CN108754013B - 一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用 - Google Patents

一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用，利用细胞质雄性不育系材料YJ15和恢复系材料XJ07构建了F2分离群体HS；同时，用YJ15和恢复系材料XJ02构建了另一个F2分离群体BL。采用极端混池结合RNA‑Seq及重组单株分析法对HS群体进行恢复基因定位，最终获得与恢复基因紧密连锁的染色体区域和候选基因，进一步根据候选基因附近的变异设计分子标记CaML。采用该标记对HS群体进行鉴定，符合率达到100％，用该标记对BL群体进行鉴定，符合率达到93.2％。本发明为辣椒细胞质雄性不育恢复基因的克隆和相关育种工作提供了紧密连锁的分子标记，具有重要的利用价值。

Description

一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及 其获得方法和应用
技术领域
本发明属于辣椒遗传育种和分子生物学领域，具体涉及一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)为茄科辣椒属一年生或多年生植物，在全球范围内广泛种植，是一类重要的蔬菜作物。辣椒起源于南美洲，其人工驯化和栽培历史超过6000年。大约于明朝后期(16世纪)，辣椒传入我国。现已成为我国尤其是长江流域一带人民日常食谱的重要组成部分。
如何高效选育高产优质辣椒品种一直以来备受辣椒育种工作者的关注，我国当前辣椒育种仍以基于田间表型选择的传统育种方式为主，现代化的分子育种水平还比较低。近年来，辣椒基因组学研究取得重要进展，特别是Zunla和CM334全基因组序列的释放，为辣椒分子标记的开发及其在遗传育种中的应用提供了便利。
细胞质雄性不育(CMS)是广泛存在于高等植物中的一种自然现象，表现为雌蕊正常但是花粉败育，是一种母系遗传现象。目前细胞质雄性不育系已被应用于辣椒三系育种中，以不育系为母本、恢复系为父本杂交得到杂种一代；以不育系为母本、保持系为父本可以得到纯种的不育系种子以保持不育系的繁殖。这种制种方法省去了繁重的去雄工作，大大提高了制种效率，同时保证了杂种一代种子的纯度。然而，辣椒细胞质雄性不育育性恢复方面目前还没有一个很可靠的候选基因。在以往的研究探索中，研究人员陆续开发了一些RAPD和AFLP标记，如OPP13-CAPS、AFRF8-CAPS、PR-CAPS和CRF-SCAR(Lee et al 2008；Kimet al 2006；Gulyas et al 2006)，但这些标记在实际的生产应用过程中表现并不理想。最近辣椒CMS恢复基因的研究中，定位了一段与辣椒育性恢复共分离的基因组片段，并将一个PPR类型的基因CaPPR6作为候选基因，进一步开发了相关的分子标记。但是，当把这些标记运用于育种过程中时，标记的基因型并不能很好地与表型相符合(Ha et al 2017)。此外，由于细胞质不育源可能不同，其恢复基因也可能不同，标记的通用性受制于不育源。
目前，辣椒育种主要仍然采用常规手段。传统的育种手段存在费时、费工、准确性差并且易受环境因素影响等弊端。而基于分子标记辅助选择(Marker AssistedSelection，MAS)技术的分子标记辅助育种，利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测连锁的分子标记，即可判断目标基因的存在和状态，达到选择目标性状的目的，具有检测时期早、检测速度快、结果准确并且不受环境条件干扰的优点，因而得到广大育种家的青睐。
目前辣椒育种中仍然缺乏可靠的细胞质雄性不育育性恢复基因标记，基于此，做出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML及其获得方法和应用。本发明的分子标记可用于辣椒细胞质雄性不育育性恢复性鉴定。利用本发明的分子标记可以有效区分辣椒材料中是否含有CMS的恢复基因，结合三系育种策略可高效创制辣椒新品种，还为克隆辣椒CMS育性恢复基因进而解析育性恢复的分子机理奠定重要基础。
为了实现本发明上述第一个目的，本发明提供了一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML，所述分子标记是由与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SNP位点设计的基因分型引物转化而来。
进一步地，上述技术方案中所述的引物包含正向引物CaML-F和反向引物CaML-R，正反向引物分别如下：
正向引物CaML-F：5’-TGGCCTTGCAATCCGTTATG-3’，(SEQ ID NO.1)；
反向引物CaML-R：5’-TGCTAGTGTTACGGGTATGCTC-3’，(SEQ ID NO.2)。
