MX2014010474A - Plantas de capsicum resistentes a tswv. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo del cultivo del pimiento. Se proporcionan plantas que son resistentes al patotipo capaz de superar la resistencia mediada por Tsw del TSWV. También se proporcionan partes de plantas, semillas, células y frutos de las mismas, y procedimientos para producir dichas plantas.

Description

PLANTAS DE CAPSICUM RESISTENTES A TSWV CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al cultivo de plantas y a la mejora de plantas, en particular de plantas de la especie Capsicum annuum L, que son resistentes contra la cepa Ve427RB capaz de superar la resistencia mediada por Tsw.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plantas Capsicum annuum L. son plantas herbáceas de la familia Solanaceae. La planta alcanza una altura de aproximadamente 0,5 - 1 ,5 metros (20 - 60 pulgadas). Flores blancas únicas portan el fruto del pimiento, que es verde cuando no está maduro y que cambia principalmente a rojo, aunque algunas variedades pueden ser marrones o moradas al madurar. Aunque las especies pueden tolerar la mayoría de los climas, son especialmente productivos en climas templados y secos. Las plantas de pimiento cultivadas de la especie Capsicum annuum incluyen diferentes tipos de pimientos, tales como pimientos morrones, pimientos de cayena, pimentón y jalapeños.

Los tospovirus son una importante amenaza patológica para muchas especies de plantas y causan considerables daños y pérdidas en todo el mundo (Germán et al. 1992, Ann Rev Phytopath V30: 315-348). Por tanto, los agricultores están continuamente buscando genes que confieren o potencian resistencia a los tospovirus con el fin de desarrollar variedades cultivadas resistentes. El gen Sw-5 se transfirió de Lycopersicon peruvianum a tomates cultivados, de modo que se confirió resistencia al serogrupo I de los tospovirus (p. ej., TSWV, virus del bronceado del tomate) y del serogrupo II (p. ej., GRSV y TCSV, el virus de la mancha anular del cacahuete y el virus de la mancha clorótica del tomate, respectivamente).

Hoy en día, las variedades cultivadas comerciales de los pimientos dulces y picantes con frecuencia contienen el gen dominante de resistencia Tsw, que confiere resistencia hipersensible al TSWV (pero no a otros tospovirus, tales como GRSV o TCSV). Se ha producido la introgresión del gen Tsw de la especie Capsicum chínense, PI152225, PI159236 (Black et al., 191 , Plant Disease 75: 863; Boiteux et al 1995, Theor. Appl. Genet. 90: 146-149; Costa et al. 1995, First Int. Symposium on Solanaceae for the Fresh Market, March 28-31 1995, Málaga, España, Acta Hortic. 412: 523-532). También se han desarrollado marcadores moleculares para identificar y/o seleccionar Tsw ( 2000, Genome 43: 137-142) y Jahn et al. (2000, MPMI Vol 13: 673-682) han mapeado el gen Tsw en el cromosoma 10 en Capsicum annuum.

Un inconveniente es que la resistencia al TSWV conferida por el gen Tsw se rompe con temperaturas altas y también depende de la edad de la planta (las plantas jóvenes son más susceptibles). Las pruebas científicas parecen sugerir que el gen de la resistencia a Tsw puede funcionar alterando el transporte a larga distancia del TSWV (véase Rogero et al, ThripsTospoviruses: Proceedings of the 7,h Int Symposium on Thysanoptera, pp105 - 1 10).

Un problema adicional del gen Tsw es que se han notificado cepas que rompen la resistencia a Tsw del TSWV. Las cepas que rompen la resistencia a Tsw pueden infectar de forma sistémica a las plantas portadoras del gen dominante de resistencia a Tsw. El primer informe de una cepa que rompe la resistencia, que rompió la resistencia de C. chínense, se produjo en 1993 (Boiteaux et al. Plant Disease 77: 210). Later Moury et al. (1997, Euphytica 1994: 45-52) también hallaron cepas virales que superan la resistencia mediada por Tsw, aunque no se indicó si, de hecho, los aislados víricos eran aislados del TSWV y no aislados de GRSV o TCSV.

Roggero et al. (1999, Plant Disease Vol 83: p965) hallaron dos aislados de campo del TSWV en Italia que superaban la resistencia a Tsw en un híbrido de pimiento portador del gen Tsw de Pl 15225. Los ensayos sexológicos confirmaron que los aislados víricos eran cepas del TSWV, que podían ser transmitidas por el vector de trips Frankliniella occidentalis. En 2002, Roggero et al. Notificaron más cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw en Italia (Plant Disease Vol 86: 950-954). Todas las variedades cultivadas de pimiento comerciales podrían ser infectadas sistémicamente por estas cepas de rotura de resistencia al TSWV en condiciones experimentales. No obstante, las variedades cultivadas de tomate resistentes al TSWV, portadoras del gen Sw-5, no eran susceptibles a las cepas de rotura de resistencia a Tsw, lo que demuestra que Sw-5 y Tsw tienen características diferentes (Roggero et al. 2002, mencionado anteriormente). Esto también lo confirmó Jahn et al. (2000, mencionado anteriormente).

En 2004, Margaría et al. (Plant Pathology Vol 53: p794) notificaron la identificación de cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw en el campo de España (Almería).

Margaría et al. 2007 (MPMI Vol 20: 547-558) estudiaron la interacción entre plantas de pimiento portadoras del gen dominante de resistencia Tsw y varias cepas de TSWV naturales, tanto cepas silvestres como cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw. Las cepas de TSWV capaces de superar la resistencia mediada por Tsw se designan con el superíndice "RB" en su estudio. Una de estas cepas capaces de superar la resistencia es Ve427RB aislado en 2003 de un campo de pimientos en Almería, España. En contraste con las cepas de TSWV silvestre que solo produjeron daños locales sobre las hojas de pimiento inoculadas de plantas portadoras del gen Tsw, las cepas capaces de TSWV capaces de superar la resistencia produjeron infecciones sistémicas, lo que conduce a, por ejemplo, clorosis de las hojas y moteado amarillo en las plantas infectadas. Usando cepas con reorganizaciones entre genomas de cepas silvestres (cepa BrOI^) y RB, Margaría et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558) pudieron demostrar que el determinante de la avirulencia de las cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw es la proteína NSs (proteína no estructural) hallada en el ARN pequeño (S ARN). En las cepas capaces de superar la resistencia de este estudio, la proteína NSs contenía una o dos mutaciones o deleciones respecto a la proteína NSs silvestre.

Aunque el gen Tsw dominante sigue siendo útil para proporcionar resistencia contra el TSWV a las variedades de pimiento en muchas partes del mundo, se necesitan urgentemente nuevas fuentes de resistencia al TSWV con el fin de minimizar los daños causados por las cepas nuevas del TSWV, especialmente por las cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw.

Es un objetivo de la invención proporcionar plantas de pimiento que comprenden un nuevo gen de resistencia, diferente del gen Tsw, que confiere resistencia contra las cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw, tales como cepas que comprenden mutaciones y/o deleciones en la proteínas NSs.

En una realización, el nuevo gen de resistencia confiere al menos resistencia contra la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw Ve427RB. Es otro objetivo de la invención proporcionar plantas de pimientos que comprenden tanto el nuevo gen de resistencia como el gen Tsw, es decir, plantas que son resistentes a las cepas de TSWV silvestres (patotipo PO) y contra cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw (patotipo P1) al menos contra Ve427RB, pero', preferentemente, también contra otras cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw (tales como cepas que tienen una o más deleciones y/o mutaciones en la proteína NSs y/o cepas que pueden producir infección sistémica en plantas de pimiento portadoras del gen Tsw).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Como se usa en el presente documento, el término "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitante para indicar que los artículos que siguen a la palabra están incluidos pero que los artículos no mencionados específicamente no están excluidos. No obstante, el experto entenderá que el término "comprende" también abarca el término "consiste". Por tanto, en realizaciones de la presente invención, un elemento que comprende un subelemento, por ejemplo un QTL, también puede consistir en dicho subelemento. Además, la referencia a un elemento mediante la cita de "un" o "uno/una" no excluye la posibilidad de que haya presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. Por tanto, "un" o "uno/una" normalmente significa "al menos uno/a" o "uno/a o más", por ejemplo "una célula" también hace referencia a varias células en forma de cultivos celulares, tejidos, organismo entero etc. De forma similar, "una planta" también hace referencia a una pluralidad de plantas.

"Fenotipo" es el aspecto fisiológico y/o externo de la planta que se puede observar como resultado de la interacción entre su genotipo y su entorno. Incluye las características morfológicas y/o fisiológicas observables.

"Genotipo" es el total de la información genética hereditaria de una planta, influida en parte por los factores ambientales, que se expresa en el fenotipo.

Como se usa en el presente documento, "planta de pimiento" o "pimiento" es una planta del género Capsicum o partes de las mismas (p. ej. frutos). El pimiento incluye todos los tipos de pimientos, tales como pimientos picantes/chiles y pimientos no picantes (pimiento dulce). El término abarca muestras de pimientos silvestres y domesticados.

"Pimiento domesticado" hace referencia a las especies Capsicum annuum L, Capsicum chínense Jacq., Capsicum frutescens L, Capsicum baccatum L, y Capsicum pubescens Ruiz y Pav.

La expresión "variedad cultivada" (o "planta cultivada") se usa en el presente documento para indicar una planta que tiene un estado biológico aparte de un estado "silvestre", en el que estado "silvestre" indica el estado original no cultivado, no domesticado o natural de una planta o muestra y el término cultivado no incluye dichas plantas silvestres o maleza. La expresión variedad cultivada no incluye material con buenas características agronómicas, tales como material de cultivo, material de investigación, líneas de cultivo, líneas de cultivo de élite, población sintética, híbridos, población base/reserva fundadora, líneas endogámicas, variedad cultivada (polinizada abierta de variedad cultivada híbrida), población de segregación, shock mutante/genético y variedades cultivadas avanzada/mejorada. En una realización, la expresión variedad cultivada también incluye variedades autóctonas, es decir plantas (o poblaciones) de pimiento seleccionadas y cultivadas localmente por los seres humanos durante muchos años y adaptadas a un ambiente geográfico específico y que comparten un conjunto génico común. En general, "pimiento cultivado" hace referencia a líneas y variedades de cultivo de pimientos domesticados que cultivan los seres humanos en el campo o en ambientes protegidos (p. ej., invernaderos o túneles) para la producción de frutos. Las variedades cultivadas tienen buenas propiedades agronómicas en comparación con las muestras silvestres, tales como un rendimiento elevado, mayor tamaño de los frutos, fertilidad más alta, mayor uniformidad de las plantas y/o los frutos, etc. Ejemplos de variedades cultivadas incluyen variedades cultivadas que pertenecen a las especies Capsicum annuum, Capsicum chínense, Capsicum frutescens, Capsicum baccatum y Capsicum pubescens.

