CN111961753B - 一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的snp标记及其特异性引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记及其特异性引物和应用，所述辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP标记为SEQ ID NO.1所示序列的第21位碱基。本发明还提供了鉴定该SNP标记的特异性引物以及相应试剂盒，并提供了采用所述特异性引物或试剂盒对抗番茄斑点萎蔫病毒病的辣椒的鉴定方法。采用本发明的SNP分子标记可不通过辣椒TSWV病抗性人工接种鉴定，只需在苗期对辣椒植株进行的DNA检测，就可以对辣椒TSWV病抗性基因进行快速而准确地判断，并且可对样品进行大批量检测，提高育种效率，缩短鉴定时间。

Description

一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记及其 特异性引物和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记及其特异性引物和应用。

背景技术

番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)典型成员，是辣椒生产中的新兴的重大威胁病害，寄主适应性非常强，传播效率高，近些年在辣椒上有逐渐扩大和流行的趋势。TSWV可以引起植株坏死、黄萎以及叶片、茎部、果实出现斑点等症状，严重时会导致辣椒绝产。目前，TSWV已在我国14个地区的蔬菜产区中发现，且已成为造成我国部分地区辣椒绝产的主要病毒。

抗病品种的培育是防治病毒病最为经济和有效的途径。这主要依赖于抗性资源的挖掘和利用。在辣椒中，TSWV抗性基因Tsw已被成功克隆，该基因为显性单基因。分子标记辅助育种基于基因型筛选种质资源，可避免或降低表型选择的误差，从而大大缩短育种进程，分子标记的开发可以大大提高育种效率。

目前普遍采用的分子标记辅助育种技术为CAPS标记，其是酶切扩增多态性序列标记技术，主要是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分析。因此，CAPS类型标记往往需要结合PCR扩增、限制性内切酶消化和凝胶电泳过程，不但对DNA质量要求较高、经常由于反应条件不稳定造成精确度降低，且不能实现高通量、大样品的检测。

面对上述问题，KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR，竞争性等位基因特异性PCR)分型技术，能够对基因组中SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，具有灵敏度高、高通量、低成本、快速等优点，但是目前还没有发现基于KASP分型技术的专门针对辣椒TSWV抗性基因Tsw的SNP分子标记。

因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记及其特异性引物、采用该引物的试剂盒以及应用，所述SNP标记具有灵敏度高、高通量、特异性强的优点，采用所述的特异性引物对辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性的鉴定效率高、速度快，可实现高通量、多样品的同时处理。

本发明的方案具体如下：

第一方面，本发明提供一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP标记位点即为SEQ ID NO.1所示序列的第21位，该第21位碱基为A或G。该SNP标记被命名为KASP标记Pep(Tsw)-k497。

SEQ ID NO.1

AATCGCGAAAAACCTAATCTRGAAAAAACTAAAACCGT CAACTTG

其中，R代表A或G。

第二方面，本发明提供一组上述辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的特异性引物，其包括两条前引物和一条后引物，引物序列如下：

前引物A1:5′-AATCGCGAAAAACCTAATCTA-3′(SEQ ID NO.2)

前引物A2:5′-AATCGCGAAAAACCCAATCTG-3′(SEQ ID NO.3)

后引物C:5′-CAAGTTGACRGGTTTTAGTTTTTTC-3′(SEQ ID NO.4)

其中，所述前引物A1和A2的5’端分别加有不同的荧光标签序列。所述不同的荧光标签序列是指可结合不同颜色的荧光基团的标签序列。

优选地，前引物A1的5’端加有FAM荧光标签序列，前引物A2的5’端加有HEX荧光标签序列：

所述FAM荧光标签序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；

所述HEX荧光标签序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

第三方面，本发明还提供一种鉴定抗番茄斑点萎蔫病毒病的辣椒的检测试剂盒，所述试剂盒中上述的KASP特异性引物。

优选地，所述检测试剂盒还包括荧光探针A和序列反向互补的淬灭探针A，以及荧光探针B和与其序列反向互补的淬灭探针B；

其中，荧光探针A与前引物A1上的荧光标签序列相同，且该荧光探针A的5’末端连接相应的荧光基团A，淬灭探针A的3’末端连接有淬灭基团；

荧光探针B与前引物A2上的荧光标签序列相同，且荧光探针B的5’末端连接相应的另一荧光基团B，淬灭探针B的3’末端连接有淬灭基团。

荧光基团A和荧光基团B发不同荧光。可选地，所述荧光基团A具体为FAM荧光基团；所述荧光基团B具体为HEX荧光基团；所述淬灭基团具体为Q。

其他实施例中，荧光基因A和B不限于上述荧光基团，还可采用市面上其他不同种类的荧光基团。

第四方面，本发明还提供一种上述辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记在辣椒分子标记辅助育种中的应用。

