KR20110079010A

KR20110079010A - 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 ｃａｐｓ 및 이를 이용한 회복유전자의 유전자형 판별방법

Info

Publication number: KR20110079010A
Application number: KR1020090135958A
Authority: KR
Inventors: 김신제; 윤길영; 송민식
Original assignee: 주식회사 에프앤피
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2011-07-07

Abstract

본 발명은 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS 및 이를 이용한 회복유전자의 유전자형 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 고추 일대잡종 품종 육성 과정에 이용할 수 있는 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자를 판별할 수 있는 DNA 표지 인자, 특히 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 웅성불임 유지 계통 및 회복 계통의 육성 효율을 증진시켜, 고추 품종 육성 효율을 높일 수 있다.

고추, 웅성불임, 회복유전자, 다형성, CAPS

Description

고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 ＣＡＰＳ 및 이를 이용한 회복유전자의 유전자형 판별방법{CAPS OF GENOTYPING RESTORER GENE INVOLVED IN MALE STERILITY OF PEPPER AND METHOD FOR GENOTYPING RESTORER GENE USING SAME}

본 발명은 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 및 이를 이용한 회복유전자의 유전자형 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 고추 일대잡종 품종 육성 과정에 이용할 수 있는 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자를 판별할 수 있는 DNA 표지인자 및 이의 용도에 관한 것이다.

품종육성에서 일대잡종(F1 hybrid)은 근교계(Inbred line)간의 교배로 양친의 어느 것보다도 활력이 강하게 나타나는 것을 잡종강세(Hybrid vigor)라고 한다. 이러한 잡종강세 F1 hybrid 종자를 얻기 위한 방법으로 자연적인 자가수분이 아닌 인공수분을 실시해야 하는데 꽃이 크고 한 개의 과실에 종자가 많이 들어있는 박 과채소 등은 인공수분이 쉽고, 한 개의 과실 내에 종자가 많이 들어 있기 때문에 한 번의 교배로 많은 잡종종자를 얻을 수 있는 장점이 있다.

그러나 양파, 당근 등은 꽃이 작아 인공교배가 어려울 뿐만 아니라 한 번의 교배로 얻어지는 종자 수도 매우 적어 인공교배로 잡종을 생산하는 것은 현실성이 없다. 또한 자가수분과 타가수분이 동시에 가능한 식물인 양전화식물(Hermaphrodite)은 인공교배 전에 모계의 수술을 제거해 주어야한다. 이런 경우에 까다로운 제웅작업을 생략하면서 인공수분의 노력 없이 자연수분을 통해 일대잡종을 얻는 방법이 웅성불임계를 모계로 사용하고, 정상의 가임계를 부계로 사용하는 것이다. 고추에서는 가임화와 불임화가 1:1로 나타나기 때문에 모계의 수술을 제거해 주는 제웅작업의 노력이 줄어든다.

웅성불임성은 유전양식에 따라 크게 핵 유전형(genic male sterility)과 세포질 유전형(cytoplasmic male sterility)으로 나눌 수 있다. 세포질 웅성불임계의 유지는 매우 쉬워 이용하기 편리하나 재배목적이 과실이나 종자를 이용해야 작물일 경우에는 어려움이 따른다. 어느 것을 교배해도 불임주가 나오기 때문에 농가에 보급하게 될 일대잡종(F1 hybrid)도 불임계가 나오게 된다. 따라서 농가에서는 과실이나 종자를 얻기 위해서 화분을 공급할 수 있는 수분주를 따로 심어야 하는데 이는 현실성이 없다. 이를 해결하기 위해서는 세포질 웅성불임성을 회복시켜줄 수 있는 핵 내의 회복유전자(restore gene)를 이용하는 것이다.

세포질핵유전형 웅성불임성(CGMS, cytoplasmic genic male sterility)이 회복인자가 관여하는 것으로 고추, 양파 등에 이용되고 있으며 회복유전자는 단일우 성유전자로 알려져 있다. 이 경우 웅성불임 세포질을 S, 정상의 세포질을 N, 핵 내 회복인자를 Rf라고 표기하면 웅성불임세포질에 회복유전자를 가지지 않은 상태를 Srfrf로 표현할 수 있고 이런 상태에서는 불임이 된다. 웅성불임의 세포질을 가지고 있더라도 불임세포질을 회복시킬 수 있는 핵 내 회복유전자를 가지는 SRfRf, SRfrf 상태는 가임이 되며, 정상의 세포질을 가지는 경우는 핵 내 유전자와 관계없이 항상 가임이 된다.

최근에 고추는 국내에서 채소작물로는 생산량이 가장 높고 경세성이 우수한 작물로 현재 대부분의 일대잡종 종자생산에는 웅성불임과 회복친을 사용하고 있다. 이에 비해 분자수준에서 세포질웅성불임과 이를 회복하는 핵 내 회복인자에 대한 연구는 매우 저조하다.

고추에 있어 일대잡종이 잡종강세를 나타낸다는 것은 일반적으로 알려져 있다. 고추는 낙화가 심하고 1과당 종자수가 적어 인공교배로 1일대잡종을 채종할 경우 교배화당 채종량이 노력에 비해 적다. 따라서 인공교배에 의한 F1 종자의 대량생산이 어렵고 그에 따른 종자 값이 매우 비싸게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 고추에서 발견된 세포질-유전자적 웅성불임성과 유전자 적 웅성불임성의 이용이 필요하게 되어 이러한 고추의 웅성불임성을 이용한 일대잡종 육성이 상업화되어 가고 있다.

따라서, 고추에서 웅성불임을 유지시키는 유전자와, 이와 상호작용하여 임성을 회복시키는 유전자를 규명할 경우, 이는 세포질 웅성불임과 회복유전자의 상호관계, 각각의 분자 수준에서의 기작을 이해하는 데 중요한 결과를 도출해 낼 수 있 게 될 것이다. 또한 대량집단을 사용하는 육종의 선발단계에서 효과적으로 유묘기 상태에서도 간단하고도 정확하게 불임친과 회복친을 구분할 수 있게 하는 분자표지를 개발하는데 기여할 것이다. 이는 국내 뿐 아니라 전 세계 고추 F1 종자생산에 큰 기여를 할 것으로 예상된다

이에 본 발명자들은 고추의 임성회복과 관련된 뉴클레오타이드에 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)가 있으며, 이를 이용함으로써 고추 임성 회복유전자의 유전자형을 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 고추의 웅성불임성 여부를 판단하는데 이용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

서열번호 6 내지 8로 기재된 염기서열 군 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 다형성 단편들로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의, 고추 웅성불임성 회복 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)를 제공한다.

이때, 상기 CAPS가, 서열번호 6과 동일한 경우는 Rf 유전자형으로 판별하고,서열번호 7 또는 서열번호 8과 동일한 경우는 rf 유전자형으로 판별할 수 있다.

특히, 상기 다형성 단편은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 149번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 158번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 185번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 190번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 192번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 219번째 뉴클레오티드에서 T 또는 G의 대립인자, 273번째 뉴클레오티드에서 T 또는 G의 대립인자, 313번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 423번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 458번째 뉴클레오티드에서 G 또는 T의 대립인자, 476번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 528번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 540번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 568번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 600번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 665번째 뉴클레오티드에서 C 또는 G의 대립인자, 719번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 732번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 768번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 793번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 859번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 867번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 959번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 975번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 1007번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1008번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1035번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 1037번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1038번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1053번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1094번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1111번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1113번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 1122번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 1123번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 1128번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1144번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1145번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1158번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 및 1175번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자로 구성된 군에서 선택된 1종이상의 단일염기다형성(SNP)을 포함한다.