Como se usa en el presente documento, el término "planta" incluye la planta entera o cualquier parte o derivados de la misma, tales como órganos de plantas (p. ej., frutos recolectados o no recolectados, hojas, semillas, flores etc.), células vegetales, protoplastos vegetales, células vétales o cultivos titulares a partir de los cuales se pueden regenerar plantas enteras, callos de plantas, grumos de células vegetales y células vegetales intactas en plantas, o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, ovarios, frutos (p. ej., tejidos u órganos recolectados, tales como frutos de pimientos recolectados o partes de los mismos), flores, hojas, semillas, plantas propagadas clonalmente, raíces, rizomas, tallos, extremos de las raíces y similares. Asimismo se incluye cualquier estadio del desarrollo, tales como plántulas, inmaduros y maduros, etc.

El término "fruto", como se usa en el presente documento, hace referencia a frutos de pimiento que estaban en crecimiento sobre una planta de pimiento que confiere resistencia contra las cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw tales como la cepa Ve427RB. En una realización, un fruto es un fruto recolectado. En una realización, dicho fruto carece de semillas, es decir no contiene semillas o contiene semillas no viables o no contiene semillas maduras en todas las fases de su desarrollo, incluyendo la fase madura, es decir no son adecuados para la propagación a través de semillas.

Los términos "pulpa", "vaina" o "carne" de un fruto de pimiento hacen referencia a las partes de un fruto que no son semillas. En general, la pulpa del fruto encapsula las semillas, es decir la pulpa y las semillas forman un fruto en el significado de la presente invención.

"Variedad de planta" es un grupo de plantas dentro del mismo taxón botánico del menor grado conocido, que (con independencia de si las condiciones para el reconocimiento de los derechos del agricultor se cumplen o no) se puede definir basándose en la expresión de características que son el resultado de un determinado genotipo o una combinación de genotipos, se puede distinguir de cualquier otro grupo de plantas por la expresión de al menos una de dichas características y se puede considerar como entidad, ya que se puede multiplicar sin cambios. Por tanto, la expresión "variedad de planta" no se puede usar para indicar un grupo de plantas, incluso sin son del mismo tipo, si se caracterizan todas por la presencia de un locus o gen (o una serie de características fenotípicas debido a este único locus o gen), pero que, de otro modo, pueden diferir unas de otras enormemente con respecto a los otros loci o genes.

Una "línea de planta" o "línea de cultivo" hace referencia a una planta y a su progenie. Como se usa en el presente documento, la expresión "línea endogámica" hace referencia a una línea de planta que se ha autofecundado repetidamente.

"Fi, F2, etc." Se refiere a las generaciones relacionadas consecutivas tras un cruce entre dos plantas parentales o líneas parentales. Las plantas cultivadas a partir de las semillas producidas cruzando dos plantas o líneas se denominan la generación Fi La autofecundación de las plantas Fi tienen como resultado la generación F2, etc. Planta "híbrida Fi" (o semilla híbrida F^ es la generación obtenida del cruce de dos líneas parentales endogámicas.

"Híbrido" o "planta híbrida" es una planta producida por el intercruzamiento (fertilización cruzada) de al menos dos plantas diferentes o plantas de líneas parentales diferentes. Se entiende que las semillas de dicho cruce (semillas híbridas) están abarcadas en el presente documento, así como las plantas híbridas cultivadas a partir de dichas semillas y partes de plantas derivadas de las plantas cultivadas.

El término "rasgo" hace referencia a una característica hereditaria, tal como resistencia al TSWV, que es transferible, por ejemplo mediante cruzamiento y selección de una planta a otra.

"TSWV", "cepas de TSWV" o "aislados de TSWV" o "patotipos de TSWV" hace referencia a cepas del virus del bronceado del tomate que se pueden determinar serológicamente (usando, por ejemplo, anticuerpos producidos contra la nucleocápside o glicoproteína del TSWV, véase RoggeroMasenga, 2002, Plant Dis. Vol 86, 950-953) o mediante comparación de secuencia, por ejemplo comparando una cepa con el aislado brasileño BrOI^ para el cual se ha determinado la secuencia genómica completa (números de acceso en GenBank NC 002050, NC 002051 y NC_002052).

"Cepas de TSWV silvestres (WT)" O "Patotipo P0" hacen referencia a cepas del TSWV contra las que el gen dominante de resistencia Tsw conocido en la técnica confiere resistencia. Por ejemplo, una planta resistente que tiene el gen de resistencia Tsw esencialmente no muestra síntomas sistémicos tales como el moteado amarillo sobre las hojas superiores no inoculadas tras la infección o tras la inoculación artificial como se puede realizar en, por ejemplo, un ensayo de resistencia usando el patotipo PO como se ha descrito en el presente documento. Ejemplos de cepas del TSWV WT son, por ejemplo, p 105^ o Ve430WT, ambas descritas en Margaría et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558). Ambas cepas se pueden identificar por sus secuencias del segmento S que se depositan en GenBank con el número de acceso DQ376178 y DQ376184, respectivamente.

Un "gen de resistencia al TSWV" o "alelo de resistencia al TSWV" es un gen o alelo o región de ADN que comprende dicho gen o alelo que, cuando está presente en el genoma de la planta, confiere o potencia la resistencia contra una o más cepas de TSWV en comparación con una planta que carece del gen o alelo o región de ADN.

"Gen Tsw" o "gen de resistencia Tsw" hace referencia al gen dominante de resistencia como se conoce en la técnica, por ejemplo que se puede obtener de C. chínense Pl 152225, Pl 159236 o de variedades de pimiento comerciales que comprenden el gen Tsw, tal como C. annuum cv. Explorer (una variedad de pimiento morrón híbrido comercial). La presencia o ausencia del gen Tsw se puede determinar usando un ensayo de resistencia como se ha descrito en los Ejemplos y/o usando un ensayo con marcadores moleculares proporcionado en la técnica anterior (p. ej., Moury et al. 2000, Genome 43: 137-142 y Jahn et al. 2000, MPMI Vol 13: 673-682).

"Cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw" (RB) o "patotipo P1" hace referencia a las cepas del TSWV capaces de causar síntomas de enfermedad sistémica (moteado amarillo sobre las hojas superiores no inoculadas) o planas que comprenden un gen de resistencia Tsw funcional, tal como, por ejemplo, en plantas de C. chínense Pl 152225, Pl 159236 o la variedad cultivada de C. annuum "Explorer". En una realización, se forman lesiones necróticas locales en la hoja inoculada. En una realización, las cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw comprenden una o más mutaciones y/o deleciones en la proteína no estructural (NSs) (véase Margaría et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558) y de Haan et al. (1990, J. Gen. Virol. 71 : 1001-1007)).

"Ve427RB" hace referencia a la cepa RB aislada de un campo de España (Almería), como se ha descrito en Margaría et al. (2004, 2007, mencionado anteriormente) y del que una muestra representativa se ha depositado en el DSZM con el número de acceso DSM 24829.

Una planta de pimiento que tiene o comprende "resistencia a Ve427RB" o que es "resistente a Ve427RB" hace referencia a una planta de pimiento que no desarrolla síntomas sistémicos tras la inoculación o infección con Ve427RB. Esto se puede analizar usando varios procedimientos, un ejemplo es usando un ensayo de inoculación artificial, tal como, por ejemplo, el ensayo de resistencia a Ve427RB como se describe en el presente documento, de modo que, por ejemplo, en las dos hojas más jóvenes de una planta de pimiento que tiene de cinco a seis hojas completamente desarrolladas, se inocula Ve427RB y las hojas superiores en las que no se ha inoculado no muestran síntomas de moteado amarillo aproximadamente 28 días después de la inoculación. En una realización se dice que una línea o variedad de planta es resistente a Ve427RB si no muestra esencialmente síntomas sistémico, lo que significa que al menos un 60& de las plantas infectadas o inoculadas, preferentemente al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o más (p. ej., 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) no muestran síntomas sistémicos (es decir, no moteado amarillo en las hojas superiores no inoculadas).

Un "elemento genético en el que el elemento genético comprende un QTL que confiere resistencia a Ve427RB o una parte del mismo que confiere resistencia a Ve427RB o "un QTL que confiere resistencia a Ve427RB" hace referencia a un elemento genético, por ejemplo un ácido nucleico (tal como ADN genómico), que confiere o potencia en un aplanta de pimiento la resistencia contra una cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw Ve427RB. En una realización, dicho elemento genético deriva de / se obtiene de una planta de Capsicum de muestra silvestre PA2638. Por tanto, en una realización, el elemento genético se puede obtener (se puede obtener) cruzando una planta de muestra PA2638 con otra planta de pimiento. "Muestra silvestre PA2638", como se usa en el presente documento hace referencia a una muestra silvestre obtenida de un mercado en Italia. Una muestra representativa de semillas de PA2638 ha sido depositada por Nunhems B.V. el 23 de febrero de 2010 con el número de acceso NCIMB 41936. En una realización, la presencia o ausencia del elemento genético que comprende un WTL que confiere resistencia a Ve427RB en una planta se puede determinar usando un ensayo de resistencia, por ejemplo el ensayo descrito en el presente documento como "ensayo de resistencia a Ve427RB y/o un ensayo de marcadores moleculares. En una realización, el elemento genético que comprende un QTL que confiere resistencia a Ve427RB se obtiene de, se puede obtener de, deriva de, es derivable de, se halla en las semillas depositadas con el número de acceso NCIMB 41817, NCIMB 41818 o NCIMB 41936, y plantas cultivadas a partir de estas semillas y/o progenie de las mismas. Por tanto, en una realización, el elemento genético que comprende un QTL que confiere resistencia a Ve427RB se origina, se obtiene de, se puede obtener a partir de, deriva de, es derivable del cruce de una planta cuyas semillas se depositaron con el número de acceso NCIMB 41817, NCIMB 41818 o NCIMB 41936, con otra planta de pimiento.

El "ensayo de resistencia a Ve427RB" es un ensayo adecuado para determinar la resistencia de una planta de pimiento contra las cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw y/o la presencia de un elemento genético que comprende un QLT que confiere resistencia a Ve427RB. El ensayo se describe de forma ilustrativa adicionalmente a continuación. Usando dicho ensayo, una planta, línea o variedad de planta se pueden clasificar como "resistentes" a una cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw, tal como Ve427RB.