第五方面，本发明还提供一种上述辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的特异性引物、上述检测试剂盒在鉴定抗番茄斑点萎蔫病毒病的辣椒中的应用。

第六方面，本发明还提供一种对抗番茄斑点萎蔫病毒病的辣椒的鉴定方法，该鉴定方法为：根据上述辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记所在核苷酸序列，以该序列的第21位碱基作为鉴定位点，设计一组包括两条前引物和一条后引物的特异性引物，并基于KASP基因分型方法利用这组特异性引物对待测辣椒材料进行番茄斑点萎蔫病毒病抗性的鉴定。优选地，所述特异性引物为前述的前引物A1、前引物A2和后引物C。其他实施例中，采用的特异性引物不限于这三条引物。

优选地，所述鉴定方法为：以待测辣椒的基因组DNA作为模板，采用特异性引物、以及相匹配的荧光探针和淬灭探针进行PCR扩增，并将得到的扩增产物进行荧光信号扫描，并对扫描数据进行分析后，并根据分析结果按照以下方法判定待测辣椒的表型：

若待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现前引物A1的荧光标签序列对应的荧光基团所显颜色(如HEX基团的红光)，则所述待测辣椒不含有抗病基因Tsw(SNP位点为G:G基因型)，辣椒的TSWV病抗病性表型为“感病”；

若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现前引物A2的荧光标记序列对应的荧光基团所显颜色(如FAM基团的蓝色)，则所述待测辣椒含有抗病基因Tsw(SNP位点为A:A基因型)，辣椒的TSWV病抗病性表型为“抗病”；

若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现前引物A1和A2的荧光标记序列对应的荧光基团颜色的混合色(如绿色)，则所述待测辣椒含有抗病基因Tsw(SNP位点为G:A基因型)，辣椒的TSWV病抗病性表型为“抗病”。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的基因分型准确率高，提供的引物特异性高，实现了对辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因的准确检测。依据本发明的SNP分子标记可不通过辣椒TSWV病抗性人工接种鉴定，只在苗期对辣椒植株的DNA检测，就可以对辣椒TSWV病抗性基因进行判断，可广泛应用到分子标记辅助育种。此外，与传统的CAPS标记相比，本发明的SNP分子标记及检测方法操作简单，对样品质量和反应条件要求不严苛，具有检测灵敏度高、准确率高、高通量的优点，可对样品进行大批量检测，提高辣椒抗番茄斑点萎蔫病毒病株的育种效率，缩短鉴定时间。

附图说明

图1为辣椒TSWV抗病基因紧密连锁标记SCAC568在抗病材料和感病材料扩增序列比对示意图；其中，CK-positive和202011C35为抗病材料，含有抗病基因Tsw，CK-negative和202011C29为感病材料，不含抗病基因Tsw；序列在497bp处(方框标出)存在A-G突变；

图2为KASP标记Pep(Tsw)-k497在抗病材料、感病材料和F₁杂交组合中的SNP分型结果；蓝色点代表辣椒TSWV抗病材料(A:A基因型)，红色点为辣椒TSWV感病材料(G:G基因型)，绿色点代表F₁杂交组合材料，为辣椒TSWV抗病材料和基因型杂合(A:G基因型)杂合型单株，黑色点表示空白对照(NTC)；

图3为利用高通量KASP分子标记Pep(Tsw)-k497在部分回交后代中的NP分型结果；其中，蓝色点为辣椒TSWV抗病材料(A:A基因型)，红色点为辣椒TSWV感病材料(G:G基因型)，绿色点为辣椒TSWV抗病材料，基因型杂合(A:G基因型)杂合型单株，黑色点表示空白对照(NTC)。NTC表示空白对照(黑色)，粉色点表示由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例一辣椒TSWV抗病基因Tsw相关SNP位点的获得及高通量KASP标记的开发

1.试验材料

感病材料：0516(CK-negative)、茄门(202011C29)；

抗病材料：PI152225(CK-positive)、0516tsw(202011C35)。

2.基因组DNA提取

取辣椒幼嫩叶片采用CTAB法提取基因组DNA。DNA提取方法参见Murray MG,Thompson WF(1980)Rapid isolation of high molecular weight plant DNA，NucleicAcids Res 8:4321-4325。