그 중에서도, 서열번호 1의 서열 중 273bp, 600bp, 665bp, 1053bp, 1094bp, 1144bp, 1145bp 및 1158bp에 위치한 SNP들로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 SNP를 포함하는 것이 바람직하고, 특히 665bp에 위치한 SNP를 포함하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 서열번호1의 672~677bp 위치에 상응하는 위치의 서열이 결실되어 있는지 및/또는 978~986bp위치에 상응하는 위치의 서열이 결실되어 있는지(InDel 부위) 의 여부로도 유전자형을 판단할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 다형성 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는데, 그 중에서도 바람직하게는 665bp에 위치한 SNP를 증폭하기 위한, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 세트를 제공한다.

따라서, 본 발명은 상기 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 포함하는, 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS 검출용 키트도 제공한다.

본 발명은 또한,

(a)고추에서 추출한 DNA를 주형으로 PCR을 수행하는 단계;

(b)상기 PCR 증폭산물의 염기서열을 분석하는 단계; 및

(c)상기 분석한 염기서열을 고추 웅성불임성 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS와 비교하는 단계를 포함하는, 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별하는 방법을 제공한다.

상기 PCR을 수행하는데 있어서, 바람직하게는 서열번호 11 및 서열번호 18의 프라이머 세트를 이용하고, 고추 웅성불임성 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 바람직한 CAPS는 서열번호 1의 서열 중 665bp에 위치한 SNP를 포함한다.

일례로써, 염기서열 분석으로 유전자형을 판별하는 경우, 상기 (c) 단계에서 PCR 증폭 산물의 염기서열이 서열번호 4와 동일한 경우, 고추 개체의 일배체형은 Rf로 판단할 수 있으며, 서열번호 5 또는 서열번호 6과 동일한 경우에는 rf로 판단할 수 있다. 또 다른 예로써, 상기 (c) 단계에서 PCR 증폭 산물의 염기서열 중, 앞서 설명한 위치에서의 1종 이상의 단일염기다형성(SNP)의 대립인자를 확인하거나, 672~677bp 위치 및/또는 978~986bp 위치의 InDel 부위를 확인함으로써 유전자형을 판단할 수도 있다.

본 발명은 또한, 상기 CAPS 마커 중 어느 하나를 PCR로 증폭시키고, 적합한 제한효소를 이용하여 폴리머라아제 연쇄반응-제한효소단편 길이다형(PCR-RFLP)법으로 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별하는 방법을 제공한다. 특히, 이러한 제한 효소를 이용한 판별 방법은 간편하고 신속한 장점이 있다.

바람직한 예로써,

(a)고추에서 추출한 DNA를 주형으로 서열번호 11 및 서열번호 18의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(b)상기 PCR 증폭산물에 제한효소 Alu I를 접촉시켜 효소반응을 유도하는 단계;

(c)상기 효소반응으로 수득되는 절단 산물의 크기를 분석하는 단계; 및

(d)상기 절단 패턴을 확인하여 유전자형을 판별하는 단계를 포함하는 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 (d) 단계에 있어서, 유전자형 판별은 이하의 기준에 의해 수행된다.

Alu I 절단 산물의 크기가 521bp 및 629bp인 경우 rfrf 유전자형인 것으로 판별하고; Alu I 에 의해 절단되지 않아 크기가 1150bp인 경우 RfRf 유전자형인 것으로 판별하며; Alu I 에 의해 약 50%만 절단되어 521bp, 629bp 및 1150bp 크기의 산물이 혼재되어 있는 경우 Rfrf 유전자형인 것으로 판별한다.

본 발명의 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS 및 이를 이용한 회복유전자의 유전자형 판별 방법을 이용함으로써, 고추의 웅성불임회복에 관한 다양한 인자형을 구분할 수 있어 육종과정에서 DNA 표지인자에 의한 선발을 통한 육종 효율을 높일 수 있다.

특히, 실험실에서 DNA 분석을 통하여 유전자형를 판별할 수 있을 뿐만 아니라 대립유전자가 동형인지 이형인지를 구분할 수 있기 때문에 일반적인 교배를 이용한 판별 방법보다 분석에 소요되는 시간을 2∼3년은 단축시킬 수 있고, 환경의 영향을 받지 않아 판별의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있으며, 또한 교배과정과 후대 임성안정성 확인 과정을 생략할 수 있는 등 실제적인 육종 효율을 높이는데 크게 기여할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

'웅성불임성이란(Male sterility)'이란 자연계에서 일어나는 일종의 돌연변 이로 웅성기관, 즉 수술의 결함으로 인하여 수정능력이 있는 화분을 생산하지 못하는 현상이다. 또한, 잡종강세는 서로 다른 두 양친간의 교배를 통한 후대세대의 수량 증가, 병해충 저항성 증가 등 작물육종에 가장 많이 이용되어 왔다. 이러한 잡종강세 현상을 이용한 일대잡종 종자 생산은 벼, 옥수수, 양파, 고추 등 주요 작물에서 사용되고 있다

'핵 유전형 웅성불임성(genic male sterility, GMS)'은 웅성불임성이 핵 내 유전자에 의해 지배되는 경우로 웅성불임성이 생존에 불리하게 작용하기 때문에 열성유전이 주로 발견되며 열성동형(homozygously recessive)인 경우에 불임성을 나타나게 된다. 웅성불임인자는 Ms로 표시하며 msms는 불임, Msms와 MsMs는 가임의 유전형이다.

'세포질 웅성불임성(cytoplasmic male sterility, CMS)'은 웅성불임성이 세포질에 의해 일어나는 경우로 세포질에 있는 미토콘드리아(mitochondria)에 들어 있는 유전물질에 의한 것으로 추정되고 있으며, 따라서 모계유전(maternal inheritance)을 한다. 세포질 웅성불임은 세포질 유전을 하므로 모계를 따라가 어느 가임계를 교배하더라도 불임주가 나온다.

'유전적 다형성(genetic polymorphism)'은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다. SNP에 의한 염기서열의 변이가 아미노산의 변화를 초래하는 경우를 ‘nonsynonymous SNP’라고 하고, 아미노산의 변화를 일으키지 않는 경우를 ‘silent SNP’ 또는 ‘synonymous SNP’라 한다. 제한효소 단편길이 다형분석법(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)은 제한 효소(restriction endonuclease) 처리에 의한 DNA 단편의 길이 차이를 확인하여 SNP를 구분하는 방법으로, 분석하고자 하는 유전자 부위를 PCR로 증폭한 후, 증폭된 DNA를 제한효소로 절단시켜 단편 상에 존재하는 SNP 부위가 특정 제한효소에 의하여 인식부위가 있는 것을 알아본다. 일반적으로 diallelic polymorphism을 스크리닝하는데 사용된다.

'마커'는 좌위 또는 연관된 좌위를 확인할 때 기준점으로 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 코딩 생성물 (예를 들어, 단백질)을 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는발현된 뉴클레오티드 서열로부터 (예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.

'뉴클레오티드'는 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 핵산을 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체(예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

'유전형' 또는 '유전자형'이란 개체의 형태학적, 생리학적,또는 생화학적 특징인 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다.

'대립 유전자'란 같은 염색체 위치(same chromosomal locus) 를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태(alternative forms) 중 하나를 뜻한다.

'일배체형(haplotype)'은 한쪽 염색체에 있는 연관된 유전자 자리 위에 있는 대립유전자들의 조합을 말하여, 보통 한 단위로 함께 유전된다. '이배체형(dipltype)'은 상기 염색체 한 쌍의 염색체에서 대립 유전자들의 조합을 말한다.

본 발명자들은 고추 개체의 웅성불임성 여부를 DNA 수준에서 쉽고 간편하게 판별할 수 있는 방법을 연구하던 중, 고추의 웅성불임성에 관여하는 뉴클레오티드(GeneBank:E15675.1; 서열번호 1)에 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)가 있으며, 이를 이용함으로써 고추 임성회복 유전자형을 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 고추 개체의 웅성불임성 여부를 판단하는데 이용할 수 있음을 인지하였고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별할 수 있는 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 및 상기 CAPS를 제한효소 처리함으로써 유전자형을 판별하는 방법에 관한 것이다.