"Resistencia" se refiere a una restricción estadísticamente significativa del crecimiento y/o desarrollo de un patógeno específico (p. ej., una o más cepas del TSWV) y/o una reducción estadísticamente significativa de los síntomas de enfermedad tras la infección con un patógeno específico (p. ej., una o más cepas de TSWV) en plantas que comprenden un gen de resistencia eficaz (o funcional) respecto a las plantas que carecen de un gen de resistencia eficaz (o funcional). La resistencia se puede determinar cualitativamente (clasificando las plantas de una línea o variedad concreta como "resistentes" o "susceptibles") y/o la resistencia se puede cuantificar, por ejemplo, en ensayos de resistencia, por ejemplo, medida como el porcentaje de plantas de una línea o variedad concreta que sobrevive a la infección con una cepa de virus ( % de supervivencia) o que no muestra esencialmente síntomas sistémicos si solo se infecta parte de una planta. En una realización, se dice que una línea o variedad es resistente a la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw si se clasifica como "resistente" de acuerdo con los síntomas, especialmente los síntomas sistémicos, que no se desarrollan tras la infección o inoculación con la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw, que se puede analizar en un ensayo de resistencia al TSWV, por ejemplo como se ha descrito en el presente documento. En una realización se dice que una línea o variedad de planta es resistente a una cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw si la línea o variedad de planta no muestra esencialmente síntomas sistémico, es decir, al menos el 60 % de las plantas, preferentemente al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o más (p. ej., El 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) no muestran síntomas sistémicos (es decir, no moteado amarillo en las hojas superiores no inoculadas) tras la infección o inoculación con la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw. El experto entenderá que al menos 10 plantas, 12, 15 o 20 o incluso más plantas por línea o variedad deben analizarse en las mismas condiciones de ensayo para evaluar si una línea o variedad es resistente y que deberían incluirse plantas control adecuadas.

El término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus concreto, cuyos alelos se refieren a un rasgo o característica en un locus específico. En una célula diploide de un organismo, los alelos de un gen dado se localizan en un lugar específico, o locus (loci en plural) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie de planta diploide, tal como pimiento, puede comprender un gran número de alelos diferentes en un locus concreto. Estos pueden ser alelos idénticos del gen (homocigotos) o dos alelos diferentes (heterocigotos).

"Plantado" o "plantada" se refiere a la siembra (sembrado directo) o al transplante de plántulas en un campo a mano o a máquina.

"Propagación vegetativa" hace referencia a la propagación de plantas a partir de tejido vegetativo, por ejemplo mediante propagación in vitro. La propagación in vitro implica cultivo celular o cultivo tisular in vitro y regeneración de una planta entera a partir del cultivo in vitro. Por tanto, los clones (es decir, propagaciones vegetativas genéticamente idénticas) de la planta original pueden generarse mediante cultivo in vitro y procedimientos de regeneración.

El término "locus" (loci en plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio o región sobre un cromosoma en el que, por ejemplo, se halla un gen o un QTL o marcador molecular. Las distancias entre los loci en el mismo cromosoma se miden por la frecuencia del entrecruzamiento. Cuando más separados están los dos loci, mayor es la probabilidad de que se produzca entrecruzamieno entre ellos. Por el contrario, si dos loci están muy cerca, es menos probable que se produzca entrecruzamieno entre ellos. Como norma, un centimorgan (cM) equivale a una recombinación del 1 % entre loci (p. ej., marcadores).

Los términos "QTL" y "Locus de rasgos cuantitativos" se usan en el presente documento con su significado reconocido en la materia. Los términos hacen referencia a una región localizada en un cromosoma concreto de Capsicum que se asocia con al menos un gen (o alelo) que codifica la resistencia a Ve427RB o al menos una región reguladora, es decir, una región de un cromosoma que controla la expresión de uno o más genes implicados en la resistencia a Ve427RB. La expresión fenotípica de dicho gen puede observarse, por ejemplo, como un índice reducido de la replicación viral y/o como un índice reducido del movimiento viral por la planta y/o el efecto fenotipico del mismo (p. ej., esencialmente sin desarrollo de síntomas sistémicos). Un QTL puede comprender, por ejemplo, uno o más genes cuyos productos confieren la resistencia genética. Como alternativa, un QTL puede comprender, por ejemplo, genes o secuencias reguladoras cuyos productos influyen la expresión de genes sobre otros loci en el genoma de la planta, de modo que confiere la resistencia a Ve427RB La expresión "fondo genético natural" se usa en el presente documento para indicar el fondo genético original de un QTL, es decir el genoma y el cromosoma en los que originalmente se encuentra el QTL. Por tanto, el genoma de PA2638 (número de acceso en NCIMB 41963) representa el fondo genético natural del elemento genético que comprende un QTL que confiere resistencia a Ve427RB de la invención. Por el contrario, un procedimiento que implica la transferencia (o introgresión) de una región de ADN (o fragmento de introgresión) que comprende el QTL, o una parte del mismo que confiere resistencia, del fondo genético original de PA2638 en otro fondo genético (p. ej., sobre el cromosoma de otro genoma) de otra planta o especie de Capsicum tendrá como resultado que dicho QTL, o dicha parte del mismo que confiere resistencia, no está en su fondo genético natural. Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo de unión" es sinónima de (la entidad física de) un cromosoma.

La expresión "marcador molecular", "marcadores genéticos" o "marcador de ADN" hace referencia en el presente documento a una secuencia de ácido nucleico polimórfica, detectada por varios procedimientos para visualizar las diferencias en las secuencias de ácido nucleico. Ejemplos de dichos procedimientos son marcadores de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) , marcadores de polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), inserciones, mutaciones, marcadores de microsatélites (SSR), regiones amplificadas caracterizadas por secuencia (SCAR), marcadores de secuencias polimórficas amplificadas escindidas (CAPS) o marcadores de isozimas o combinaciones de los marcadores, que define una localización cromosómica y específica. Un "marcador molecular ligado a un QTL, o gen o locus" se refiere a marcadores que están unidos físicamente a la región de ADN genómico que comprende un QTL, gen o locus y que se co-segregan con la región de ADN que comprende el QTL, gen o locus. Por tanto, los marcadores también pueden definir una región de introgresión.

Un "acontecimiento de recombinación" hace referencia a un acontecimiento de entrecruzamiento meiótico.

La expresión "vector de introgresión" o "región de ADN que ha sufrido introgresión", rasgo que ha sufrido introgresión" o "gen que ha sufrido introgresión" o "fragmento que ha sufrido introgresión" hace referencia a un segmento cromosómico que se ha transferido de un genoma de una planta al genoma de otra planta mediante procedimientos de cultivo, tal como retrocruzamiento.

"Introgresión" hace referencia en el presente documento a una región de ADN (región de introgresión), que confiere un rasgo o fenotipo concreto (p. ej., resistencia contra la cepa del TSWV VE427RB) de un genoma de una planta al genoma de otra planta de la misma especie, o de una especie estrechamente relacionada, mediante hibridación interespecífica. En concreto, hace referencia a la transferencia de esta región de ADN de una planta no cultivada o de una planta silvestre (que carece de buenas propiedades agronómicas) en el genoma de una planta cultivada (que tiene buenas propiedades agronómicas). Por tanto, en una realización, la planta de pimiento resultante comprende un genoma de una planta de pimiento cultivada en cuyo genoma se ha introducido un fragmento de introgresión del genoma de otra planta, en concreto de PA2638. La introgresión generalmente implica etapas de cultivo, tales como uno o más cruzamientos, autofecundaciones y/o retrocruzamientos, pero también puede implicar selección asistida por marcadores, selección fenotípica (p. ej., ensayos de resistencia), producción dobles haploides, rescate de embrión y similares.

"Retrocruzamiento" hace referencia a un procedimiento de cultivo en el que la planta resultante de un cruzamiento entre dos padres se (retro)cruza con uno de los padres. El padre usado en el retrocruzamiento se denomina padre recurrente. Varios retrocruzamientos tienen como resultado un genoma cada vez más homocigoto, de modo que se asemeja cada vez más al del padre recurrente. El retrocruzamiento se puede usar para introducir un rasgo de una planta donante (p. ej., una muestra silvestre) en otra planta (p. ej., una planta cultivada o línea de cultivo).

El término "autofecundación" hace referencia al proceso de autofertilización en el que un individuo es polinizado o fertilizado con su propio polen. Una planta que se ha "autofecundado" repetidamente (autofertilizado).

El término "proteína" hace referencia a un polipéptido que tiene un modo de acción, tamaño, estructura tridimensional u origen. Una proteína "silvestre" es una proteína completamente funcional, como está presente en el tipo silvestre, por ejemplo la cepa del virus TWSV silvestre. Una "proteína mutante" es, en el presente documento, una proteína que comprende una o más mutaciones en la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que conduce a la sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos en comparación con la proteína silvestre. Un "fragmento" o "porción" de una proteína puede, por tanto, seguir denominándose "proteína". Una "proteína aislada" se usa para hacer referencia a una proteína que ya no está en su ambiente natural.

La "proteína NSs silvestre" o "proteína no estructural silvestre" de TSWV es la proteína NSs hallada en la cepa silvestre, por ejemplo la proteína NSs de la cepa VE430 T tiene el número de acceso en ABD38700.1 (Figura 1 a), mientras que la proteína NSs de la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw VE427RB tiene la secuencia del número de acceso en GenBank ABD38702.1 (Figura 1 b), que solo difiere en 1 aminoácido de la proteína silvestre (es decir, es una "proteína NSs mutante") y que tiene una identidad de secuencia del 99 % con la proteína silvestre.

Una "mutación" en una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína es un cambio de uno o más nucleótidos en comparación con la secuencia silvestre, por ejemplo mediante sustitución, deleción o inserción de uno o más nucleótidos. Una "mutación puntual" es la sustitución de un único nucleótido, o la inserción o deleción de un único nucleótido. Una mutación "sin sentido" es una mutación (puntual) en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, de modo que un codón se cambia a un codón de terminación. Una proteína truncada puede tener una función reducida o pérdida de función. Una mutación "de sentido erróneo" es una mutación (puntual) en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, de modo que se modifica un codón para que codifique un aminoácido diferente. La proteína resultante puede tener una función reducida o pérdida de función o una función alterada.

La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" se pueden determinar mediante la alineación de dos péptidos o dos secuencias de nucleótidos usando algoritmos de alineación local o global. Por consiguiente, se puede hacer referencia a las secuencias como "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando (cuando están alineadas óptimamente mediante, por ejemplo, los programas GAP o BESTFIT o el programa Emboss "Needle" (usando los parámetros por defecto, véanse más adelante) comparten al menos un porcentaje mínimo determinado de identidad de secuencia (como se define adicionalmente más adelante). Estos programas usan el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias sobre la totalidad de su longitud, de modo que se maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. Generalmente se usan los parámetros por defecto con una penalización por creación de hueco= 10 y penalización por extensión de hueco= 0,5 (ambas para las alineaciones de nucleótidos y proteínas). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación por defecto usada es nwsgapdna y para las proteínas matriz de puntuación por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Las alineaciones y puntuaciones de las secuencias para el porcentaje de la identidad de secuencia se puede determinar, por ejemplo, usando programas de ordenador, tal como el paquete GCG Wisconsin Versión 10.3, disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA o EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/ emboss). Como alternativa, el porcentaje de identidad o similitud se puede determinar mediante búsqueda en bases de datos tales como FASTA, BLAST, etc., pero las coincidencias se deben recuperar y alinear por parejas para comparar la identidad de secuencia.

