CN110468225B

CN110468225B - 辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关的snp标记及其特异性引物和应用

Info

Publication number: CN110468225B
Application number: CN201910724935.7A
Authority: CN
Inventors: 张正海; 王立浩; 曹亚从; 于海龙; 张宝玺; 朱砚姝
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-07
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-08-07
Also published as: CN110468225A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记及其特异性引物和应用。本发明的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1所示序列的第25位碱基为T或C，或者所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其中，SEQ ID No.2所示序列的第25位碱基为T或G。本发明不需通过辣椒测交和花粉鉴定，只是在苗期对辣椒植株的DNA检测，就可以判断辣椒材料为保持系还是恢复系，可以广泛应用于分子标记辅助育种。

Description

辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关的SNP标记及其特异性引物和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记及其特异性引物和应用。

背景技术

近年来，我国辣椒产业发展迅速，年种植面积基本稳定在150万～160万hm²，约占我国蔬菜种植面积的10％。2004～2015年，通过国家鉴定的辣椒品种77个，2004～2013年通过省级鉴定的辣椒品种583个，均居各蔬菜作物首位。90％以上的辣椒品种为杂交一代，主要采用人工去雄授粉杂交，制种成本较高，往往存在纯度风险。

利用辣椒核雄性不育系配制杂交种可以省去人工去雄环节，节约人力，提高收益。但必须在花期拔除约占母本一半的可育株，造成田地等浪费，影响单产。而选用辣椒细胞质雄性不育系做母本，不必考虑母本育性分离问题，可简化程序、节省约50％以上人工成本，保证杂交种的纯度。

辣椒以果实为产品，通常情况下良好的授粉、受精是辣椒果实发育的前提条件，若受精不良，则不能坐果，或者果实不能膨大至正常水平，严重影响辣椒品质和产量。因此，稳定的恢复系的选育就成为辣椒细胞质雄性不育三系育种的关键。恢复系转育过程中需要表型选择、回交和测交评价，转育出目标性状优良的稳定恢复系也比较费时、费力。

现有技术利用不同的恢复系材料，开发了大量与辣椒细胞质雄性不育恢复性相关的分子标记，但这些分子标记都存在标记和表型不一致以及低适用性等问题，从而限制了辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关分子标记在育种中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记。

本发明的再一目的在于提供上述SNP标记的KASP特异性引物。

本发明的再一目的在于提供上述SNP标记的应用。

本发明的再一目的在于提供筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法。

本发明的再一目的在于提供用于筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的检测试剂盒。

根据保发明具体实施方式的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记，所述SNP标记S1431的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的第25位碱基用Y表示，Y为T或C，或者，

所述SNP标记S1436的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其中，SEQ ID No.2所示序列的第25位碱基用K表示，K为T或G。

SEQ ID No.1：

AGGGCATCAATAACAATGGCATAGYTATATATATTGGGCTTAGTGTTTCCCTGTTCCATTAGCCGAAGCA AACTTATAGT CTTTTGAGTATGACCCCT

SEQ ID No.2：

TTGCATAGTCCATCAATCACCATGKTGAAGATGTACACATCTGGATAAATATTAAGATTCACCATCTCAGAGAAGAAAGTCC

根据本发明具体实施方式的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记的KASP特异性引物，所述引物序列如下：

S1431的特异性引物如下：

前引物A1:5′-GGGCATCAATAACAATGGTATAGT-3′，

前引物A2:5′-AGGGCATCAATAACAATGGTATAGC-3′，

后引物:5′-AGGGGTCATACTCAAAAGACTATAAGT-3′；或者

S1436的特异性引物如下：

前引物A1:5′-TTGCATAGTCCATCAATCACCATGT-3′，

前引物A2:5′-TTGCATAGTCCATCAATCACCATGT-3′，

后引物:5′-GGACTTTCTTCTCTGAGATGGTGAA-3′。

根据本发明具体实施方式的KASP特异性引物，所述前引物A1和A2的5’端加有荧光标签序列。

根据本发明具体实施方式的KASP特异性引物，所述前引物A1的5’端加有FAM荧光标签序列，所述前引物A2的5’端加有HEX荧光标签序列。

根据本发明具体实施方式的KASP特异性引物，所述FAM荧光标签序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，HEX荧光标签序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。

本发明还提供辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记的应用，尤其是在辣椒分子标记辅助育种中、辣椒细胞质雄性不育恢复系筛选以及辣椒杂交种的纯度辅助鉴定中的应用。

根据本发明具体实施方式的筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法，所述方法包括应用上述SNP标记筛选辣椒恢复基因的步骤。

根据本发明具体实施方式的鉴定筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法，当所述辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记位点处的碱基为T:T基因型时，则待测辣椒材料为“恢复系”；