특히, 상기 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS를 특이적으로 증폭시킴으로써, PCR 반응으로 증폭시킨 후 이의 염기서열을 확인하거나, 또는 제한효소 절단 반응으로 절단한 후 이의 절단 패턴을 분석함으로써, 고추의 웅성불임 회복유전자의 유전자형을 판별할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 태양은 고추의 웅성불임회복 유전자 판별을 위한 분자유전학적 마커, CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 마커에 관한 것이다.

본 발명은, 고추의 임성회복과 관련된 뉴클레오타이드(GeneBank:E15675.1; 서열번호 1)의 염기서열 중, 특히, 고추 임성회복 관련 집단인 fprf101 및 fprf103 line의 임성을 조사하고 이들 집단의 부, 모와 임성이 확인된 F2의 genomic DNA를 분리하여, 이들의 PCR 산물의 염기서열 차이를 다중정렬분석(multiple alignment)함으로써 착안되어졌다.

즉, 본 발명은 상기 염기서열의 비교 분석을 통해 발견한, 서열번호 6(fprf01-RF), 서열번호 7(fprf01-rf) 및 서열번호 8(fprf03-rf)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 서열번호 1의 뉴클레오타이드의 다형성 단편들로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의, 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)에 관한 것이다. 이때, 상기 CAPS 중, 서열번호 6와 동일한 경우는 Rf 유전자형으로 판별하고, 서열번호 7 또는 서열번호 8과 동일한 경우는 rf 유전자형으로 판별할 수 있다.

상기 서열번호 1의 뉴클레오타이드의 다형성 단편들은, 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 약 40여개의 단일염기다형성(SNP) 단편들 중 1종 이상을 포함할 수 있는데, 바람직하게는, 상기 SNP는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 149번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 158번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대 립인자, 185번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 190번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 192번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 219번째 뉴클레오티드에서 T 또는 G의 대립인자, 273번째 뉴클레오티드에서 T 또는 G의 대립인자, 313번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 423번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 458번째 뉴클레오티드에서 G 또는 T의 대립인자, 476번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 528번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 540번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 568번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 600번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 665번째 뉴클레오티드에서 C 또는 G의 대립인자, 719번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 732번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 768번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 793번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 859번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 867번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 959번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 975번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 1007번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1008번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1035번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 1037번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1038번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1053번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1094번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1111번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1113번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 1122번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 1123번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인 자, 1128번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1144번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1145번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1158번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 및 1175번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자로 구성된 군에서 선택된 1종이상의 SNP를 포함할 수 있다.

그 중에서도 서열번호 1의 서열 중 273bp, 600bp, 665bp, 1053bp, 1094bp, 1144bp, 1145bp 및 1158bp에 위치한 SNP들로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 SNP를 포함하는 것이 바람직하고, 특히, 665bp에 위치한 SNP를 포함하는 것이 가장 바람직하다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 염기서열분석을 통해 고안한 다양한 프라이머 조합을 이용하여 상기 SNP를 포함하는 CAPS에 대하여 PCR을 행하고, PCR 증폭산물의 염기서열을 분석함으로써 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별할 수 있다. 이때, PCR 반응은 통상적인 조성물 및 반응 조건하에서 수행할 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명한 것이다.

염기서열 분석으로 유전자형을 판별하는 경우, 일례로써 PCR 증폭 산물의 염기서열이 서열번호 6와 동일한 경우, 고추 개체의 일배체형은 Rf로 판단할 수 있으며, 서열번호 7 또는 서열번호 8과 동일한 경우에는 rf로 판단할 수 있다.

또 다른 예로써, 상기 (c) 단계에서 PCR 증폭 산물의 염기서열 중, 앞서 설명한 위치에서, 1종 이상의 단일염기다형성(SNP)의 대립인자를 확인함으로써 유전자형을 판별할 수도 있다. 예를 들면, 665번째 뉴클레오티드가 C 대립인자면 Rf 유전자형으로, G 대립인자인 경우는 rf 유전자형으로 판별할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에 있어서, 특정 InDel 부위를 포함하는 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 마커에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 서열번호1의 672~677bp 및/또는 978~986bp 위치에 상응하는 곳에서의 InDel 부위를 확인함으로써, 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별할 수 있다. 즉, 서열번호1의 672~677bp 위치에서의 서열이 결실되어 있는 경우 및/또는 978~986bp 위치에서의 서열이 결실되어 있는 경우 rf/rf 유전자형으로 판단할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다형성 단편들을 포함하는 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 증폭하기 위한 하기 프라이머쌍도 제공한다.

본 발명의 일 구체예는 상기 서열번호 1의 서열 중 665bp에 위치한 SNP를 증폭하기 위한, 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머(FR3-F) 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머(FR5-R) 세트를 이용하였다.

프라이머	염기서열 (5‘ → 3’)	길이 (bp)
FR1-F(서열번호 9)	ATTTTCAGATTGTGGCGACG	20
FR2-F(서열번호 10)	ATCAAACACCTCACATGCACA	21
FR3-F(서열번호 11)	CATCGTGAAGGGGATAGATCA	21
FR5-F(서열번호 12)	TCTGTGACGATTGATCTGACG	21
FR6-F(서열번호 13)	TAGAGGTTGGGGAAAGAGTGG	21
FR1-R(서열번호 14)	CGACCATCACGACGAGG	17
FR2-R(서열번호 15)	GTGTTGAAGGCCTCATTTTCA	21
FR3-R(서열번호 16)	GTTGTGCATGTGAGGTGTTTG	21
FR4-R(서열번호 17)	AATTGGACGAGGGAGTTATGG	21
FR5-R(서열번호 18)	CCAAAGTGGTGGACTGTCAAT	21
FR6-R(서열번호 19)	TATCATCAGATTCTTGACGGA	21

따라서, 본 발명의 또 다른 태양은 상기 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 포함하는, 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS 검출용 키트에 관한 것이다. 바람직하게는 서열번호 11 및 서열번호 18의 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 포함하는, 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS 검출용 키트이다.

상기 키트는 혼성화 버퍼를 더 함유할 수 있고, 특정 표적 구역을 증폭시키기 위해 폴리머라제, 및 폴리머라제에 의해 매개된 프라이머 연장에 최적화된 반응 버퍼를 함유할 수 있다. 즉, 상기 키트는 필요에 따라, 결과를 평가하기 위한 대조군 샘플, DNA 증폭 시약, DNA 폴리머라제, 핵산 증폭 시약, 제한 효소, 완충액, 핵산 샘플링 디바이스, DNA 정제 디바이스, 데옥시뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드(예, 프로브 및 프라이머) 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석중 용이하게 동정할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로서는 방사능 표지, 효소,형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등이 있다.

본 발명은 상기 설명과 유사한 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별하는 방법에 관한 것이다:

(a)고추에서 추출한 DNA를 주형으로 특정 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(b)상기 PCR 증폭산물의 염기서열을 분석하는 단계; 및

(c)상기 분석한 염기서열을, 고추 웅성불임성 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS와 비교하는 단계.

상기 방법에 있어서, 우선, 고추로부터 상기 분석에 사용되기 위한 핵산 샘플을 얻는다. 바람직한 구체예에서, 고추 DNA 샘플은, 예를 들어 서열번호 1의 GeneBank:E15675.1 서열을 사용할 수 있다. 그리고, 상기 수득한 DNA 샘플로부터 필요한 부분을 증폭한다.

핵산 증폭 기술은 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 클로닝, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 특정 대립 유전자의 중합효소 연쇄 반응(ASA), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 네스티드 중합효소 연쇄 반응, 자가 유지 서열 복제(Guatelli, J. C. 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사적 증폭 시스템(Kwoh, D. Y. 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), 및 Q-베타복제효소(Lizardi, P. M. 등, 1988, Bio/Technology 6:1197)를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하였다.