"Promedio" se refiere en el presente documento a la media aritmética.

"Capsaicina" es el componente activo de los pimientos chile, que son plantas que pertenecen al género Capsicum. Es irritante para mamíferos, incluyendo el ser humano, y produce una sensación de ardor. La cantidad de capsaicina varía significativamente entre diferentes variedades de Capsicum, incluyendo Capsicum annuum: Capsaicin La "escala de Scoville" es una medida del ardor picante (picor/pungencia) del pimiento. El número de unidades de calor Scoville (SHU) indica la cantidad de capsaicina presente. Un extracto de alcohol del aceite de capsaicina de una cantidad medida de pimiento desecado se añade de forma creciente a una solución de azúcar en agua hasta que el "calor" es únicamente detectable por un panel de (normalmente cinco) catadores; el grado de dilución proporciona su medida en la escala de Scoville Como alternativa, el calor del picor se puede medir usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). Este procedimiento tiene como resultado unidades de pungencia en la American Spice Trade Association (ASTA). Los procedimientos de la HPLC son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, una descripción de DIONEX. El sistema analítico ¡socrático consistió en una bomba, automuestreador, cámara termostática, un detector CoulArray® de cuatro canales y un detector UV/vis colocado antes de la matriz. Condiciones de CL: Columna: MD-150 (3 x 150mm; 3µ?t?), Fase móvil: acetato amónico 50mM, pH 4.4, con ácido acético; 45 % de acetonitrilo, Caudal 0,8 ml/min, Temperatura: Volumen de inyección ambiental: 20 µ?, Detectores y condiciones: Detector electroquímico: Modelo 5600A, CoulArray, con modelo 5010 Analytical Cell, Potenciales aplicados: +150, +450mV vs. Pd, detector UV: Detector UV estándar, longitud de onda: 235 y 280nm. Una medición de una parte de capsaicina por millón corresponde a aproximadamente 15 unidades Scoville. No obstante, el procedimiento de Scoville se prefiere a la hora de determinar el picor / pungencia del pimiento.

El experto entiende que el término "aproximadamente" en combinación con un valor hace referencia preferentemente al valor exacto. No obstante, en general, el término "aproximadamente" abarca también variaciones del valor debido a las inexactitudes de medición sabidas y aceptadas en una técnica de medición o en una distribución biológica. En general, dicha inexactitud es inferior al 10 %, inferior al 8 %, inferior al 6 %, inferior al 4 %, inferior al 2 %, inferior al 1 %, inferior al 0,1 %, inferior al 0,01 % dependiendo de la técnica de medición. El experto en la técnica, basándose en sus conocimientos generales, identificará sin una carga indebida aceptable, inexactitudes en una técnica de medición conocida o proceso biológico tal como la distribución de las progenies cuando se aplican las leyes de Mendel.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 a: Proteína NSs de la cepa VE430WT.

Figura 1 b: Proteína NSs de la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw VE427RB Figura 2: Frutos de PA2638 (NCIMB41936). Cinco frutos verdes (derecha) y cinco frutos rojos/maduros (izquierda).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw VE427RB se halló, entre otras cepas, que era capaz de superar la resistencia de plantas de pimiento portadoras del gen de resistencia a Tsw (Margario et al. 2004, 2007 mencionado anteriormente). Usando inoculaciones artificiales con esta cepa aislada de un campo de España, sorprendentemente se encontró que una muestra de Capsicum silvestre, designada PA2638, que era resistente a Ve427RB, es decir, esencialmente no se observaron síntomas sistémicos cuando se inocularon plantas de PA2638 artificialmente. Ve427RB es una cepa que es capaz de producir infección sistémica en plantas de pimiento que comprenden el Tsw. Sorprendentemente, esta nueva fuente de resistencia PA2638 no fue resistente a la cepa de TSWV silvestre, lo que indica que esta nueva fuente de resistencia debería apilarse idealmente con otros genes de resistencia, tal como el gen dominante Tsw.

La muestra de pimiento silvestre se confirmó mediante análisis PCR que carecía del gen de resistencia Tsw.

El nuevo elemento genético que comprende un QL que confiere resistencia a Ve427RB se sometió a introgresión desde PA2638 al pimiento cultivado mediante retrocruzamiento repetido de plantas F2 seleccionadas resistente a Ve427RB. PA2638 es una planta de pimiento picante, es decir, los frutos de PA2638 producen / contienen capsaicina. En otras palabras, los frutos maduros de PA2638 contienen al menos 600 SHU o al menos 40 unidades de pungencia ASTA.

Líneas de plantas Un aspecto de la presente invención se refiere a una planta de pimiento del género Capsicum, preferentemente una planta de pimiento cultivado que es resistente contra la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw del virus del bronceado del tomate (TSWV) designado Ve427RB, una muestra representativa de la cual se ha depositado con el número de registro DSM 24829, y dicha planta de pimiento comprende un elemento genético que comprende un QTL que confiere resistencia a Ve427RB o una parte de la misma que confiere resistencia a Ve427RB que no está en su fondo genético natural. Por ejemplo, si el su fondo genético natural de dicho elemento genético es PA2638, una planta de acuerdo con la presente invención no es una planta PA2638. Por tanto, la planta acuerdo con la invención comprende una planta de pimiento que tiene un genoma de pimiento cultivado, comprendiendo dicho genoma un fragmento de intogresión que confiere resistencia a Ve427RB de una planta de pimiento no cultivada, por ejemplo de PA2638.

Otro aspecto de la presente invención hace referencia a la provisión de una planta de pimiento del género Capsicum que comprende en su genoma un elemento genético derivado de / obtenible de / obtenido de una planta de PA2638, dicho elemento genético comprende un QTL que confiere resistencia a TSWV para superar la resistencia mediada por Tsw o una parte de la misma que confiere resistencia a TSWV para superar la resistencia mediada por Tsw con la condición de que la planta del género Capsicum no sea PA2638.

Un aspecto de la presente invención hace referencia a la provisión de una planta de pimiento del género Capsicum que comprende en su genoma un QLT que confiere resistencia frente a las cepas de TSWV capaces de superar la resistencia mediada por Tsw que pueden producir infección sistémica en plantas de pimiento que comprenden el gen Tsw.

En un aspecto, la presente invención proporciona una planta de pimiento del género Capsicum que comprende en su genoma un elemento genético, dicho elemento genético comprende un QLT que confiere resistencia frente a las cepas de TSWV capaces de superar la resistencia mediada por Tsw o una parte de la misma que confiere resistencia al TSWV que supera la resistencia mediada por Tsw, en el que dicho elemento genético o su parte que confiere resistencia no está en su fondo genético natural. Preferentemente, esta resistencia deriva de / se obtiene de / obtenible de PA2638, es decir PA 2638 es el fondo genético natural de dicho elemento genético.

"Derivado de", "obtenido de" y "obtenible de" hacen referencia en el presente documento a un rasgo (y una planta que comprende el rasgo) que se obtiene / se puede obtener mediante cruzamiento de una planta de la cual las semillas se depositan con uno o más números de acceso. Esto puede implicar un primer cruzamiento, seguido de varias autofecundaciones y/o (retro)cruzamientos. Por tanto, el elemento genético que confiere el rasgo se puede someter a introgresión o transferir a otro fondo genético.

Un aspecto de la presente invención hace referencia a una planta de pimiento del género Capsicum que comprende en su genoma un elemento genético, dicho elemento genético comprende un QTL que confiere resistencia a TSWV capaz de superar la resistencia mediada por Tsw o una parte de la misma que confiere resistencia a TSWV capaz de superar la resistencia mediada por Tsw, que produce frutos maduros que tienen una anchura de al menos 2 cm por su parte más ancha, es decir los frutos maduros tienen una anchura de al menos aproximadamente 2 o más cm, tal como al menos aproximadamente 3 cm, 4 cm, 5 cm, 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, 1 1 cm, o más, y/o tienen una longitud del fruto de al menos 5 cm, 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, 1 1 cm, 12 cm, 13 cm, 14 cm, 15 cm, 16 cm, 17 cm, 18 cm, 19 cm o más. Por ejemplo, dicha planta producir frutos del tipo campana o de tipo lamuyo.

En una realización, dicha cepa del TSWV capaz de superar la resistencia mediada por Tsw se caracteriza por una proteína NSs mutante, en el que la modificación de la proteína NSs de dicha cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw se selecciona de una, dos, tres o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en intercambio de un solo aminoácido, deleción de un aminoácido en comparación con la proteína silvestre de la cepa WT relacionada en la región en la que se aisló dicha cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw, lo que hace que dicha cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw puede superar la resistencia conferida por el gen Tsw dominante. En una realización, la secuencia de la proteína NSs de una cepa silvestre es pITO^, como se divulga en la Figura 3 de Margaría et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558), ?105"" como se divulga en la Figura 3 de Margaría et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558), o la secuencia de la proteína NSs de Ve430WT que tiene el número de acceso ABD38700.1. En una realización preferida, una cepa silvestre de TSWV es ???d^ o Ve430WT, que se puede identificar mediante las secuencias de su segmento S que están depositadas en GenBank con el número de acceso: DQ376178 y DQ376184, respectivamente. En una realización, una cepa de TSWV capaz de superar la resistencia mediada por Tsw comprende o contiene una o dos mutaciones en su secuencia de la proteína NSs seleccionada del grupo que consiste en el intercambio de un aminoácido y una deleción de un aminoácido comparado con la secuencia de la proteína NSs silvestre, por ejemplo la proteína NSs de la cepa silvestre que tiene número de acceso en GenBank ABD38700.1 y la secuencia de la proteína NSs de la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw tiene un intercambio de aminoácidos en la posición 85. En una realización, la proteína NSs de la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw tiene una secuencia con el número de acceso en GenBank ABD38702.1 (en referencia a Ve427RB). En una realización, la proteína NSs de la cepa silvestre tiene un número de acceso en GenBank ABD38700.1 (véase la Figura 1). En otra realización, la proteína NSs de la cepa silvestre es la proteína NSs de ???d^7 (número de acceso DQ376178).

Preferentemente, la cepa del TSWV capaz de superar la resistencia mediada por Tsw es Ve427RB, una muestra representativa de Ve427RB se ha depositado con el número de acceso DSM 24829. El experto en la técnica sabe que la resistencia contra Ve427RB no, por supuesto, excluye la resistencia a otras cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw. No obstante, la resistencia contra Ve427RB, como se usa en el presente documento, no incluye resistencia contra las cepas silvestres del TSWV (es decir, cepas contra las que el gen Tsw confiere resistencia).