3、辣椒TSWV抗病基因Tsw相关SNP位点的获得

Moury等(Moury B,Pflieger S,Blattes A,Lefebvre V,Palloix A.2000.A CAPSmarker to assist selection of Tomato spotted wilt virus(TSWV)resistance inpepper.Genome 43,137–142.)开发了1对与Tsw抗性基因紧密连锁的SCAR/CAPS标记SCAC₅₆₈，但该文章中仅采用传统的CAPS标记方法，且涉及的Tsw抗性基因紧密连锁SCAR序列并未被公开。

以步骤2提取的基因组DNA为模板，采用Moury等(Moury B,Pflieger S,BlattesA,Lefebvre V,Palloix A.2000.A CAPS marker to assist selection of Tomatospotted wilt virus(TSWV)resistance in pepper.Genome 43,137–142.)报道与TSWV抗病基因紧密连锁的PCR-SCAR标记(SCAC₅₆₈)按照下列反应体系和反应程序进行PCR扩增。

PCR反应体积为20μL，反应体系为：2×Taq Master Mix 10μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，模板DNA(50ng/μL)2μL，ddH₂O 6μL。

PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

扩增产物委托华大基因科技服务有限公司进行双向测序，经DNAMAN软件比对分析发现扩增序列存在23个SNP位点，其中，与第497bp处存在的A-G碱基突变位点，具体见图1。最终选定该第497bp的SNP位点(即Pep(Tsw)-k497)为对象进行检测位点，用于鉴定辣椒的番茄斑点萎蔫病毒病抗性标记位点。

4、根据上述SNP位点设计高通量KASP分子标记采用的特异性引物，特异性引物序列分别如下：

前引物A1:5′-AATCGCGAAAAACCTAATCTA-3′，(SEQ ID NO.2)

前引物A2:5′-AATCGCGAAAAACCCAATCTG-3′，(SEQ ID NO.3)

后引物C:5′-CAAGTTGACRGGTTTTAGTTTTTTC-3′。(SEQ ID NO.4)

针对该SNP位点，将前引物A1、前引物A2的5’端分别添加如下的FAM和HEX荧光标签序列：

FAM荧光标签序列：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；(SEQ ID NO.7)

HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。(SEQ ID NO.8)

由此得到相应的辣椒TSWV抗病基因Tsw相关的KASP高通量分子标记Pep(Tsw)-k497的专用引物序列，并根据该专用引物序列安排上海生工公司北京合成部进行合成：

引物1：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATCGCGAAAAACCTAATCTA-3′(其中下划线部分为FAM荧光标签序列)；(SEQ ID NO.5)

引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATCGCGAAAAACCCAATCTG(其中下划线部分为HEX荧光标签序列)(SEQ ID NO.6)

引物3：5′-CAAGTTGACRGGTTTTAGTTTTTTC-3′。(与后引物C相同)

实施例二利用高通量KASP标记Pep(Tsw)-k497检测辣椒TSWV抗性基因Tsw的方法

1、PCR扩增

取待测辣椒幼嫩叶片作为样品，采用CTAB法对样品进行基因组DNA的提取，利用上述引物1、引物2和引物3对感病材料0516、茄门及抗病材料PI152225、0516tsw及其2个F₁代样品进行PCR扩增，反应体系在96孔板中进行。

扩增采用的KASP基因分型的PCR反应体系(10μl体系)：

表1反应体系

成分	用量
		KASP V4.0 2×Master Mix	5μl
KASP 72×assay mix	0.14μl
		基因组DNA	10ng
ddH<sub>2</sub>O	加至体系总量为10ul

其中，KASP V4.0 2×Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等组成。本实施例采用的KASP V4.02×Master Mix为LGC公司产品，产品目录号为KBS-1016-002。

具体地，荧光探针A的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端连接1个荧光基团FAM；淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。荧光探针B的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。

KASP 72×assay mix由浓度为100μM的引物1、引物2、引物3与ddH2O按12∶12∶30∶46的体积比混合得到。

上述扩增体系采用梯度PCR反应程序，反应程序为：

95℃变性15min；

94℃变性20s，61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个循环；

94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。

其中，PCR水浴热循环采用Hydrocycler 16-32高通量热循环系统，适用于96和384孔板。

对各样品进行实验的同时，设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照，每个PCR板设置2个空白对照。

2、PCR扩增产物的荧光扫描

采用双向单激发读板仪PHERAstar对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm，HEX激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。每个PCR扩增产物样本设置3个重复。