PCR의 방법은 주형으로서 사용하는 게놈 DNA 50ng, dNTP 각 200μM, Taq polymerase (Solgent) 1U를 사용하여, 94℃에서 5분을 1사이클 행한 후, 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 1분을 1사이클로 하여 35사이클 행하고, 최후에 72℃에서 10분을 1사이클 행함으로써 행할 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 특정 프라이머는 상기 표에 기재한 바와 같다. 본 발명의 일 실시예에서는 프라이머 FR3-F와 FR4-R을 이용하여 PCR하였다.

다음으로, 상기 증폭된 DNA 서열의 유전자형을 분석한다. 염기서열 분석으로 유전자형을 판별하는 경우, PCR 증폭 산물의 염기서열이 서열번호 6과 동일한 경우, 고추 개체의 일배체형은 Rf로 판단할 수 있으며, 서열번호 7(fprf01-rf) 및 서열번호 8(fprf03-rf)와 각각 동일한 경우에는 rf로 판단할 수 있다.

그리고, 또 다른 일례로써, 서열번호1의 149, 158, 185, 190, 192, 219, 273, 313, 423, 458, 476, 528, 540, 541, 568, 600, 665, 719, 732, 768, 793, 859, 867, 959, 975, 1007, 1008, 1035, 1037, 1038, 1053, 1094, 1111, 1113, 1122, 1123, 1128, 1144, 1145, 1158 및 1175번째 위치의 염기서열들로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 확인한다. 가장 바람직하게는 665번째 염기서열을 확인한다.

구체적으로, 149번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 158번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 185번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 190번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 192번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 219번째 뉴클레오티드에서 T 또는 G의 대립인자, 273번째 뉴클레오티드에서 T 또는 G의 대립인자, 313번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 423번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 458번째 뉴클레오티드에서 G 또는 T의 대립인자, 476번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 528번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 540번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 568번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 600번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 665번째 뉴클레오티드에서 C 또는 G의 대립인자, 719번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 732번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 768번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 793번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 859번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 867번째 뉴클레오티드에서 T 또는 C의 대립인자, 959번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 975번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 1007번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1008번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1035번째 뉴클레오티드에서 A 또는 C의 대립인자, 1037번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1038번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1053번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1094번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1111번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1113번째 뉴클레오티드에서 A 또는 G의 대립인자, 1122번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 1123번째 뉴클레오티드에서 C 또는 A의 대립인자, 1128번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 1144번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1145번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자, 1158번째 뉴클레오티드에서 G 또는 A의 대립인자, 및 1175번째 뉴클레오티드에서 C 또는 T의 대립인자로 구성된 군에서 선택된 1종이상의 대립인자의 염기서열을 확인해 보고, 각 대립인자 중 먼저 기재된 염기인 경우에는 Rf형으로, 뒤에 기재된 염기인 경우에는 rf형으로 판단한다.

예를 들어, 상기 방법에 따라서 고추의 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 1의 665번째 뉴클레오타이드드와 상응하는 위치의 염기가 G인 것으로 확인되면 고추 개체는 rf형으로, C인 것으로 확인되면 고추 개체는 Rf형으로 결정한다. 특히, 이배체형 마커를 사용하여 rf/rf의 열성 대립 유전자가 확인되면, 즉 열성 대립유전자(minor allele) 동형접합체 (homozygote)가 확인되는 경우에 고추의 불임체로 판단한다.

이때, 다양한 방법들이 개체내의 특정 단일 뉴클레오티드 다형성 대립유전자의 존재를 검출하는데 유용하다. 예를 들어, 다이나믹 대립유전자-특이적 하이브리드화(DASH), 마이크로플레이트 어레이 다이아고날 겔 전기영동(MADGE), 피로시퀀싱, 올리고뉴클레오티드-특이적 결찰, TaqMan 시스템, Affymetrix SNP 칩과 같은 다양한 DNA 칩 기술을 포함하는 여러 기술들이 공지되어 있다. 본 발명의 방법은 모든 이용 가능한 방법들을 포함하는 것으로 이해되어 진다.

또한, 염기서열 분석에 있어서, SNP의 비교뿐만 아니라, InDel 비교도 용이하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에서도 서열번호1의 672~677bp 위치의 서열이 결실되어 있는 경우 및/또는 978~986bp 위치의 서열이 결실되어 있는 경우(InDel 부위)에, 고추 개체를 rf/rf형으로 판단할 수 있다.

한편, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 다형성 단편들로 이루어진 군으로부터 선택되는 CAPS의 PCR 증폭산물을 특정의 제한효소로 처리 후 전기영동에 걸면, 임성체와 불임체 사이에서 다른 서열 또는 다른 크기의 밴드가 관찰되므로 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별할 수 있게 된다. 본 발명은 일 태양으로 상기 방법을 이용하였다.

따라서, 본 발명의 또 다른 방법은, 프라이머를 사용하여 피검정 고추 게놈 으로부터 상기 CAPS 마커중 어느 하나를 PCR로 증폭시키고, 폴리머라아제 연쇄반응-제한효소단편 길이다형(PCR-RFLP)법으로 검출하는 것이다.

PCR-RFLP법은, PCR에 의해 증폭된 DNA단편 서열중의 제한효소 인식부위에 다형이 존재하는 경우에, 그 제한효소에 의한 절단패턴으로부터 어느 형인지를 간편하게 결정하는 방법이다(D.E. Harry등, Theor Appl Genet(1998) 97:327~336). 이러한 제한 효소를 이용한 판별 방법은 간편하고 신속한 장점이 있다.

본 발명에서는 특히, PCR에 의해 증폭된 DNA단편 서열중 서열번호 1의 273bp 위치에 상응하는 위치를 인식하는 Nsi I 효소; 600bp 위치에 상응하는 위치를 인식하는 Mse I 효소, 665bp 위치에 상응하는 위치를 인식하는 Alu I 효소, 1053bp 위치에 상응하는 위치를 인식하는 Taq I효소, 1094bp 위치에 상응하는 위치를 인식하는 Fok I 효소, 1144bp 또는 1145bp 위치에 상응하는 위치를 인식하는 Hinf I 효소, 1158bp 위치에 상응하는 위치를 인식하는 Hind II 효소에 의해 절단하여 그 절단패턴을 살펴 볼 수 있다. 가장 바람직하게는 665bp 위치에 상응하는 위치를 인식하는 Alu I 효소를 이용한다.

따라서, 본 발명의 일구체예로서, 제한효소의 절단 패턴으로 유전자형을 판별하는 경우에는, 하기에 따라 판단할 수 있다.

(a)고추에서 추출한 DNA를 주형으로 제7항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(d)상기 절단 패턴을 확인하여 유전자형을 판별하는 단계.

(i) Alu I 절단 산물의 크기가 521bp 및 629bp인 경우 rfrf 유전자형인 것으로 판별하고; (ii) Alu I 에 의해 절단되지 않아 크기가 1150bp인 경우 RfRf 유전자형인 것으로 판별하며;(iii) Alu I 에 의해 약 50%만 절단되어 521bp, 629bp 및 1150bp 크기의 산물이 혼재되어 있는 경우 Rfrf 유전자형인 것으로 판별한다.

상기 방법을 좀 더 구체적으로 살피면, 피검정 고추 게놈중의 Rf/rf 유전자를 검출하는데에는, 상기 본 발명의 표1에 기재되어 있는 프라이머를 사용하여, 피검정 고추 게놈으로부터 추출한 DNA를 PCR로 증폭시키고, 얻어진 PCR산물을, 제한효소 단편 길이 다형에 관해서 조사하기 위해서, 목적하는 SNP에 존재하는 제한부위에 대응하는 제한효소로 절단한다.

이 절단은, 사용하는 제한효소의 권장반응온도에서 수시간~하룻밤 인큐베이션하는 것에 의해 행한다. 제한효소로 절단한 각각의 증폭 PCR샘플은, 예컨대 약 0.7% 내지 2% 아가로스겔 또는 약 3%의 MetaPhor TM 아가로스겔로 전기영동하는 것에 의해 분석할 수 있다. 예컨대, 겔을 에티듐브로마이드중 자외선하에서 가시화할 수 있다.