本发明的第二个目的在于提供上述所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的获得方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以细胞质雄性不育系材料YJ15为母本，恢复系材料XJ02和XJ07为父本，分别构建F2分离群体BL和HS；
(2)F2群体种植在塑料大棚内，外覆防虫网，按照辣椒标准化生产模式管理，通过对F2植株坐果、花器官和花粉活力鉴定，确定植株的育性；选取可育植株和不育植株各30株，分别采集即将开放且大小相对一致的花蕾混合作为极端池，使用植物RNA快速提取试剂盒TRIzol提取辣椒RNA并送测序公司在HISeq4000测序平台进行双端150bp测序；
(3)获得混池+RNA-Seq(BSR)数据后，利用FastQC软件对测序数据质量进行评估，使用Trimmomatic去除接头、低质量和含N较多的reads，对测序数据进行质量控制；然后使用hisat2将各reads比对到辣椒参考基因组(Zunla_V2)，获得的比对文件数据利用samtools软件以及自主开发的Perl脚本提取多态性SNP，并且计算隐性池的最大等位基因型频率(SNP-index)，以及该基因型在显性池的频率，进一步计算每个SNP位点的欧几里得距离(ED值)；过滤掉两池测序深度都低于15个reads以及SNP-index都大于0.7的位点，最后对ED值取幂次方后进行线性回归拟合并作图，以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线，高于阈值线的区段作为候选区间；
(4)利用CTAB法提取不育系YJ15和恢复系XJ07的DNA在HISeq4000测序平台进行重测序，进一步利用XJ07和YJ15的重测序数据进行标记开发和基因定位；
(5)根据BSR和重测序的结果，开发相关分子标记进行精细定位，获得恢复基因的候选基因CaML以及一个与其紧密连锁的SNP位点，针对该SNP，利用NCBI的Primer-BLAST设计引物，将该SNP转化为CAPS标记。
进一步地，上述技术方案中所述的引物包含正向引物CaML-F和反向引物CaML-R，正反向引物分别如下：
正向引物CaML-F：5’-TGGCCTTGCAATCCGTTATG-3’；
反向引物CaML-R：5’-TGCTAGTGTTACGGGTATGCTC-3’。
本发明的第三个目的在于提供上述所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的应用，可用于辣椒育性恢复性的鉴定。
进一步地，上述技术方案中所述的鉴定方法具体包括如下步骤：
(1)提取辣椒单株的DNA并作为模板；
(2)采用分子标记CaML进行PCR扩增，其正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；
(3)对步骤(2)所得PCR扩增产物进行限制性内切酶(BcuI)酶切；
(4)利用1％琼脂糖凝胶对步骤(3)所得酶切产物进行凝胶电泳，出现不同带型；
(5)检测步骤(4)所得带型，如果出现的是单带时，可判定辣椒植株为不含恢复基因的(不育)植株；如果出现双带时，可判定辣椒植株为含有纯合恢复基因的(可育)植株；如果出现三带时，可判定辣椒植株为含有恢复基因的杂合(可育)植株。
进一步地，上述技术方案步骤(2)中所述的PCR扩增反应体系，按总体积为15μl计，包括如下各组分：
ddH2O 10.4μl，10×PCR Buffer 1.5μl，1.2μl dNTPs(2mmol/L)，0.08μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，0.4μl正向引物(10μM)，0.4μl反向引物(10μM)以及1.0μl DNA模板。
进一步地，上述技术方案步骤(2)中所述的PCR扩增反应条件为：95.0℃预变性3min；95.0℃变性30s，55.0℃复性30s，72.0℃延伸40s，35个循环；72.0℃延伸5min，4℃保存。
进一步地，上述技术方案步骤(3)中所述的酶切体系如下：
按总体积为30μl计，包括如下各组分：
17μl ddH2O，10μl PCR产物，2μl Buffer Tango，1μl 10U/μl BcuI。
进一步地，上述技术方案步骤(3)中所述的酶切反应条件为37℃，反应4h。
与现有技术相比，本发明涉及的一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML及其获得方法和应用具有如下有益效果：
(1)本发明分子标记在苗期即可对育种材料是否含有细胞质雄性不育恢复基因及其纯合和杂合状态进行准确高效的鉴定，有效解决了常规育种方法中存在的育种周期长、选择效率低、易受环境影响等问题；
(2)本发明通过分子标记辅助选择，极大降低育种材料的田间种植规模和后期鉴定工作量，从而大幅度节省人力、物力和财力，有效加快了育种进程；