3、等位基因分型

采用KrakenTM软件对双向单激发读板仪PHER Astar扫描数据进行分析(公众可以直接从LGC公司购买分析软件)，根据分析结果按照如下方法判定待测辣椒TSWV抗性基因Tsw的基因型：

聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示粉色的样本可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型，左下角显示黑色的样本为空白对照。

具体而言，如图2所示：①若待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测辣椒不含有抗病基因Tsw(SNP分型为G:G基因型)，辣椒的TSWV病抗病性表型为“感病”；②若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测辣椒含有抗病基因Tsw(SNP分型为A:A基因型)，辣椒的TSWV病抗病性表型为“抗病”；③若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测辣椒含有抗病基因Tsw(SNP分型为G:A基因型)，辣椒的TSWV病抗病性表型为“抗病”。

实施例三高通量KASP标记在辣椒TSWV抗病基因Tsw回交转育中的应用

1、供试材料：

6个辣椒杂交群体，包括3个BC₃F₂群体(回交3代，自交2代)，3个BC₄群体，每个群体包含14～16个单株(详见表2)。群体构建是以3个辣椒自交系(分别为螺丝椒M，猪大肠、0818)为轮回亲本与TSWV抗病材料0516Tsw杂交后，利用轮回亲本回交3～4代，再自交0～2代获得。

参照实施例二中的方法，利用高通量KASP标记对群体内单株进行辣椒Tswv抗性基因Tsw的基因型进行鉴定(结果见表2和图3)。

表2供试材料Tsw抗性基因的基因型检测结果

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<120> 一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记及其特异性引物和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记序列

<400> 1

aatcgcgaaa aacctaatct rgaaaaaact aaaaccgtca acttg 45

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 2

aatcgcgaaa aacctaatct a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 3

aatcgcgaaa aacccaatct g 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 4

caagttgacr ggttttagtt ttttc 25

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc taatcgcgaa aaacctaatc ta 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat taatcgcgaa aaacccaatc tg 42

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> FAM荧光标签序列

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> HEX荧光标签序列

<400> 8

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims (5)

1.一组检测辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的KASP引物组，其特征在于，所述引物组由序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的前引物A1、前引物A2和一条序列如SEQ ID NO.4所示的后引物组成；所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SNP标记在SEQ ID NO.1所示序列的第21位的碱基为A或G；所述前引物A1和前引物A2的5’端分别加有不同的荧光标签序列。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述前引物A1的5’端加有FAM荧光标签序列，所述前引物A2的5’端加有HEX荧光标签序列；所述FAM荧光标签序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，所述HEX荧光标签序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

3.一种鉴定抗番茄斑点萎蔫病毒病的辣椒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1-2中任一项所述的引物组。

4.如权利要求1-2中任一项所述的引物组或如权利要求3所述的检测试剂盒在鉴定抗番茄斑点萎蔫病毒病的辣椒中的应用，其特征在于，所述应用包括使用所述引物组或所述试剂盒检测辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的基因型，所述SNP标记在SEQ ID NO.1所示序列的第21位的碱基为A或G；

若待测辣椒的番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记对应的SNP位点为G:G纯合基因型时，待测辣椒材料的番茄斑点萎蔫病毒病抗病性表型为感病；若待测辣椒的番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记对应的SNP位点为A:A纯合基因型或A:G杂合基因型时，则待测辣椒材料的番茄斑点萎蔫病毒病抗病性表型为抗病。

5.一种对抗番茄斑点萎蔫病毒病的辣椒的鉴定方法，其特征在于，该鉴定方法为：使用权利要求1所述的引物组对待测辣椒材料进行番茄斑点萎蔫病毒病抗性的鉴定；

鉴定步骤具体包括：

以待测辣椒的基因组DNA作为模板，使用所述引物组检测辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的基因型，所述SNP标记在SEQ ID NO.1所示序列的第21位的碱基为A或G，采用所述引物组进行PCR扩增，并将得到的扩增产物进行荧光信号扫描，并对扫描数据进行分析后，并根据分析结果按照以下方法判定待测辣椒的表型：

若待测辣椒的番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记对应的SNP位点为G:G纯合基因型时，待测辣椒材料的番茄斑点萎蔫病毒病抗病性表型为感病；

若待测辣椒的番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记对应的SNP位点为A:A纯合基因型或A:G杂合基因型时，则待测辣椒材料的番茄斑点萎蔫病毒病抗病性表型为抗病。

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