物，成功将其转化为InDel标记引物，扩增该InDel分子标记的引物对如表1：

表1：InDel分子标记引物

在三裂棉细胞质雄性不育恢复系纯合恢复系基因组中特异性扩增缺失变异的序列为239bp的条带，在三裂棉细胞质雄性不育恢复基因杂合材料的基因组中扩增275bp和239bp的条带，在不含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的材料(保持系或者不育系)基因组特异性扩增275bp的条带。

三裂棉细细胞质雄性不育相配套的三系材料(不育系A、保持系B、恢复系R)，用该标记的引物特异性扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，从图1可以看出：恢复系R在239bp处有特异条带，而不育系A和保持系B则在275bp位置出现特异条带。

实施例2：

1、三裂棉雄性不育(CMS-D8)三系构建的回交一代群体(BCF1)的种子DNA的提取采用CTAB法。

2、利用该InDel分子标记引物，对提取的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系如表2。

表2 20μl PCR反应体系

PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；然后72℃终延伸2min，4℃保存。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶(2.5％)电泳，在1×TAE的电泳缓冲液中电泳检测，电压80-90V，电流100mA，40min-60min，用凝胶成像系统拍照保存，并对电泳结果进行条带分析。

3、检测结果

判断标准：统计中凡是仅出现239bp条带的为含有纯合的三裂棉细胞质雄性不育恢复基因即为三裂棉细胞质雄性不育的恢复系；仅出现275bp条带即为不含有恢复基因的材料(保持系或者不育系)；若同时出现275bp和239bp的条带则为含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因杂合位点的材料。

采用InDel标记对三裂棉细胞质雄性不育三系构建的回交群体编号为1425-1448单株的基因组DNA为模板，用该引物特异性扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。从图2可以看出：编号为1的带型为不含恢复基因的单株，在275bp位置出现特异条带；编号为2的带型为恢复基因位点杂合的单株，同时出现275bp和239bp的目标条带。其中泳道13即植株编号为1437，其带型为含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因纯合位点单株，为群体内的杂株，可能是播种过程中的机械混杂造成的，性状调查为可育但无法确定基因型，标记鉴定为群体的杂株。标记鉴定结果与高通量SNP基因分型结果一致。

通过上述步骤即可简单快速准确的鉴定三裂棉细胞质雄性不育恢复基因，区分材料的基因型，保证恢复系的纯度，显著降低田间材料鉴定的工作量，缩短优良恢复系和杂交育种的周期，降低育种成本。也可以加快三裂棉细胞质雄性不育三系材料的转育，加快构建含有三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的优良渐渗系，促进三裂棉细胞质雄性不育三系运用于实践生产杂交种的进程。

以上所述，仅为本发明最佳的实施方式，任何熟悉该技术领域的科技人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地获得的技术方案的简易变化或等效替换均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的分子鉴定方法

<130> 0

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 陆地棉染色体ChrD05：54213468-54213503的36bp核苷酸序列缺失

<400> 1

tatttgcacc ctaagcaata gttttagaac aattaa 36

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 三裂棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的InDel分子标记上游引物

<400> 2

aatcccacct ctcctctcca a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 三裂棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的InDel分子标记下游引物

<400> 3

tctatgacgg caatcgcaac a 21

Claims (3)

1.InDel分子标记引物在三裂棉细胞质雄性不育恢复系及杂交种的种子纯度鉴定方面的应用，所述InDel分子标记引物是根据三裂棉细胞质雄性不育恢系与陆地棉参考基因组相比，三裂棉细胞质雄性不育恢系染色体ChrD05上有如SEQ ID NO.1所示的36bp核苷酸序列缺失设计，能够通过琼脂糖凝胶电泳鉴定棉花单株是否含有三裂棉细胞质雄性不育恢复基因，其上游引物为：5’-AATCCCACCTCTCCTCTCCAA-3’；下游引物为：5’-TCTATGACGGCAATCGCAACA-3’；所述陆地棉参考基因组记载在http://mascotton.njau.edu.cn/info/1054/1118.htm。

2.InDel分子标记引物在三裂棉细胞质雄性不育恢复系材料的选育方面的应用，所述InDel分子标记引物是根据三裂棉细胞质雄性不育恢系与陆地棉参考基因组相比，三裂棉细胞质雄性不育恢系染色体ChrD05上有如SEQ ID NO.1所示的36bp核苷酸序列缺失设计，能够通过琼脂糖凝胶电泳鉴定棉花单株是否含有三裂棉细胞质雄性不育恢复基因，其上游引物为：5’-AATCCCACCTCTCCTCTCCAA-3’；下游引物为：5’-TCTATGACGGCAATCGCAACA-3’；所述陆地棉参考基因组记载在http://mascotton.njau.edu.cn/info/1054/1118.htm。

3.一种三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的分子鉴定方法，其特征是：

1)采用InDel分子标记引物对待测的三裂棉细胞质雄性不育三系棉花材料的基因组DNA进行PCR扩增；

所述InDel分子标记引物是根据三裂棉细胞质雄性不育恢系与陆地棉参考基因组相比，三裂棉细胞质雄性不育恢系染色体ChrD05上有如SEQ ID NO.1所示的36bp核苷酸序列缺失设计，能够通过琼脂糖凝胶电泳鉴定棉花单株是否含有三裂棉细胞质雄性不育恢复基因，其上游引物为：5’-AATCCCACCTCTCCTCTCCAA-3’；下游引物为：5’-TCTATGACGGCAATCGCAACA-3’；所述陆地棉参考基因组记载在http://mascotton.njau.edu.cn/info/1054/1118.htm；

2)对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分析；

PCR产物电泳结果一条带，如果片段长度为275bp的条带，则为不含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的材料；如果片段长度为239bp的条带，则为三裂棉细胞质雄性不育恢复基因位点纯合的恢复系材料；

如果PCR产物电泳结果同时出现两条，片段长度为275bp和239bp的两条带，则为三裂棉细胞质雄性不育恢复基因杂合位点的材料。

Images