En una realización, una planta de pimienta de acuerdo con la presente invención es una planta de pimiento que es resistente contra la cepa capaz de superar la resistencia a Tsw Ve427RB, en la que dicha planta de pimiento no es PA2638 (NCIMB 41936).

En una realización, una planta de pimiento que tiene frutos maduros con una proporción entre la longitud y la anchura de, como máximo, 3, preferentemente, como máximo 2, y una anchura de 2 o más cm por su lado más ancho comprende un elemento genético que comprende un QLT que confiere resistencia a Ve427RB o una parte del mismo que confiere resistencia a Ve427RB que deriva de / se obtiene del es derivable de / se puede obtener de la muestra silvestre, semillas representativas de los mismos se depositaron con el número de acceso NCIMB 41936.

Una planta de pimiento de acuerdo con la presente invención es, preferentemente, una planta de pimiento cultivada (variedad cultivada). Además, la planta de pimiento cultivada de acuerdo con la presente invención puede ser de la especie seleccionada del grupo que consiste en Capsicum annuum (C. annuum), Capsicum chínese (C. chínese), Capsicum baccatum (C. baccatum), Capsicum frutescens (C. frutescens), Capsicum pubescens (C. pubescens), preferentemente Capsicum annuum. En una realización, la planta de pimiento de acuerdo con la presente invención es una línea endogámica. En una realización específica, la planta de pimiento de acuerdo con la presente invención es un híbrido, en particular un híbrido F1. El fragmento de introgresión que comprende el QLT que confiere resistencia a Ve427RB puede estar en forma heterocigota u homocigota en la planta de pimiento, la línea endogámica o el híbrido F1.

En una realización, una planta de pimiento de acuerdo con la presente invención es una planta de pimiento dulce. Un "pimiento dulce" de acuerdo con la presente invención es una planta de pimiento cuyos frutos tienen una puntuación promedio de entre 0 SHU y 500 SHU, preferentemente de entre 0 SHU y 200 SHU, más preferible entre 0 SHU y 50 SHU en la escala de Scoville. En una realización, la pungencia de un pimiento dulce es de aproximadamente 0 SHU. En otra realización, la cantidad de capsaicina de los frutos de pimiento está entre 0 y aproximadamente 30 unidades de pungencia ASTA, preferentemente entre 0 y 13 unidades de pungencia ASTA, o incluso entre 0 y 2 unidades de pungencia ASTA. En realizaciones diferentes, los frutos de la planta de pimiento de acuerdo con la invención tienen una SHU de entre 0 y 100 o entre 0 y 500, o entre 00 y 500, o entre 500 y 1000, o entre 1000 y 2000, o entre 2500 y 5000 o más. En realizaciones adicionales, los frutos de una planta de pimiento de acuerdo con la presente invención tienen una puntuación entre aproximadamente 5.000 SHU y aproximadamente 20.000 SHU o más de aproximadamente 25.000 SHU, tal como entre 30.000 y 50.000, o entre 50.000 y 100.000, o entre 100.000 y 200.000, o entre 100.000 y 350.000 SHU, o por encima de 350.000 SHU.

En otra realización más, una planta de pimiento de acuerdo con la invención es una planta de pimiento del tipo campana. Generalmente, un pimiento campana es una planta cuyos frutos maduros tienen una proporción longitud/anchura de aproximadamente 1 ,5 a aproximadamente 0,7 y una longitud promedio del fruto de al menos aproximadamente 7,5 cm, 8 cm, 9, cm, 10 cm o más, por ejemplo entre aproximadamente 7,5 cm y aproximadamente 17,5 cm. Preferentemente, los frutos maduros tienen una proporción longitud/anchura de aproximadamente 1.3 a aproximadamente 0,9 y una longitud promedio del fruto de al menos aproximadamente 7,5 cm, 8 cm, 9, cm, 10 cm o más, por ejemplo una longitud entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 15 cm. El color del fruto puede ser, por ejemplo, verde, rojo, amarillo, naranja, blanco, arco iris (entre las etapas de maduración) y púrpura. Los pimientos campana de Norteamérica hacen referencia a frutos de aproximadamente 10 cm de longitud y aproximadamente 10 cm de anchura, mientras que en Europa, los pimientos campana pueden tener una forma menos de tipo bloque y más alargada. El pimiento campana es un grupo del género Capsicum y es de la especie Capsicum anuum L. En una realización, un pimiento de tipo campana no produce capsaicina o solo produce capsaicina gasta 500 SHU o 30 unidades de pungencia ASTA. En una realización preferida, un pimiento campana no produce capsaicina. En otra realización más, la forma de un fruto de tipo campana es esencialmente idéntica a la forma del pimiento campana como se describe en "Capsicum Pepper VarietiesClassification (New México State University, Circular 530, College of AgricultureHome Economics, http ://www. reocities.com/wstarron/circ530. pdf) .

En otra realización más, la proporción longitud/anchura del fruto pimiento maduro de una planta de acuerdo con la presente invención es, como máximo, de aproximadamente 4, como máximo de aproximadamente 3,0, como máximo de aproximadamente 2,5, como máximo de aproximadamente 2,0, como máximo de aproximadamente 1 ,5.

En otra realización más, la anchura de un fruto pimiento maduro de una planta de acuerdo con la presente invención es de al menos aproximadamente 1 ,5 cm, al menos aproximadamente 2,0 cm, al menos aproximadamente 3,0 cm, al menos aproximadamente 4,0 cm, al menos aproximadamente 6 cm, al menos aproximadamente 7 cm, al menos aproximadamente 8 cm, al menos aproximadamente 9 cm, al menos aproximadamente 10 cm, o más, en su parte más ancha.

En otra realización más, la anchura de un fruto pimiento maduro de una planta de acuerdo con la presente invención es de al menos 4.0 cm, tal como 6.0 cm o más, 7 cm o más, o 8 cm, o más cm, en su parte más ancha, y la proporción longitud/anchura es, como máximo 3, preferentemente como máximo 2,5, preferentemente como máximo 2,0, o, como máximo, 1 ,5.

En otra realización más, una planta de pimiento de acuerdo con la presente invención es una planta de pimiento representativa de muestras de semillas que se han depositado con los números de acceso NCIMB 41817 o NCIMB 41818; o una planta de pimiento que deriva de / es derivable de / se obtiene de / se puede obtener del depósito de semilla NCIMB 41817 o NCIMB 41818, por ejemplo un híbrido Fi derivado del mismo que conserva la resistencia a VE427RB. Por tanto, en un aspecto, la planta de pimiento de acuerdo con la presente invención que comprende resistencia a VE427RB se puede obtener mediante / se obtiene mediante el cruzamiento de una planta cuyas semillas se depositaron con el número de acceso NCIMB 41817 o NCIMB 41818 con otra planta de pimiento.

En una realización preferida, el fragmento de introgresión que proporciona resistencia contra VE427RB puede ser un fragmento más corto que el fragmento hallado en NCIMB 41817 y/o NCIMB 41818 que todavía confiere una resistencia a la cepa de TSWV capaz de superar la resistencia mediada por Tsw tal como resistencia a Ve427RB. Una planta de pimiento que comprende un fragmento de introgresión más corto se puede producir mediante cultivo con NCIMB 41817 o NCIMB 41818 y seleccionando la progenie recombinante que conservan la resistencia a Ve427RB. Por ejemplo, NCIMB 41817 o NCIMB 41818 se pueden cruzar con una planta de pimiento que carece del fragmento de introgresión para generar una planta F1 , autofecundando F1 para producir una generación F2 (o cualquier generación posterior) y seleccionar la generación F2 para plantas que son resistentes a Ve427RB usando, por ejemplo, el ensayo de resistencia descrito en el presente documento. Una planta recombinante que comprende un fragmento de introgresión más corto que se puede identificar después usando procedimientos estándar, por ejemplo marcadores moleculares o FISH (hibridación fluorescente in situ), Otro aspecto más de la presente invención hace referencia a frutos de una planta de pimiento de acuerdo con la presente invención o la carne de dicho fruto de pimiento, es decir, las partes de no propagación de un fruto. En una realización, los frutos pimientos de una planta de pimiento de acuerdo con la presente invención tienen semillas viables, mientras que en otra realización, los frutos comprenden únicamente semillas no viables o carecen de semillas (partenocárpicos).

Una realización de acuerdo con la presente invención hace referencia a un tejido o una célula vegetal de un fruto recolectado que no es adecuado para la propagación, incluso en condiciones de cultivo tisular y celular. Los frutos de pimiento de plantas de acuerdo con la presente invención se pueden seleccionar de una amplia gama de diferentes tipos conocidos en la materia. Por ejemplo, los frutos de pimiento pueden tener los tipos siguientes: Campana (forma de bloque), cayena, de tipo lamuyo (forma de bloque largo), dulce italiano, conical, capia, charleston dulce, dolma, cherry, jalapeño, shakira, lápiz o Charleston picante, Sivri (p. ej., Demre Sivri or Kazanli Sivri), cera húngara, Kapya/Florinis, banana, Fresno, Serrano, Ancho, Anaheim, Pasilla, Santa Fe, sombrero escocés Scotch bonnet, Habanero. Algunas imágenes de ejemplo, aunque no limitantes, de diferentes tipos de pimiento se divulgaron en Bosland et al. (1996). Los fruto también pueden tener cualquier color.

Otro aspecto más de la presente invención hace referencia a semillas de una planta resistente a VE427RB como se describe en el presente documento o semillas de las que se puede cultivar una planta resistente a VE427RB como se describe en el presente documento.

Una realización adicional se refiere al uso de una planta de Capsicum de acuerdo con la invención como padre en un cruce con otra planta de Capsicum. Asimismo, se proporciona un procedimiento para generar otras plantas de Capsicum que comprenden resistencia a VE427RB, es decir transferir el fragmento de introgresión que confiere resistencia a VE427RB de una planta de acuerdo con la invención (p. ej., de semillas depositadas en el presente documento o progenies de las mismas) en otras plantas de Capsicum o transfiriendo un fragmento de ADN genómico que comprende un QTL que confiere resistencia a VE427RB de PA2638 en plantas de Capsicum cultivadas.

Oro aspecto más hace referencia a células vegetales de una planta de acuerdo con la presente invención, que comprende un elemento genético que comprende un QLT que confiere resistencia a VE427RB o una parte del mismo que confiere resistencia a VE427RB En una realización, dichas células vegetales son células regenerables, es decir se pueden regenerar en una planta de pimiento entera que es resistente a VE427RB. En otra realización, dichas células no son regenerables. En un aspecto adicional, se proporciona un cultivo celular in vitro o en cultivo tisular in vitro que comprende o que consiste en células de plantas de la invención. Las células y tejidos pueden ser polen, ovarios, embrión, hoja, tallo, hipocotiledones, cotiledones, partes de frutos, meristemo u otras células/tejidos que comprenden el elemento genético que confiere resistencia a VE427RB. Asimismo, se proporciona una planta regenerada.