(3)利用本发明的分子标记可以有效区分辣椒材料中是否含有CMS的恢复基因，结合三系育种策略可高效创制辣椒新品种；同时，本发明还为克隆辣椒CMS育性恢复基因进而解析育性恢复的分子机理奠定了重要基础。
附图说明
图1为本发明实施例1利用BSR对细胞质雄性不育恢复基因进行定位，其中：a为全部染色体回归拟合曲线图；b为6号染色体回归拟合曲线图；
图2为本发明实施例2的分子标记CaML用于BL群体单株的育性恢复性鉴定图，其中：(P1：可育亲本，P2：不育亲本，H：ddH2O)。
具体实施方式
下面对本发明的实施案例作详细说明。本实施案例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例，在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则全部操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培唐等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
实施例1：
本实施例的一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML，所述分子标记是由与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SNP位点设计的基因分型引物转化而来。
上述所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML采用如下方法获得，包括如下步骤：
(1)群体构建：
以细胞质雄性不育系材料YJ15(S/rfrf)为母本，恢复系材料XJ02(N/RfRf)和XJ07(N/RfRf)为父本，分别构建F2分离群体BL和HS。
(2)表型鉴定：
F2群体种植在塑料大棚内，外覆防虫网，按照辣椒标准化生产模式管理。通过观察F2植株是否坐果、花药大小以及花粉有无，初步判断植株的育性。进一步采用TTC染色法和花粉离体萌发法鉴定花粉的活力，辅助判断部分含有微量花粉植株的育性。
(3)混池+RNA-Seq(BSR)测序
选取可育植株和不育植株各30株，分别采集即将开放且大小相对一致的花蕾混合作为极端池，使用植物RNA快速提取试剂盒TRIzol提取辣椒RNA并送测序公司在HISeq4000测序平台进行双端150bp测序。
(4)亲本重测序：
采用CTAB法提取亲本材料的DNA进行，利用HISeq400测序平台进行基因组重测序。
(5)分子标记开发
获得混池+RNA-Seq测序数据后，利用FastQC软件对测序数据质量进行评估，使用Trimmomatic去除接头、低质量和含N较多的reads，对测序数据进行质量控制。之后，使用hisat2将各reads比对到辣椒参考基因组(Zunla_V2)，获得的比对文件数据利用samtools软件以及自主开发的Perl脚本提取多态性SNP，并且计算隐性池的最大等位基因型频率(SNP-index)，以及该基因型在显性池的频率，进一步计算每个SNP位点的欧几里得距离(ED值)。过滤掉两池测序深度都低于15个reads以及SNP-index都大于0.7的位点，最后对ED值取幂次方后进行线性回归拟合并作图，以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线，高于阈值线的区段作为候选区间。
再结合重测序数据利用GATK鉴定两池在候选区段度多态性的SNP和InDel，根据自主开发的程序开发InDel和CAPS标记，并进一步分析重组单株，对恢复基因进行精细定位。综合分析定位区域的基因及其变异，候选控制细胞质雄性不育育性恢复性的基因，最终发现一个与候选基因CaML紧密连锁的SNP位点。针对该位点设计引物，所述引物序列为CaML-F：5’-TGGCCTTGCAATCCGTTATG-3’，CaML-R：5’-TGCTAGTGTTACGGGTATGCTC-3’。
实施例2辣椒细胞质雄性不育恢复基因分子标记CaML的验证：
利用实施例1获得的恢复基因分子标记引物，分别对实施例1中的F2群体BL和HS进行鉴定，其步骤如下：
(1)以辣椒基因组DNA为模板，浓度为80～120ng/μl；采用分子标记CaML进行PCR扩增，其正向引物序列为CaML-F：5’-TGGCCTTGCAATCCGTTATG-3’，反向引物序列为CaML-R：5’-TGCTAGTGTTACGGGTATGCTC-3’。PCR反应体系：总体积为15μl，具体成分如下：ddH2O 10.4μl，10×PCR Buffer 1.5μl，1.2μl dNTPs(2mmol/L)，0.08μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，0.4μl正向引物(10μM)，0.4μl反向引物(10μM)以及1.0μl DNA模板。
(2)PCR扩增程序：95.0℃预变性3min；95.0℃变性30s，55.0℃复性30s，72.0℃延伸40s，35个循环；72.0℃延伸5min，4℃保存。