가장 바람직한 예로써, 서열번호 11 및 서열번호 18의 서열을 갖는 DNA를 프라이머로서 사용하여 게노믹 PCR을 행하고, 얻어진 산물 중의 제한효소 Alu I 인식 부위의 유무에 근거하여 서열번호 1의 665bp 위치에 상응하는 위치에서 절단한다.

그리고, 가시화된 겔상에, 다음과 같은 밴드가 존재하는지를 확인한다.

ㆍ피검정 고추게놈이 rf유전자를 호모에 갖는 경우: 629 및 521

ㆍ피검정 고추게놈이 rf유전자를 헤테로에 갖는 경우: 1150 , 629 및 521

ㆍ피검정 고추게놈이 rf유전자를 갖지 않는 경우: 1150

본 발명의 방법은, PCR-RFLP법을 사용하여, 검출하고자 하는 마커의 DNA를 PCR에 의해 증폭시키기 때문에, 서던블로트 분석을 행하지 않고, 단시간에 간편하게 검출할 수 있다. 서던블로트분석을 행하는 RFLP법과 비교하여, PCR-RFLP법에 있어서 사용되는 DNA의 양은 수나노그램 정도로 매우 소량이어도 좋다는 이점도 있 다.

또한, 사용하는 DNA의 정제도는, 그 정도로 높지 않더라도 좋고, DNA의 조추출액을 그대로 사용하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서는, 검출하는 PCR마커의 존재를 보다 확실하게 조사하기 위해서, PCR-RFLP법과 서열결정을 조합시켜 사용하여도 좋다.

또한, 본 발명에서는 판별한 유전자형과 웅성불임성 여부를 직접 연결지어서 판단할 수 있다. 우선, 세포질의 영향이 우선하기 때문에 세포질 타입이 정상이면 모두 임성체(F)로 볼 수 있다. 또한, 본 발명에서 판별한 유전자형이 Rf인경우에도 100% 임성체(F)로 판단할 수 있다

이처럼, 본 발명은 일차적으로 고추 웅성불임성 회복인자를 효과적으로 검출 하는데 사용될 수 있고, 웅성불임성 여부를 판단하는데 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명은 당업계에 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 고추의 웅성불임회복에 관한 다양한 인자형을 구분할 수 있어 육종과정에서 DNA 표지인자에 의한 선발을 통한 육종 효율을 조절할 수 있다. 이는 연관된 특정 유전자의 발현에 의해 야기되는 상태를 조절하기 위한 메커니즘에 관한 것으로서, 특정 대립유전자에 의해 야기되는 우성 효과를 활용할 수 있다.

즉, 본 발명은 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS 마커와 관련되는, 상기 언급한 용도를 모두 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

< 실시예 1>

고추의 임성회복 유전자의 PCR 산물 서열분석 및 유전자형 확인

고추의 임성회복과 관련된 뉴클레오타이드(GeneBank:E15675.1; 서열번호 1)을 확보하고 이들 염기서열을 in-silico 분석하였다. 그 중에서 임성회복 관련 집단인 fprf101, fprf103 line의 임성을 조사하고 이들 집단의 부, 모와 임성이 확인된 F2의 genomic DNA를 분리하였다. fprf101의 부, 모를 각각 서열번호 2 및 3으로, fprf103의 부, 모를 각각 서열번호 4 및 5로 표시하였다. 그리고, 프라이머 FR3-F(서열번호 11)와 FR4-R(서열번호 17)을 이용하여 PCR하였다(표1의 염기서열과, 표4의 10번 조합 참조).

이 PCR 산물의 염기서열을 결정하고 임성체와 불임체에 따른 염기서열의 차이를 다중정렬분석(multiple alignment)을 수행하여 분석한 결과를 도 1에 도시하였다.

그 중에서 fprf01-Rf의 서열을 서열번호 6으로 명명하고, 열성 대립유전자인 fprf01-rf의 서열을 서열번호 7로, fprf03-rf의 서열을 서열번호 8로 명명하였다.

염기서열 분석 결과, 임성체와 불임체간의 염기서열에 차이가 나타났는데, 열성 대립유전자(rf)가 우성 대립유전자(Rf)에 비해, 41개의 단염기다형성 (SNP, single nucleotide polymorphism)를 가지고 있었다(표 3). 그리고 2곳의 InDel 부위가 확인되었다(표 2).

672~677	6 bp
978~986	9 bp

SNP
bp	Rf type	rf type	제한효소
149	G	A
158	G	A
185	C	T
190	T	C
192	T	C
219	T	G
273	T	G	Nsi I
313	G	A
423	C	T
458	G	T
476	C	T
528	G	A
540	G	A
541	C	A
568	A	C
600	T	C	Mse I
665	C	G	Alu I
719	C	T
732	C	T
768	A	C
793	C	A
859	C	A
867	T	C
959	A	G
975	A	G
1007	G	A
1008	C	T
1035	A	C
1037	G	A
1038	C	T
1053	C	T	Taq I
1094	G	A	Fok I
1111	C	T
1113	A	G
1122	C	A
1123	C	A
1128	G	A
1144	C	T	Hinf I
1145	C	T	Hinf I
1158	G	A	Hind II
1175	C	T
1189	G	A

< 실시예 2>

고추 웅성불임성 회복유전자의 유전자형 판별 마커 및 그의 이용

상기 SNP를 인식할 수 있는 제한효소를 이용해서 Rf locus의 유전자형을 판별할 수 있는 CAPS(Cleaved amplified polymorphisms) 마커를 개발하고자 하였다.

특히, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열 중, 상기 단염기다형성(SNP)이 제한효소와 작용하는 부위가 일치하는 곳 중에서, 특히, 서열번호 1의 서열상 665bp에 상응하는 위치의 SNP에 Alu I enzyme을 처리하였을 때 임성체와 불임체간의 절단 형태가 달라져 명확히 구분되었다.

따라서 상기 서열번호 1의 서열상 665bp에 상응하는 위치에 위치한 SNP를 쉽게 진단하기 위해서, 표1에 기재한 여러 프라이머 조합을 사용하여 실험하였다. 이 중에서 FR3-F(서열번호 11)와 FR5-R(서열번호 18)을 사용하였을 때 웅성불임의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하는데 용이하였다.

CAPS 분자표지를 이용하여 Rf 유전자 형을 판별하기 위하여, 하기 표4의 조합 중에서 16번 조합의 프라이머(FR3-F, FR5-R)를 이용하여 PCR하고 확보된 산물을 Alu I restriciton enzyme으로 37 ℃에서 3시간 처리한 후 1% 아가로스겔에서 전기영동하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

조합	Forward	Reverse	Product size
1	FR1-F	FR1-R	877
2	FR2-F	FR2-R	523
3	FR3-F	FR3-R	327
4	FR3-F	FR2-R	825
5	FR3-F	FR1-R	1018
6	FR1-F	FR3-R	182
7	FR1-F	FR2-R	682
8	FR2-F	FR3-R	23
9	FR2-F	FR1-R	716
10	FR3-F	FR4-R	1301
11	FR1-F	FR4-R	1158
12	FR5-F	FR5-R	237
13	FR6-F	FR6-R	244
14	FR5-F	FR6-R	137
15	FR6-F	FR5-R	310
16	FR3 -F	FR5 -R	1150
17	FR1-F	FR5-R	1007
18	FR2-F	FR5-R	848
19	FR3-F	FR6-R	1058
20	FR1-F	FR6-R	905
21	FR2-F	FR6-R	746
22	FR5-F	FR4-R	388
23	FR6-F	FR1-R	178
24	FR6-F	FR4-R	461

도 3을 통하여 알 수 있는 바와 같이, CAPS 분자표지를 이용하여 동형접합체와 이형접합체 인자형을 구분할 수 있었다. 분석결과, 가임(Fertile F)과 불임(Sterile S)을 구분할 수 있으며, 이형접합(Heterozygous)도 구분할 수 있었다.

rfrf 유전형일 경우 Alu I으로 처리하였을 때 1150bp의 PCR product가 절단되어 521bp, 629bp로 나누어지며 도 3에서는 합쳐져서 두꺼운 band로 나타났다. 그리고, Rfrf 유전형인 경우 1150bp의 PCR product가 약 50%만 절단되어 1150bp , 629bp 및 521bp 크기의 산물이 모두 존재함으로써 이형접합의 2개의 밴드로 나타났으며, RfRf 유전형인 경우 1150bp의 PCR product가 절단되지 않아 1150bp의 산물만 존재하였다.