La resistencia de una planta contra una cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw, tal como VE427RB , se puede analizar mediante varios procedimientos, tal como el ensayo de resistencia a VE427RB divulgado en el presente documento. El ensayo de resistencia a VE427RB descrito en el presente documento es adecuado para determinar la resistencia contra los patotipos silvestre (WT; P0) y capaz de superar la resistencia (RB) (P1 ), asimismo, es decir, no se limita a determinar la resistencia contra VE427RB y se puede usar para identificar otras cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw y para identificar nuevas fuentes de resistencia, contra otros patotipos P1. En las diferentes realizaciones descritas en el presente documento, por tanto se puede sustituir VE427RB por otras cepas capaces de superar la resistencia mediada por Tsw que sí producen síntomas sistémicos en las plantas de Capsicum que comprenden el gen Tsw. Se entiende que dichas realizaciones son igualmente realizaciones de la invención.

Ensayo de resistencia Para identificar y/o seleccionar plantas de Capsicum que comprenden un fragmento de introgresión que confiere resistencia a VE427RB de acuerdo con la invención se puede usar el siguiente ensayo de resistencia, o ensayos alternativos. A continuación se describe el ensayo que se usó en los ejemplos y el ensayo que puede determinar si una línea o variedad de planta comprende un elemento genético que confiere resistencia a VE427RB de acuerdo con la invención. El experto puede modificar igualmente el ensayo divulgado o desarrollar diferentes ensayos, por ejemplo basándose en la infección en campo con un patotipo P1 (preferentemente VE427RB), basándose en insectos vilíferos que transmiten P1 o basándose en diferentes ensayos de inoculación artificial. El ensayo usado debería ser capaz de, preferentemente, identificar plantas de Capsicum que comprenden un elemento genético que confieren resistencia (p. ej., un fragmento de introgresión) mediante, por ejemplo, la ausencia (esencial) de síntomas sistémicos (o presencia sistémica de las partículas víricas) tras la infección o inoculación de, por ejemplo, hojas inferiores, mientras que las plantas control susceptibles sí desarrollan síntomas sistémicos. Por supuesto, diferentes ensayos pueden usar un modo diferente de determinar si una planta es resistente o susceptible, pero, cualquiera que sea el ensayo, si las plantas se vuelven a analizar en el ensayo de resistencia a VE427RB descrito en el presente documento y se determinan para determinar si comprenden la resistencia a VE427RB de acuerdo con el presente ensayo, comprenden un elemento genético que confiere resistencia a VE427RB de acuerdo con la invención.

Preparación del inoculo del patotipo Un patotipo, tal como P0 or P1 , puede almacenarse / se almacenó durante un tiempo prolongado como hojas de N. benthamiana infectadas o savia de hoja en nitrógeno líquido.

Antes de usarlo para el ensayo de inoculación artificial de líneas de pimiento, plantas susceptibles, tales como plantas de N. benthamiana o Capsicum no portadoras de ningún gen de resistencia al TSWV pueden infectarse / se infectaron con el patotipo para comprobar la actividad de dicho patotipo (p. ej., 5 o más plantas se pueden infectar / se infectaron). Como control negativo, las plantas resistentes también pueden infectarse opcionalmente (p. ej., plantas de Capsicum annuum de depósito NCIMB 41817 y NCIMB 41818 y NCIMB 41936 para P1 y plantas de Capsicum que tiene el gen Tsw para PO).

La actividad del inoculo se confirma si las plantas susceptibles desarrollan síntomas sistémicos. Las hojas sintomáticos (identificadas por un moteado amarillo en las hojas) de estas plantas se pueden usar / se usaron para la inoculación de líneas de pimiento que se van a analizar. Se puede usar / se usó microscopía electrónica para excluir la presencia de otros virus.

Ensayo de resistencia al TSWV de acuerdo con la invención En un ensayo de resistencia al TSWV (tal como un ensayo de resistencia a VE427RB o PO u otro ensayo de resistencia a P1) de acuerdo con la presente invención se siembra una serie de plantas de una línea o variedad de planta cuya resistencia frente a uno o más patotipos del TSWV se va a analizar y se cultivan en las mismas condiciones como un número de plantas control. Los patotipos son, por ejemplo P1 (cuya muestra representativa de VE427RB se ha depositado en el DSZM con el número de acceso DSM24829) o PO (cepa del TSWV silvestre, por ejemplo una cepa del TSWV contra la cual las plantas que tienen el gen Tsw, tal como C. chínense Pl 152225, sin resistentes; dicha cepa silvestre es, por ejemplo, ?? ?d^ que se puede identificar por la secuencia de su segmento S (n° de acceso en GenBank DQ376178). En general, se siembran y cultivan al menos 5 o más, al menos 10 o más, al menos 12 or more, al menos 15 o más, al menos 20 o más plantas (plantas de ensayo) por patotipo hasta que tienen dos cotiledones y de cinco a seis hojas verdaderas. Las condiciones de cultivo son, por ejemplo, en un invernadero con suficiente suministro de agua a 26°C/18°C día/noche con un fotoperiodo de aproximadamente 14 horas. La fuente de luz es, por ejemplo, lámparas de sodio Philips SON-T 400, radiación fotosintéticamente activa 120 mol*s"1 *m"2 p[PAR]. El medio de crecimiento es, por ejemplo, tierra tal como mitad césped mitad piedra. Las mismas condiciones se usaron durante el ensayo de resistencia a VE427RB en los ejemplos. El experto en la técnica conoce bien las condiciones de crecimiento de las plantas de pimiento. Usando las mismas condiciones de crecimiento también se cultivaron plantas control. En general, las plantas control se pueden dividir en dos clases, plantas que son resistentes a un patotipo específico, tales como plantas que son resistentes a los patotipos PO o P1, y plantas que se sabe que son susceptibles a dicho patotipo específico. El experto entenderá que, preferentemente, ambas categorías de plantas control deberían formar parte de u ensayo de resistente. En cada ensayo, parte de las plantas control se trataron con una mezcla de tampón y el patotipo de interés y parte de las plantas control se trataron solo con tampón. Las plantas control a las que se inocula solo tampón deberían permanecer sin síntomas al final del ensayo, es decir, estas plantas no deberían mostrar ni síntomas locales ni sistémicos de una infección vírica.

En general, loas dos hojas más jóvenes aunque completamente desarrolladas de una planta tienen dos cotiledones y en de cinco a seis hojas verdaderas se inoculó mecánicamente (p. ej., mediante pulverización del inoculo, es decir, una mezcla de tampón y patotipo, sobre la lámina foliar) por primera vez. Después de, por ejemplo, 5 días, se produjo una segunda inoculación mecánica de las hojas inoculadas.

Para la inoculación de las dos hojas más jóvenes de las plantas que se van a analizar, las hojas de N. benthamiana infectadas se congelaron en nitrógeno líquido, se molieron hasta un polvo y, por ejemplo, 1 g de polvo de hoja se mezcló con 5 mi de tampón de Paul (tampón fosfato 0,05M, pH 7, DIECA (dietilditiocarbamato sódico trihidrato) 0,005 M, EDTA-Na2 0,001 M, tioglicolato sódico 0,005 M). Opcionalmente, el tampón puede contener un agente colorante, tal como polvo de carbón activo, para marcar las hojas inoculadas con su color más oscuro producido por los residuos de carbón activo comparados con las hojas no inoculadas. La mezcla puede / se , por ejemplo, pulverizarse / pulverizó sobre las hojas que se van a inocular.

Como control negativo, las dos hojas más jóvenes pero completamente desarrolladas de una planta control que tiene dos cotiledones y en de cinco a seis hojas verdaderas se pueden / se inocular / inocularon solo con tampón.

Una planta se consideró resistente si las hojas superiores no inoculadas de una planta carecían esencialmente de signos de síntomas inducidos por virus (moteado amarillo) 28 días después de la primera inoculación con una cepa vírica específica, es decir, estas plantas esencialmente no muestran síntomas sistémicos. Una primera observación de los síntomas sobre la hoja inoculada y de los síntomas sistémicos de las hojas superiores no inoculadas de plantas control y de prueba se pueden evaluar /se evaluaron para cada planta tras, por ejemplo, 5, 6 o 7 días. Una segunda observación se puede evaluar tras, por ejemplo, 12, 13 o 14 días. Una tercera observación se puede evaluar tras, por ejemplo, 28, 29 o 30 días. Cabe destacar que las hojas superiores no inoculadas solo se desarrollan completamente en un estadio de la planta más tardío que el punto de tiempo de la primera inoculación.

En una realización, el número de plantas control en cada categoría (p. ej., plantas control susceptibles tratadas con patotipo o tratados con tampón únicamente y/o una planta control resistente tratada con patotipo o tratada únicamente con tampón) es de al menos 5 %, 10 %, 25 %, 50 % en comparación con la cantidad de plantas de ensayo en un ensayo de resistencia, aunque el número de plantas en cada categoría de las plantas control en un ensayo de resistencia es al menos 1 , preferentemente al menos 5, o al menos 10; o el número de plantas control es igual a la cantidad de plantas de ensayo en un ensayo de resistencia. En una realización se realizan al menos dos o más duplicados por ensayo. En una realización, la cantidad de plantas analizadas de alguna línea / variedad es de al menos 5, 6, 10, 12, 15 o 20 plantas de ensayo por categoría (plantas de ensayo tratadas con patotipo o tratadas únicamente con tampón).

Análisis En un ensayo de resistencia a VE427RB se usó VE427RB como patotipo. Asimismo, en un ensayo de resistencia P0, tal como ???d^ o Ve430WT, se usó como patotipo.

Las plantas de ensayo se pueden clasificar en "resistentes a VE427RB" o "resistentes a PO", respectivamente, si (tras la inoculación en las hojas de VE427RB o PO, respectivamente) no aparecen esencialmente síntomas sistémicos en las hojas superiores no inoculadas, mientras que en la(s) planta(s) control susceptible(s) aparecen síntomas sistémicos sobre las hojas superiores no inoculadas, por ejemplo en las condiciones de ensayo descritas en el presente documento o condiciones de ensayo equivalentes.

"Síntomas sistémicos" hace referencia a síntomas de TSWV, en particular moteado amarillo, que desarrollan hojas en las que no se había inoculado TSWV, preferentemente sobre las hojas superiores.

"Síntomas locales" hacen referencia a los síntomas del TSWV, especialmente lesiones necróticas, que se desarrollan en las hojas a las que se inoculó el TSWV (y marcadas opcionalmente con, por ejemplo, polvo de carbono).