当所述辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关SNP标记位点处的碱基为C:C或G:G基因型时，则待测辣椒材料为“保持系”。

本发明还提供一种筛选辣椒雄性细胞质不育恢复系的检测试剂盒，所述试剂盒中含有上述KASP特异性引物。

所述试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。荧光探针A的核苷酸序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列为上述序列的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团。

荧光探针B的核苷酸序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列为上述序列的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团。

在本发明中，所述荧光基团A具体为FAM荧光标签序列；所述荧光基团B具体为HEX荧光标签序列；所述淬灭基团具体为Q。

本发明的有益效果：

本发明不需通过辣椒测交和花粉鉴定，只在苗期对辣椒植株的DNA进行检测，就可以判断辣椒材料为保持系还是恢复系，可以广泛应用于分子标记辅助育种。本发明的标记可用KASP基因分型技术进行大批量检测，可以提高效率，缩短鉴定时间。

本发明提供的分子标记实现了在苗期筛选辣椒恢复基因，大大缩短了育种时间，节约了人力物力。利用本发明的特异性引物并采用KASP基因分型技术，以已公布全基因组序列恢复系辣椒CM334和Zunla_1为对照，与恢复系辣椒CM334和Zunla_1同基因型的及杂合基因型的为恢复系，与恢复系辣椒CM334和Zunla_1不同基因型的为保持系。通过该分子标记可进行辣椒恢复系的筛选和杂交种纯度的鉴定，提高了育种效率。本发明的SNP标记S1431和S1436位于辣椒CA02g19240基因区间，属于候选基因分子标记。

附图说明

图1为KASP标记S1431在杂交组合中的扩增结果；，其中，蓝色点为与恢复系(CM334、IVF2014032、H3、0601M)分子标记基因型(T:T基因型)，绿色点为77013A、77013、perennial和77013A×perennial分子标记基因型(C:C基因型)，红色点为F₁代(77013A×CM334、77013A×IVF2014032、77013A×H3、77013A×0601M、)分子标记基因型(C:T基因型)；

图2为KASP标记S1436在杂交组合中的扩增结果；其中，蓝色点为恢复系(CM334、IVF2014032、H3、0601M)分子标记基因型(T:T基因型)，绿色点为77013A、77013、perennial和77013A×perennial分子标记基因型(G:G基因型)，红色点为F₁代(77013A×CM334、77013A×IVF2014032、77013A×H3、77013A×0601M、)分子标记基因型(G:T基因型)；

图3为KASP标记S1431在21个辣椒材料中的扩增结果，其中，蓝色点为恢复系纯合单株(C:C基因型)，绿色点为保持系单株(T:T基因型)；

图4为KASP标记S1436在21个辣椒材料中的扩增结果，其中，蓝色点为恢复系纯合单株(G:G基因型)，绿色点为保持系单株(T:T基因型)。

具体实施方式

本发明涉及的辣椒材料如下：77013A、77013、83-163、IVF2000080、0601M、IVF2014032、75-7-3-1、TOM4、7714、茂丰0818、9870MN、耐湿椒、猪大肠、南京早椒、Numex R-Naky、H3、CM334、RP4、perennial、IVF2014043、9825M、RP38。

实施例1与辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关的SNP位点的获得及对应KASP引物的确定

1.试验材料

以辣椒CM334、perennial、IVF2014032、H3、0601M及其与77013A的杂交F1代试验材料。

2.表型鉴定

对上述各辣椒材料恢复性的表型鉴定采用测交法，在材料生长季节，通过肉眼观察F1代10个单株不同部位花朵的花药是否有花粉散出判断育性。对于肉眼难于判断的植株，进一步利用醋酸洋红染色法观察花粉的有无。另外在生长季结束后，再次根据植株上果实的有无，以及果实内种子的有无判断可育和不育表型。

结果表明，5个杂交组合后代各单株均有大量花粉散出，各单株正常坐果，果实发育正常，5个父本材料为细胞质雄性不育育性恢复材料。

3.辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关的SNP位点及对应KASP引物的确定

(1)基因组重测序和分子标记设计

对77013和IVF2014043基因组进行重测序，以Zunla_1为参考基因组，预测样本中的SNP位点，并设计相应的KASP引物。

每对KASP分子标记含有3条引物序列：A1、A2、C。

其中，A1、A2仅仅是末端的SNP位点存在差异，在A1、A2的5’端分别加有不同荧光标签序列：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(FAM荧光标签序列)；

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(HEX荧光标签序列)。

C为反向互补序列。

KASP标记的PCR扩增体系包括DNA模板、引物混合物、荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。引物混合物包括引物A1、A2和C。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团Q；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团Q。