즉, 상기 결과에서 알 수 있는 것처럼, 두 가지 다른 고추 웅성불임 회복유전자(Rf/Rf, rf/rf)형을 판단하기 위하여, 본 발명의 CAPS 분자표지를 이용하여 판별함으로써 웅성불임 회복유전자형을 확인할 수 있다. 본 발명의 방법은 시간적 공간적 비용을 획기적으로 절약할 수 있어 고추 육종에 매우 유익한 방법이 될 것이다.

도 1a 및 1b는 고추 임성회복집단의 부, 모와 임성이 확인된 F2의 염기서열 차이를 다중정렬분석(multiple alignment)한 것이다.

도 2는 염기서열분석을 통해 고안한 프라이머 위치를 나타낸 지도이다.

도 3은 중합효소반응(PCR) 증폭 산물을 Alu I 제한효소로 자른 후 전기영동한 사진이다.

<110> FNP. Inc <120> CAPS OF GENOTYPING RESTORER GENE INVOLVED IN MALE STERILITY OF PEPPER AND METHOD FOR GENOTYPING RESTORER GENE USING SAME <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1339 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 agaattggac gacaggcccg ggtaatcttt gaatttcatc gtgaagggga tagatcattt 60 caattgttgg tattcaacga ggaattccta gtaagcgcaa gtcatcagct cacgttgact 120 acgtccctgc cctttgtaca caccactcgt cgctcctgcc gattgaatga tccagtgaaa 180 ttttcagatt gtggcgacgt gagcggttca ctgcccgtta tgttgtaaga agtccattga 240 accttatcat ttcttcaaca aacactagac attcataggt tcacacttat ttggggattt 300 cctactagca tggaataatt cattcacttg gtcattttat caaacacctc acatgcacaa 360 cttaggaata agtataataa cccaactaat catcatgaac aaccaaattt acatgtttcc 420 acccatatat tatcatacat tcatacaaac cacataagta tcccatcttg gaggtcattc 480 aacatcaaca acaagtacat aatccattta ccacacaatt accacatgct aaggccaagg 540 cttgataatc ttgtagacaa acatgaaaca caactcaatc atagcaagaa cattaacttt 600 aactcacaag aatcattaaa aattcataaa aataaatctt ggagatctag aaaaaggtac 660 ttgaccttct tggaagaaag ggacccaaga ataaacatct acataccttg ggaaaactct 720 tttctggaag tctctaggaa gaattcttgg tccttgctct tgattctatc ttaatttttg 780 gtggaagaag agccaatttt ttaatttagg aaaccctagt tttggctgaa agaagtgaaa 840 tgaaaatgag gccttcaaca cttaagtggg tatttataga ggttggggaa agagtggaaa 900 atacctaaat tccctttaaa gagaaagagt tgaaaactat tgatcggggt ctgtgacgat 960 tgatctgacg gtccatcaga gggactgatg gtccaccaga tcgtccgcca ctcgagtgac 1020 aagttcgggt cattatgcct cgtcgtgatg gtcgaagtga aggtccgtca agaatctgat 1080 gatacaccag atcgtccatc tctaagggtt caagaatgga cccttctgtt tcgacctgat 1140 ggaccccttg acggtccgtc aacttattga cagtccacca ctttggccgt cacatgatga 1200 aaagaaaaag gagtcacttc cttggcttga tgggaaactt gatggcccac caaggctgac 1260 ggtctaccag gtcgaccatc aagcctgggc aattccaata ccatttagta aaacggccat 1320 aactccctcg tccaattct 1339 <210> 2 <211> 1250 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 2 gnnannnntg nntcacgagg attcctagta tgcgcagaga catcagctca cggttgacta 60 cgtccctgcc ctttgtacac accactcgtc gctcctgccg attgattgat ccagtgaaat 120 tttcagattg tggcgacgtg agcggttcac tgcccgttat gttgtaagaa gtccattgaa 180 ccttatcatt tcttcaacaa acactagaca ttcataggtt cacacttatt tggggatttc 240 ctactagcat ggaataattc attcacttgg tcattttatc aaacacctca catgcacaac 300 ttaggaataa gtataataac ccaactaatc atcatgaaca accaaattta catgtttcca 360 cccatatatt atcatacatt catacaaacc acataagtat cccatcttgg aggtcattca 420 acatcaacaa caagtacata atccatttac cacacaatta ccacatgcta aggccaaggc 480 ttgataatct tgtagacaaa catgaaacac aactcaatca tagcaagaac attaacttta 540 actcacaaga atcattaaaa attcataaaa ataaatcttg gagatctaga aaaaggtact 600 tgaccttctt ggaagaaagg gacccaagaa taaacatcta cataccttgg gaaaactctt 660 ttctggaagt ctctaggaag aattcttggt ccttgctctt gattctatct taatttttgg 720 tggaagaaga gccaattttt taatttagga aaccctagtt ttgggtgaaa gaagtgaaat 780 gaaaatgagg ccttcaacac ttaagtgggt atttatagag gttggggaaa gagtggaaaa 840 tacctaaatt ccctttaaag aaaaagagtt gaaaactatt gatcggggtc tgtgacgatt 900 gatctgacgg tccatcagag ggactgatgg tccaccagat cgtccgccac tcgagtgaca 960 aattcgggtc attatgcctc gtcgtgatgg tcgaagtgaa ggtccgtcaa gaatctgatg 1020 atacaccaga tcgtccatct ctaagggttc aagaatggac ccttctgttt cgacctgatg 1080 gaccccttga cggtccgtca acttattgac agtccaccac tttggccgtc acatgatgaa 1140 aagaaaaacg agtcacttcc taggcatcat gggaaacttg atgctcacca aagacctgac 1200 ggtatcccaa gtcgtccgct cagcctgggc angncanncc ntngtnnnng 1250 <210> 3 <211> 1234 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 3 gcnattnntg gnntcacgag tattcctagt aagcgcaagt catcagctcg cgttgactac 60 gtccctgccc tttgtacaca ccactcatcg ctcctaccga ttgattgatc cagtgaaatt 120 tttagatcgc ggcgacgtga gcggttcact gcctgtgatg ttgtaagaag tccattgaac 180 cttatcattt cttcaacaaa cactagacat gcataggttc acacttattt ggggatttcc 240 tactagcatg aaataattca ttcacttggt cattttatca aacacctcac atgcacaact 300 taggaataag tataataacc caactaatca tcatgaacaa ccaaatttac atgtttccac 360 tcatatatta tcatacattc atacaaacca cataattatc ccatcttgga ggttattcaa 420 catcaacaac aagtacataa tccatttacc acacaattac cacatactaa ggccaagaat 480 tgataatctt gtagacaaac atgaaccaca actcaatcat agcaagaaca ttaacttcaa 540 ctcacaagaa tcattaaaaa ttcataaaaa taaatcttgg agatctagaa aaaggtactt 600 gagcttctta agggacccaa gaataaacat ctacatacct tgggaaaact tttttctgga 660 agtttctagg aagaattctt ggtccttgct cttgattctc tcttaatttt tggtggaaga 720 agagacaatt ttttaattta ggaaacccta gtttttgggt gaaagaagtg aaatgaaaat 780 gaggccttca aaacttaagc gggtatttat agaggttggg gaaagagtgg aaaataccta 840 aattcccttt aaagaaaaag agttgaaaac tattgatcgg ggtctgtgac ggttgatctg 900 acggtccgtc gatggtccac cagatcgtcc atcactcgag tggaaaatct gggtcattct 960 atctcgtcgt gatggttgaa gtgaaggtcc gtcaagaatc tgatgataca ccagatcatc 1020 catctctaag ggtttaggaa tggacaattc tatttcgacc tgatggattc cttgacggtc 1080 catcaactta ttgacagttc accactttgg ccatcacatg atgaacataa aaaggggtca 1140 cttccttggc ttgatgggaa acttgatggc cccccaagga cctggcggtc taccaggtcg 1200 accatcaaac ctggcaatcc naaccatntn cnnc 1234 <210> 4 <211> 1234 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 4 gcnattnntg gnntcacgag tattcctagt aagcgcaagt catcagctcg cgttgactac 60 gtccctgccc tttgtacaca ccactcatcg ctcctaccga ttgattgatc cagtgaaatt 120 tttagatcgc ggcgacgtga gcggttcact gcctgtgatg ttgtaagaag tccattgaac 180 cttatcattt cttcaacaaa cactagacat gcataggttc acacttattt ggggatttcc 240 tactagcatg aaataattca ttcacttggt cattttatca aacacctcac atgcacaact 300 taggaataag tataataacc caactaatca tcatgaacaa ccaaatttac atgtttccac 360 tcatatatta tcatacattc atacaaacca cataattatc ccatcttgga ggttattcaa 420 catcaacaac aagtacataa tccatttacc acacaattac cacatactaa ggccaagaat 480 tgataatctt gtagacaaac atgaaccaca actcaatcat agcaagaaca ttaacttcaa 540 ctcacaagaa tcattaaaaa ttcataaaaa taaatcttgg agatctagaa aaaggtactt 600 gagcttctta agggacccaa gaataaacat ctacatacct tgggaaaact tttttctgga 660 agtttctagg aagaattctt ggtccttgct cttgattctc tcttaatttt tggtggaaga 720 agagacaatt ttttaattta ggaaacccta gtttttgggt gaaagaagtg aaatgaaaat 780 gaggccttca aaacttaagc gggtatttat agaggttggg gaaagagtgg aaaataccta 840 aattcccttt aaagaaaaag agttgaaaac tattgatcgg ggtctgtgac ggttgatctg 900 acggtccgtc gatggtccac cagatcgtcc atcactcgag tggaaaatct gggtcattct 960 atctcgtcgt gatggttgaa gtgaaggtcc gtcaagaatc tgatgataca ccagatcatc 1020 catctctaag ggtttaggaa tggacaattc tatttcgacc tgatggattc cttgacggtc 1080 catcaactta ttgacagttc accactttgg ccatcacatg atgaacataa aaaggggtca 1140 cttccttggc ttgatgggaa acttgatggc cccccaagga cctggcggtc taccaggtcg 1200 accatcaaac ctggcaatcc naaccatntn cnnc 1234 <210> 5 <211> 1255 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 5 cngggngang ccatcacgag taattcctag taagcgcagt gtcatcagct cacgattgac 