"Esencialmente sin síntomas sistémicos" de las líneas o variedades de plantas en un ensato como se describe en el presente documento significa que la mayoría de las plantas analizadas de una línea de planta o variedad de planta, es decir al menos un 60 % no muestra ningún signo de moteado amarillo sistémico (inducido por virus) (clorosis) sobre las hojas superiores no inoculadas, mientras que todas las plantas control susceptibles muestran síntomas sistémicos. En una realización, al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 98 % o incluso eMOO % de las plantas analizadas no muestran ningún signo de moteado amarillo sistémico (inducido por virus) (clorosis) sobre las hojas superiores no inoculadas.

El "moteado amarillo" es el síntoma típico de la infección sistémica del TSWV sobre el pimiento que conoce en experto en la técnica. El "moteado amarillo" hace referencia a áreas de manchas/puntos/zonas amarillas.

"Lesiones necróticas", como se usa en el presente documento, son áreas pequeñas y oscuras en las que se produce necrosis en las hojas inoculadas.

Por tanto, en una realización, las plantas analizadas que no muestran esencialmente síntomas sistémicos (es decir, sin moteado amarillo sobre las hojas superiores no inoculadas) esencialmente muestran lesiones necróticas sobre las hojas inoculadas en comparación con las plantas control en las que se inoculó únicamente tampón. Esta es una reacción local de plantas resistentes contra un patotipo. Plantas que "esencialmente muestran / desarrollan lesiones necróticas locales" hacen referencia a al menos un 60 %, preferentemente 70 %, 80 %, más preferentemente al menos 90 %, 92 %, 93 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % muestran lesiones necróticas sobre la hoja inoculada, por ejemplo aproximadamente 28 días después de la inoculación artificial.

No obstante, el experto en la técnica conoce la presencia / ausencia de virus en las hojas superiores no inoculadas (en comparación con las plantas control inoculadas únicamente con tampón o que se sabe que son resistentes contra un patotipo específico, por ejemplo Ve427RB) en las condiciones de ensayo de resistencia descrito en el presente documento también se pueden determinar, o como alternativa, usando, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzimas) basándose en la presencia (o ausencia) de una proteína NSs de un virus en las hojas superiores no inoculadas de plantas sometidas a un ensayo de resistencia a VE427RB o de resistencia a P0 como se describe en el presente documento. Por tanto, un modo alternativo o adicional para evaluar la presencia/ausencia de síntomas sistémicos (y la presencia/ausencia de resistencia) es analizar si las partículas de virus de TSWV se pueden encontrar en las hojas superiores no inoculadas.

Producción de plantas de Capsicum resistentes a Ve427RB Se puede generar una planta de Capsicum, especialmente Capsicum cultivado, que comprende resistencia a Ve427RB conferida por un fragmento de introgresión de Capsicum silvestre (p. ej., obtenible de PA2638 o de otras plantas de Capsicum silvestres resistentes a Ve427RB) mediante una serie de procedimientos. En una realización preferida, la planta de Capsicum se genera con procedimientos no transgénicos, preferentemente mediante procedimientos de cultivo, incluyendo uno o más procedimientos seleccionados de cruzamiento, autofecundación, retrocruzamiento, producción de dobles haploides, rescate de embriones, cultivo asistido por marcadores, fusión de protoplastos y similares, o combinaciones de los mismos.

La presente invención también se refiere a un procedimiento de producir una planta de Capsicum resistente a Ve427RB que comprende las etapas de realizar un procedimiento de detección de la presencia de un locus de resistencia cuantitativa (QTL) que confiere resistencia frente a Ve427RB en una planta de pimiento donante de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente y transferir in elemento genético / secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un QLT o una parte del mismo que confiere resistencia á Ve427RB, desde dicha planta donante a una planta de Capsicum receptora susceptible a Ve427RB. La transferencia de dicha secuencia de ácido nucleico se puede realizar mediante cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente en el presente documento.

En una realización, el procedimiento para identificar una planta Capsicum resistente a Ve427 B comprende: a) detección selectiva de plantas o variedades de Capsicum para determinar la resistencia a Ve427RB realizando, por ejemplo, un ensayo de resistencia a Ve427RB como se describe en el presente documento, b) identificar una planta de Capsicum o línea o variedad que no desarrolla síntomas sistémicos tras infección con Ve427RB. La línea o variedad de planta identificada se pueden usar después en, por ejemplo, un esquema de retrocruzamiento u oro esquema de cultivo tradicional, para generar una planta de Capsicum resistente a Ve427RB (preferentemente, C. annuum), preferentemente una variedad cultivada o variedad que tiene buenas propiedades agronómicas y que comprende los QLT de resistencia a Ve427RB En una realización, el procedimiento para generar una planta Capsicum resistente a Ve427RB comprende: a) detectar de forma selectiva plantas o líneas o variedades de Capsicum según la resistencia a Ve427RB realizando un ensayo de resistencia a Ve427RB como se ha descrito en el presente documento, b) identificar una planta o línea o variedad de Capsicum que no desarrolla síntomas sistémicos tras la infección por Ve427RB, c) cruzar dicha planta o línea o variedad de Capsicum con otra planta de Capsicum, por ejemplo una planta que carece de resistencia a Ve427RB, para producir una planta F1 , d) autopolinizar y/o cruzar (p. ej., retrocruzar) la planta F1 una o más veces, para producir una progenie de una planta de Capsicum, que comprende resistencia a Ve427RB En la etapa a) la planta o línea o variedad de Capsicum en una realización puede ser una planta de Capsicum o puede ser una planta de Capsicum cultivada. En una realización, la planta de la etapa a) es una planta seleccionada de plantas depositadas con los números NCIMB 41817, NCIMB 41818 y NCIMB41936, o una progenie de las mismas, de modo que la planta progenie comprende resistencia a Ve427RB En la etapa b), se puede identificar la planta cuando comprende resistencia a Ve427RB si al menos un 60 %, preferentemente al menos 70 %, 80 %, más preferentemente al menos 90 %, 92 %, 93 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de las plantas infectadas con Ve427RB no desarrollan síntomas sistémicos. En la etapa c), la planta en la que se introduce la resistencia a Ve427RB es, preferentemente, una planta de Capsicum cultivada, preferentemente una línea o variedad de cultivo de élite que carece de resistencia a Ve427RB-. Opcionalmente, esta planta comprende resistencia a Tsw, de modo que las plantas progenie desarrolladas en la etapa d) comprenden tanto el gen de resistencia a Tsw como el elemento genómico que confiere resistencia a Ve427RB Una planta que comprende resistencia a Tsw se puede identificar mediante, por ejemplo, análisis de marcadores moleculares lo en un ensayo de resistencia como se describe en el presente documento o cualquier otro ensayo, de modo que la planta Capsicum es resistente a (es decir, por ejemplo, no desarrollan síntomas sistémicos en un ensayo de resistencia a TSWV como se describe en los ejemplos), las cepas de TSWV silvestre (patotipo PO), tal como p105WT, y otros..

En la etapa d), la presencia del elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB en las plantas progenie se puede confirmar mediante varios procedimientos (tales como el ensayo de resistencia a Ve427RB o ensayo similar, ensayos de campo en las áreas en las que se encuentran las cepas Ve427RB etc.). Opcionalmente, también se puede confirmar la presencia del gen Tsw mediante marcadores y/o ensayos de resistencia al TSWV.

Otra realización proporciona un procedimiento para transferir la resistencia a Ve427RB de una planta de Capsicum a otra planta de Capsicum que carece de resistencia a Ve427RB. El procedimiento comprende la transferencia del fragmento de introgresión de una planta de Capsicum donante resistente a Ve427RB en una planta de Capsicum receptor susceptible a Ve427RB mediante cruzamiento de dichas plantas. Por tanto, esta transferencia se puede realizar adecuadamente usando técnicas de cultivo tradicionales. Un fragmento de introgresión que comprende un QLT que confiere resistencia a Ve427RB se somete a introgresión, preferentemente, en líneas o variedades comerciales de Capsicum usando selección asistida con marcadores (MAS). El cultivo asistido con marcadores o la selección asistida con marcadores implica el uso de uno o más de los marcadores moleculares para la identificación y selección de las plantas descendientes que contienen uno o más de los genes que codifican el rasgo deseado. En este caso, dicha identificación y selección se basa en la selección de un QLT de la presente invención o marcadores asociados o marcadores asociados con el fragmento de introgresión (es decir, marcadores que son específicos del fragmento de introgresión).

El MAS también se pude usar para desarrollar líneas casi biogénicas (NIL) que alojan el QLT de interés, lo que permite un estudio más detallado del efecto de cada QLT y también es un procedimiento eficaz para el desarrollo De poblaciones de líneas endogámicas por retrocruzamiento (BIL). Las plantas de Capsicum desarrolladas de acuerdo con la presente realización pueden derivar de forma ventajosa una mayoría de sus rasgos a partir de la planta receptora y derivar resistencia a Ve427 B a partir de la planta donante. Como se ha tratado anteriormente brevemente, las técnicas de cultivo tradicionales se pueden usar para producir introgresión en una secuencia de ácido nucleico que codifica resistencia a Ve427RB en una planta de Capsicum receptora susceptible a Ve427RB. En un procedimiento, que se denomina cultivo de raza, una planta Capsicum donante que exhibe resistencia a Ve427RB y que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica resistencia a Ve427RB se cruza con una planta Capsicum receptora susceptible a Ve427RB que, preferentemente, exhibe características comercialmente deseables, tales como, entre otros, resistencia a la enfermedad, resistencia a insectos, características variables del fruto etc. La población de plantas resultante (que representa los híbridos Fi) se autofecundan después y se obtienen semillas (semillas F2). Las plantas F2 cultivadas a partir de las semillas F2 se seleccionan para determinar la resistencia a Ve427RB. Como alternativa, o demás de una o más generaciones adicionales, tales como una generación F3, F4 o BC1 o BC2, se puede someter a detección selectiva de la resistencia a Ve427RB . La población se puede someter a detección selectiva por ejemplo, de acuerdo con el ensayo de resistencia descrito en el presente documento o ensayos de resistencia alternativos y/o se puede usar selección asistida por marcadores, por ejemplo para confirmar los resultados obtenidos del ensayo de resistencia y, por tanto, también se pueden usar varios procedimientos combinados.