(3)扩增产物经限制性内切酶BcuI酶切，酶切反应体系30μl，具体成分如下：17μlddH2O，10μl PCR产物，2μl Buffer Tango，1μl 10U/μl BcuI。酶切反应条件为37℃，反应4h。
(4)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，若只出现1条带，则判定为不含恢复基因的(不育)植株；若出现2条带或3条带，则判定为含有恢复基因的(可育)植株，其中2条带为纯合植株，3条带为杂合植株。
(5)统计结果如表1、表2所示
应用分子标记CaML进行鉴定时，单带时表示植株为不含恢复基因的不育株，双带时表示植株为含恢复基因的纯合可育株，三条带表示植株为含恢复基因的杂合可育株。
由于我们使用HS群体进行标记开发和基因定位，所以分子标记CaML应用于HS群体39株不育单株时其带型全部符合，符合率为100％，结果如表1所示。
将分子标记CaML应用于BL群体的44株不育单株，得到不育带型41个，可育带型3个，符合率达93.2％，结果如表2所示。
上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，根据条带的多少在苗期即可判断育性恢复基因的状态，可以提高选择效率，减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。同时，该标记通过在2个群体上进行验证，准确率都高于90％，具有一定的通用性，可用于辣椒育性恢复表型的预测、鉴定和筛选。
表1 HS群体CaML标记鉴定结果表
Figure BDA0001705687260000071
Figure BDA0001705687260000081
*1：单带，2：双带，3：三条带
表2 BL群体CaML标记鉴定结果表
Figure BDA0001705687260000082
Figure BDA0001705687260000091
*1：单带，2：双带，3：三条带。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用
<130> 无
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggccttgca atccgttatg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctagtgtt acgggtatgc tc 22

Claims (5)

1.一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的应用，其特征在于：用于辣椒育性恢复性的鉴定，所述的鉴定方法具体包括如下步骤：
（1）提取辣椒单株的DNA并作为模板；
（2）采用分子标记CaML进行PCR扩增，所述的分子标记为正向引物CaML-F和反向引物CaML-R，其正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；
（3）对步骤（2）所得PCR扩增产物进行限制性内切酶BcuI酶切；
（4）利用1%琼脂糖凝胶对步骤（3）所得酶切产物进行凝胶电泳，出现不同带型；
（5）检测步骤（4）所得带型，如果出现的是单带时，可判定辣椒植株为不含恢复基因的不育植株；如果出现双带时，可判定辣椒植株为含有纯合恢复基因的可育株；如果出现三带时，可判定辣椒植株为含有恢复基因的杂合可育株。
2.根据权利要求1所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的PCR扩增反应体系，按总体积为15 μl计，包括如下各组分：
ddH2O 10.4 μl，10×PCR Buffer 1.5 μl，1.2 μl dNTPs，0.08 μl Taq DNA聚合酶，0.4μl正向引物，0.4 μl反向引物以及1.0 μl DNA模板。
3.根据权利要求1所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的PCR扩增反应条件为：95.0 ℃预变性3 min；95.0 ℃变性30 s，55.0 ℃复性30 s，72.0 ℃延伸40 s，35个循环；72.0 ℃延伸5 min，4℃保存。
4.根据权利要求1所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的应用，其特征在于：步骤（3）中所述的酶切体系如下：
按总体积为30 μl计，包括如下各组分：
17 μl ddH2O，10 μl PCR产物，2 μl Buffer Tango，1 μl 10 U/μl BcuI。
5.根据权利要求1所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的应用，其特征在于：步骤（3）中所述的酶切反应条件为37 ℃，反应4 h。
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