60 tacgtccctg ccctttgtac acaccactcg tcgctcctgc cgattgatag atccagtgaa 120 attttcagat tgtggcgacg tgagcggttc actgcccgtt atgttgtaag aagtccattg 180 aaccttatca tttcttcaac aaacactaga cattcatagg ttcacactta tttggggatt 240 tcctactagc atggaataat tcattcactt ggtcatttta tcaaacacct cacatgcaca 300 acttaggaat aagtataata acccaactaa tcatcatgaa caaccaaatt tacatgtttc 360 cacccatata ttatcataca ttcatacaaa ccacataagt atcccatctt ggaggtcatt 420 caacatcaac aacaagtaca taatccattt accacacaat taccacatgc taaggccaag 480 gcttgataat cttgtagaca aacatgaaac acaactcaat catagcaaga acattaactt 540 taactcacaa gaatcattaa aaattcataa aaataaatct tggagatcta gaaaaaggta 600 cttgaccttc ttggaagaaa gggacccaag aataaacatc tacatacctt gggaaaactc 660 ttttctggaa gtctctagga agaattcttg gtccttgctc ttgattctat cttaattttt 720 ggtggaagaa gagccaattt tttaatttag gaaaccctag ttttgggtga aagaagtgaa 780 atgaaaatga ggccttcaac acttaagtgg gtatttatag aggttgggga aagagtggaa 840 aatacctaaa ttccctttaa agaaaaagag ttgaaaacta ttgatcgggg tctgtgacga 900 ttgatctgac ggtccatcag agggactgat ggtccaccag atcgtccgcc actcgagtga 960 caaattcggg tcattatgcc tcgtcgtgat ggtcgaagtg aaggtccgtc aagaatctga 1020 tgatacacca gatcgtccat ctttaagggt tcaagaatgg acccttctgt ttcgacctga 1080 tggacccctt gacggtccgt caacttattg acagtccacc actttggccg tcacatgatg 1140 aaaagaaaaa ggagtcactt ccttggcttg atgggaaact tgatggccca ccaaggacct 1200 gacggtctac caggtcgacc atcaagcctg gctaatccaa ctccntaatt cgnnc 1255 <210> 6 <211> 1238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fprf01-RF <400> 6 ccggnnngtt ggnctcacga gtattcctag tagcgcaagt catcagctcg cgttgactac 60 gtccctgccc tttgtacaca ccactcatcg ctcctaccga ttgattgatc cagtgaaatt 120 tttagatcgc ggcgacgtga gcggttcact gcctgtgatg ttgtaagaag tccattgaac 180 cttatcattt cttcaacaaa cactagacat gcataggttc acacttattt ggggatttcc 240 tactagcatg aaataattca ttcacttggt cattttatca aacacctcac atgcacaact 300 taggaataag tataataacc caactaatca tcatgaacaa ccaaatttac atgtttccac 360 tcatatatta tcatacattc atacaaacca cataattatc ccatcttgga ggttattcaa 420 catcaacaac aagtacataa tccatttacc acacaattac cacatactaa ggccaagaat 480 tgataatctt gtagacaaac atgaaccaca actcaatcat agcaagaaca ttaacttcaa 540 ctcacaagaa tcattaaaaa ttcataaaaa taaatcttgg agatctagaa aaaggtactt 600 gagcttctta agggacccaa gaataaacat ctacatacct tgggaaaact tttttctgga 660 agtttctagg aagaattctt ggtccttgct cttgattctc tcttaatttt tggtggaaga 720 agagacaatt ttttaattta ggaaacccta gtttttgggt gaaagaagtg aaatgaaaat 780 gaggccttca aaacttaagc gggtatttat agaggttggg gaaagagtgg aaaataccta 840 aattcccttt aaagaaaaag agttgaaaac tattgatcgg ggtctgtgac ggttgatctg 900 acggtccgtc gatggtccac cagatcgtcc atcactcgag tggaaaatct gggtcattct 960 atctcgtcgt gatggttgaa gtgaaggtcc gtcaagaatc tgatgataca ccagatcatc 1020 catctctaag ggtttaggaa tggacaattc tatttcgacc tgatggattc cttgacggtc 1080 catcaactta ttgacagttc accactttgg ccatcacatg atgaacataa aaaggggtcc 1140 cttccttggc ttgatgggaa acttgatggc ccaccaagga cctgacggtc taccaggtcg 1200 accatcaaac ctgggcaata ccantaccat agnnnngg 1238 <210> 7 <211> 1241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fprf01-rf <400> 7 gngangntgg ntctcacgag tattcctagt angcgcaagt catcagctcg cgttgactac 60 gagccctgcc ctttgtacac accactcatc gctcctaccg attgatatga tccagtgaaa 120 ttattagatc gcggcgacgt gagcggttca ctgcctgtga tgttgtaaga agtccattga 180 accttatcat ttcttcaaca aacactagac atgcataggt tcacacttat ttggggattt 240 cctactagca tgaaataatt cattcacttg gtcattttat caaacacctc acatgcacaa 300 cttaggaata agtataataa cccaactaat catcatgaac aaccaaattt acatgtttcc 360 actcatatat tatcatacat tcatacaaac cacataatta tcccatcttg gaggttattc 420 aacatcaaca acaagtacat aatccattta ccacacaatt accacatact aaggccaaga 480 attgataatc ttgtagacaa acatgaacca caactcaatc atagcaagaa cattaacttc 540 aactcacaag aatcattaaa aattcataaa aataaatctt ggagatctag aaaaaggtac 600 ttgagcttct taagggaccc aagaataaac atctacatac cttgggaaaa cttttttctg 660 gaagtttcta ggaagaattc ttggtccttg ctcttgattc tctcttaatt tttggtggaa 720 gaagagacaa ttttttaatt taggaaaccc tagtttttgg gtgaaagaag tgaaatgaaa 780 atgaggcctt caaaacttaa gcgggtattt atagaggttg gggaaagagt ggaaaatacc 840 taaattccct ttaaagaaaa agagttgaaa actattgatc ggggtctgtg acggttgatc 900 tgacggtccg tcgatggtcc accagatcgt ccatcactcg agtggaaaat ctgggtcatt 960 ctatctcgtc gtgatggttg aagtgaaggt ccgtcaagaa tctgatgata caccagatca 1020 tccatctcta agggtttagg aatggacaat tctatttcga cctgatggat tccttgacgg 1080 tccatcaact tattgacagt tcaccacttt ggccatcaca tgatgaacat aaaaacgggt 1140 cccttccttg gcttgatggg aaacttgatg gcccaccaag gacctggcgg tataacaggt 1200 cgtccatctc atcctgggca atncatacca ttantnnngg g 1241 <210> 8 <211> 1241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fprf03-rf <400> 8 anngnngtnn ggtcttcacg agtattccta gtagcgcaag tcatcagctc gcgttgacta 60 cgtccctgcc ctttgtacac accactcatc gctcctaccg attgattgat ccagtgaaat 120 tattagatcg cggcgacgtg agcggttcac tgcctgtgat gttgtaagaa gtccattgaa 180 ccttatcatt tcttcaacaa acactagaca tgcataggtt cacacttatt tggggatttc 240 ctactagcat gaaataattc attcacttgg tcattttatc aaacacctca catgcacaac 300 ttaggaataa gtataataac ccaactaatc atcatgaaca accaaattta catgtttcca 360 ctcatatatt atcatacatt catacaaacc acataattat cccatcttgg aggttattca 420 acatcaacaa caagtacata atccatttac cacacaatta ccacatacta aggccaagaa 480 ttgataatct tgtagacaaa catgaaccac aactcaatca tagcaagaac attaacttca 540 actcacaaga atcattaaaa attcataaaa ataaatcttg gagatctaga aaaaggtact 600 tgagcttctt aagggaccca agaataaaca tctacatacc ttgggaaaac ttttttctgg 660 aagtttctag gaagaattct tggtccttgc tcttgattct ctcttaattt ttggtggaag 720 aagagacaat tttttaattt aggaaaccct agtttttggg tgaaagaagt gaaatgaaaa 780 tgaggccttc aaaacttaag cgggtattta tagaggttgg ggaaagagtg gaaaatacct 840 aaattccctt taaagaaaaa gagttgaaaa ctattgatcg gggtctgtga cggttgatct 900 gacggtccgt cgatggtcca ccagatcgtc catcactcga gtggaaaatc tgggtcattc 960 tatctcgtcg tgatggttga agtgaaggtc cgtcaagaat ctgatgatac accagatcat 1020 ccatctctaa gggtttagga atggacaatt ctatttcgac ctgatggatt ccttgacggt 1080 ccatcaactt attgacagtt caccactttg gccatcacat gatgaacata aaaaggggtc 1140 acttccttgg cttgatggga aacttgatgg cccaccaagg acctgacggt ctaccaggtc 1200 gaccatcaaa cctgggcaat tccnnnaccn ttagtcngng g 1241 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 9 attttcagat tgtggcgacg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 10 atcaaacacc tcacatgcac a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 11 catcgtgaag gggatagatc a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 12 tctgtgacga ttgatctgac g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 13 tagaggttgg ggaaagagtg g 21 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 14 cgaccatcac gacgagg 17 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 15 gtgttgaagg cctcattttc a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 16 gttgtgcatg tgaggtgttt g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 17 aattggacga gggagttatg g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 18 ccaaagtggt ggactgtcaa t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 19 tatcatcaga ttcttgacgg a 21