表1 KASP标记S1431和S1436核苷酸序列信息

(2)多态性SNP标记的筛选

利用5个不同的杂交组合进行多态性筛选。

KASP PCR扩增反应后读数需使用Roche 480荧光定量仪，进行KASP Genotying，读取荧光数据。X轴为FAM(465-510)通道，Y轴为HEX(533-580)通道。根据分析结果按照如下确定待测基因的具体基因型：聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示绿色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示红色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，左下角显示黑色的样本为以H₂O替代模板的空白对照。

KASP引物组合S1431和S1436表型及基因型鉴定结果如表2和图1、2所示。

表2分子标记S1431和S1436在辣椒双亲及F1代分型情况

结果表明，分子标记表明，S1431和S1436标记分型一致，可用作辣椒恢复系的筛选。恢复系perennial表型与分子标记基因型不一致，这是因为辣椒中存在多个恢复基因，perennial可能不含有标记S1431和S1436所在的恢复基因。

S1430标记仅对77013A和CM334及其杂交F₁代能准确分型，不能区分其他恢复系亲本及其F₁，S1430标记的代表性较低，不能用作辣椒自然群体恢复系的的分子标记分型和辅助选择。

SNP位点的多态性为SEQ ID NO.1所示序列的25位为C或T；或者

SNP位点的多态性为SEQ ID NO.2所示序列的25位为G或T。

当所述辣椒为“保持系”，时，该SNP位点均为C:C或G:G基因型，即辣椒基因组中SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列核苷酸序列的第25位为C或G的纯合型；

当所述辣椒为“恢复系”，时，该SNP位点均为T:T基因型,即辣椒基因组中SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示序列的第25位为T的杂合型。

实施例2利用标记S1431和S1436从自然群体中筛选辣椒细胞质雄性不育恢复材料

选用44份辣椒材料，使用KASP标记进行PCR扩增。实验结果见表3、图3、4所示。

表3分子标记S1431和S1436辣椒自然群体中的分型情况

结果表明，除辣椒材料perennial外，当供试辣椒为“恢复系”时，分子标记S1431和S1436对应的SNP位点均为T:T基因型；当供试辣椒为“保持系”时，分子标记S1431和S1436对应的SNP位点分别为C:C和G:G基因型。因此，可利用本发明标记S1431和S1436从自然群体中筛选辣椒细胞质雄性不育恢复材料。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关的SNP标记及其特异性引物和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (25)..(25)

<223> Y = T OR C

<400> 1

agggcatcaa taacaatggc atagytatat atattgggct tagtgtttcc ctgttccatt 60

agccgaagca aacttatagt cttttgagta tgacccct 98

<210> 2

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (25)..(25)

<223> K = T OR G

<400> 2

ttgcatagtc catcaatcac catgktgaag atgtacacat ctggataaat attaagattc 60

accatctcag agaagaaagt cc 82

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggcatcaat aacaatggta tagt 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agggcatcaa taacaatggt atagc 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggggtcata ctcaaaagac tataagt 27

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgcatagtc catcaatcac catgt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgcatagtc catcaatcac catgt 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggactttctt ctctgagatg gtgaa 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims

1.一种辅助筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

使用引物对检测SNP标记S1431和SNP标记S1436，以筛选辣椒雄性不育恢复基因，所述SNP标记S1431和所述SNP标记S1436为与辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关的SNP标记，

其中，

所述SNP标记S1431在SEQ ID No.1所示序列的第25位碱基为T或C，所述第25位碱基为所述SNP标记S1431的SNP位点；

所述SNP标记S1436在SEQ ID No.2所示序列的第25位碱基为T或G，所述第25位碱基为所述SNP标记S1436的SNP位点；

当待测辣椒在SNP标记S1431和SNP标记S1436的SNP位点处的碱基均为T:T基因型时，则待测辣椒材料为“恢复系”。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用KASP特异性引物组对待筛选辣椒材料进行荧光PCR扩增，所述KASP特异性组由引物对1和引物对2组成，其中，所述引物对1的序列如下：

前引物A1: 5′-GGGCATCAATAACAATGGTATAGT-3′，

前引物A2: 5′-AGGGCATCAATAACAATGGTATAGC-3′，

后引物: 5′- AGGGGTCATACTCAAAAGACTATAAGT -3′；

所述引物对2的序列如下：

前引物A1: 5′-TTGCATAGTCCATCAATCACCATGT-3′，

前引物A2: 5′-TTGCATAGTCCATCAATCACCATGT-3′，

后引物: 5′- GGACTTTCTTCTCTGAGATGGTGAA -3′，

所述前引物A1的5’端加有FAM荧光标签序列，所述前引物A2的5’端加有HEX荧光标签序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述FAM荧光标签序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，所述HEX荧光标签序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。