Claims

서열번호 6 내지 8 중 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 다형성 단편들로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의, 고추 웅성불임성 회복 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence).
제1항에 있어서,

상기 서열번호 6은 Rf 유전자형으로 판별하고, 상기 서열번호 7 또는 서열번호 8은 rf 유전자형으로 판별하는 것을 특징으로 하는 CAPS.
제1항에 있어서,

상기 다형성 단편은 서열번호 1의 273bp, 600bp, 665bp, 1053bp, 1094bp, 1144bp, 1145bp 및 1158bp 위치에 존재하는 SNP들로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 SNP를 포함하는 것을 특징으로 하는 CAPS.
제3항에 있어서,

상기 다형성 단편은 서열번호 1의 665bp 위치에 존재하는 SNP를 포함하는 것을 특징으로 하는 CAPS.
제4항에 있어서,

서열번호 11의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는, 제4항의 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 672~677bp 또는 978~986bp 위치에 존재하는 InDel 부위를 확인하는 것을 특징으로 하는, 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별하는 방법.
제6항에 있어서,

상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 672~677bp 또는 978~986bp 위치에 존재하는 염기서열이 결실되어 있는 경우에 rfrf 유전자형인 것으로 판별하는 것을 특징으로 하는 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별하는 방법.
다음 단계를 포함하는 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별하는 방법:

(a)고추에서 추출한 DNA를 주형으로 PCR을 수행하는 단계;

(b)상기 PCR 증폭산물의 염기서열을 분석하는 단계; 및

(c)상기 분석한 염기서열을 제1항의 고추 웅성불임성 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS와 비교하는 단계.
제8항에 있어서,

상기 (c) 단계는 분석한 염기서열이 서열번호 6과 같은 경우에는 Rf 유전자형으로 판별하고, 서열번호 7 또는 서열번호 8과 같은 경우에는 rf 유전자형으로 판별하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 고추 웅성불임 회복 유전자형을 판별하는 방법:

(a)고추에서 추출한 DNA를 주형으로 제5항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(b)상기 PCR 증폭산물에 제한효소 Alu I를 접촉시켜 효소반응을 유도하는 단계;

(c)상기 효소반응으로 수득되는 절단 산물의 크기를 분석하는 단계; 및

(d)상기 절단 패턴을 확인하여 유전자형을 판별하는 단계.
제10항에 있어서,

상기 (d) 단계는 Alu I 절단 산물의 크기가 521bp 및 629bp인 경우 rfrf 유전자형인 것으로 판별하고; Alu I 에 의해 절단되지 않아 산물 크기가 1150bp인 경우 RfRf 유전자형인 것으로 판별하며; Alu I 에 의해 50%만 절단되어 521bp, 629bp 및 1150bp 크기의 산물이 혼재되어 있는 경우 Rfrf 유전자형으로 판별하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항의 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 포함하는, 제4항의 고추 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS 검출용 키트.
서열번호 6 내지 8 중 어느 하나의 염기서열에서 선택되는 일련의 염기서열로 이루어지고, 서열번호 6 내지 8로 이루어진 군 중에서 선택되는 유전자를 증폭시킬 수 있는 고추 웅성불임성 회복 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 프라이머.
제5항의 프라이머 또는 제13항의 프라이머를 이용하여 식물체의 게놈 DNA를 연속적으로 증폭시켜 증폭된 DNA를 획득 및 분석하는 단계를 포함하는 고추 웅성불임성 회복 유전자의 유전자형을 결정하는 방법.