Las líneas de plantas de resistentes a Ve427RB endogámicas se pueden desarrollar usando las técnicas recurrentes de selección y retrocruzamiento, autofecundación y/o dihaploides o cualquier otra técnica usada para fabricar líneas parentales. En un procedimiento de selección y retrocruzamiento recurrentes, la resistencia a Ve427RB se puede someter a introgresión en una planta receptora diana (el padre recurrente) cruzando el padre recurrente con una primera planta donante, que difiere del padre recurrente y que en el presente documento se denominan "padre no recurrente". El padre recurrente es una planta que no es resistente o que tiene un nivel bajo de resistencia a Ve427RB (p. ej., al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 % de al menos 10 plantas en un ensayo de acuerdo con la presente invención muestran síntomas sistémicos tras la inoculación de Ve427RB) y poseen características comercialmente deseables, tales como, entre otros, resistencia a la enfermedad (adicional), resistencia a insectos, características valiosas de los frutos etc. El padre no recurrente puede ser cualquier variedad de planta o línea endogámica que es fértil para cruzar con el padre recurrente. La progenie resultante de un cruce entre el padre recurrente el padre no recurrente se retrocruza con el padre recurrente. La población de plantas resultante se somete después a detección selectiva de las características deseadas que se puede producir de numerosos modos diferentes. Por ejemplo, la población se puede someter a detección selectiva usando detecciones de patología fenotípica tal como el ensayo de resistencia descrito en el presente documento, bioensayos cuantitativos como se conoce en la técnica con Ve427RB y/o selección asistida por marcadores (MAS).

Debe tenerse en cuenta que, por ejemplo, cuando se produce introgresión en un locus recesivo, el fenotipo conferido por dicho locus solo se expresará en plantas descendientes en condiciones en las que se forman plantas homocigotas para el locus.

En general, un procedimiento de introducción de un rasgo deseado, tal como resistencia a Ve427RB en una variedad de Capsicum híbrida comprende las etapas de: (a) cruzar un padre de Capsicum endogámico con otra planta de Capsicum que comprende uno o más rasgos deseados, para producir plantas progenie F|, en las que un rasgo deseado es resistencia a Ve427RB y autofencundar las plantas progenie F| una o más veces para producir una F2, o F3, o una generación adicional. (c) seleccionar a partir de dichas plantas progenie de generación F2, o F3 o una generación adicional, las plantas que tienen el rasgo deseado, por ejemplo, usando el ensayo de resistencia al TSWV como se define en el presente documento. (d) retrocruzar opcionalmente las plantas de progenie seleccionadas con dicha planta parental de Capsicum endogámica para producir plantas de progenie de retrocruzamiento; (e) opcionalmente seleccionar las plantas progenie de retrocruzamiento que poseen el rasgo deseado y las características morfológicas y fisiológicas de dicha planta parental de Capsicum endogámica, en el que dicha selección comprende, por ejemplo, el ensayo de resistencia como se ha descrito en el presente documento. (f) opcionalmente repetir las etapas (d) y (e) dos o más veces sucesivas para producir plantas progenie de retrocruzamiento de tercera o más generación; (g) opcionalmente autofecundar progenie retrocruzada seleccionada con el fin de identificar plantas homocigotos; (h) opcionalmente cruzar al menos una de dichas plantas de progenie retrocruzadas o autofecundadas con otra planta parental de Capsicum endogámica para generar una variedad de Capsicum híbrida con el rasgo deseado y todas las características morfológicas y fisiológicas de la variedad de Capsicum híbrida cuando se cultiva en las mismas condiciones ambientales.

Como se ha indicado, la última generación de retrocruzamiento se puede autofecundar con el fin de proporcionar una progenie de cultivos puros (endogámicos) que comprende resistencia a Ve427RB en forma homocigota. Por tanto, el resultado de la selección recurrente, retrocruzamiento y .autofecundación se producen líneas que son genéticamente homogéneas para los genes asociados con la resistencia a Ve427RB así como otros genes asociados con rasgos de interés comercial.

La planta de Capsicum híbrida F1 resultante puede comprender el elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB en forma homocigoto o heterocigota. Por tanto, en una realización se proporcionan dos líneas parentales endogámicas, teniendo cada una buenas características agronómicas y comprendiendo cada una el elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB en forma homocigota de modo que el híbrido F1 comprende el elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB en forma homocigota. En otra realización se proporcionan dos líneas parentales endogámicas, teniendo cada una buenas características agronómicas pero solo una de las líneas parentales endogámicas comprende el elemento genético que confiere resistencia a Ve427RBen forma homocigota, mientras que la otra carece del elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB, de modo que el híbrido F1 comprende el elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB en forma heterocigota. Preferentemente, las líneas parentales endogámicas (y los híbridos F1) son de la especie Capsicum annuum L. y producen frutos de pimientos de buena calidad. En una realización, los frutos de pimientos son pimientos de campana, pero se puede proporcionar cualquier otra forma/tipo de fruto y cualquier color.

Por tanto, el uso de una planta de Capsicum, preferentemente una planta de Capsicum annuum, como padre en la producción del pimiento híbrido F1 , en el que dicho padre híbrido F1 comprende un elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB En una realización, el elemento genético se pueden obtener a partir de semillas depositadas con los números de acceso seleccionados de NCIMB 41817, NCIMB 41818 y NCIMB41936, o una progenie de los mismos, de modo que la planta progenie comprende resistencia a Ve427RB También se proporcionan semillas de cualquiera de las plantas descritas en el presente documento, especialmente semillas a partir de las cuales se pueden cultivar híbridos de F1 descritos en el presente documento y/o semillas partir de las cuales se pueden cultivar una C. annuum endogámica que comprende resistencia a Ve427RB' de modo que la resistencia es la resistencia como se encuentra en las semillas depositadas con los números de acceso seleccionados de NCIMB 41817, NCIMB 41818 y NCIMB41936, es decir, en los que la resistencia a Ve427RB' se puede obtener / se puede obtener a partir de dichas semillas.

El objetivo del cultivo de plantas es combinar en una única variedad varios rasgos deseables. Para las cosechas comerciales, estos rasgos pueden incluir resistencia a enfermedades e insectos, tolerancia al calor y a la seguía, reducción del tiempo hasta la madurez de la cosecha, mayor rendimiento y mejor calidad agronómica, uniformidad del fruto etc. La uniformidad de las características de las plantas, tales como germinación y plantación, velocidad de crecimiento, madurez y altura de la planta también pueden ser de importancia.

Las cosechas comerciales se cultivan a través de técnicas que aprovechan el procedimiento de polinización de la planta. Una planta se autopoliniza si el polen de una flor se transfiere a la misma o a otra flor de la misma planta. Una planta se poliniza cuando los individuos dentro de la misma familia o línea se usa para la polinización. Una planta sufre polinización cruzada si el polen procede de una flor de una planta diferente de una familia o línea diferente. Las plantas que se han autopolinizado y seleccionado el tiempo para muchas generaciones se hacen homocigotos en casi todos los loci génicos y producen una población uniforme de progenie de cultivo verdadera. Un cruce entre dos líneas homocigotos diferentes produce una población uniforme de plantas híbridas que pueden ser homocigotos para muchos loci génicos. Un cruce de dos plantas, cada una heterocigoto, en una serie de loci génicos, producirá una población de plantas heterogéneas que difieren genéticamente y no serán uniformes.

El desarrollo de una variedad de pimiento híbrida en un programa de cultivo de plantas de Capsicum implica tres etapas: (1) la selección de plantas de varios conjuntos de germoplasmas para los cruces de cultivo iniciales; (2) la autofecundación de las plantas seleccionadas de los cruces de cultivos para varias generaciones para producir una serie de líneas endogámicas que, son cultivos individualmente verdaderos y altamente uniformes; y (3) cruce de una línea endogámica seleccionada con una línea endogámica no relacionada para producir la progenie híbrida (F|). Después una cantidad suficiente de cultivos endogámicos, las generaciones filiales sucesivas servirán simplemente para incrementar las semillas del cultivo endogámico desarrollado. Preferentemente, una línea endogámica debería comprender alelos homocigotos a aproximadamente un 95 % o más de sus loci.

Una consecuencia importante de la homocigosidad y homogeneicidad de las líneas endogámicas es que el híbrido creado por el cruce de un par definido de cultivos endogámicos siempre será igual. Una vez que se han identificado los cultivos endogámicos que crean un híbrido superior se puede producir un suministro continuo de la semilla híbrida usando estos padres endogámicos y las plantas de Capsicum híbridas se pueden generar a partir de este suministro de semillas híbridas.

Un aspecto de la presente invención hace referencia a una planta de pimiento resistente a Ve427RB, o una parte de la misma, obtenible mediante un procedimiento de la invención. Otro aspecto de la presente invención está relacionado con una planta Capsicum resistente a Ve427RB, o una parte de la misma, que comprende el QTL que confiere resistencia a Ve427RBi en el que dicho QTL no está en su fondo genético natural. Las plantas de pimientos resistentes a Ve427RB aspecto de la presente invención pueden ser de cualquier tipo genético, tal como endogámico, híbrido, haploide, dihaplóide o transgénico. Adicionalmente, las plantas de la presente invención pueden ser heterocigotas u homocigotas para el rasgo de resistencia a Ve427RB, preferentemente homocigotos. Aunque los QLT de la presente invención, así como las partes de los mismos que confieren resistencia, se pueden transferir a cualquier planta de Capsicum con el fin de proporcionar una planta de Capsicum resistente a Ve427RB, los procedimientos y las plantas de la invención están relacionados, preferentemente, con las plantas de la especie Capsicum annuum. Las líneas de Capsicum endogámicas resistentes a Ve427RB descritas en el presente documento se pueden usar en cruces adicionales para crear plantas híbridas resistentes a Ve427RB. Por ejemplo, una primera planta de Capsicum endogámica resistente a Ve427RB de la invención se puede cruzar con una segunda planta de Capsicum endogámica que posee rasgos deseables comercialmente tales como, entre otros, resistencia a enfermedad, resistencia a insectos, características deseables para los frutos, forma deseada del fruto y tamaño del fruto etc. Esta segunda línea de de Capsicum endogámica puede o no ser resistente a Ve427RB. Preferentemente, esta segunda línea de de Capsicum endogámica es resistente a Ve427RB Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de producir semillas que se pueden cultivar en plantas de pimiento resistentes a Ve427RB. En una realización, el procedimiento comprende las etapas de proporcionar una planta de Capsicum resistente a Ve427RB de la invención, cruzar dicha planta resistente a Ve427RB con otra planta de Capsicum y recolectar semillas resultante de dicho cruce, que, cuando se plantan, producen plantas de Capsicum resistentes a Ve427RB. Como alternativa, el procedimiento comprende las etapas de proporcionar una planta de Capsicum resistente a Ve427RB de la invención y autofecundar la planta y recolectar las semillas resultantes de dicha autofecundación.

En otra realización, el procedimiento comprende las etapas de proporcionar una planta de Capsicum resistente a Ve427RB de la invención, cruzar dicha planta resistente a Ve427RB con una planta de Capsicum, recolectar semillas resultantes de dicho cruce, cultivar dichas semillas en plantas, seleccionar plantas resistentes a Ve427RB mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, autopolinizar las plantas seleccionadas durante un número suficiente de generaciones para obtener plantas que se fijan para un alelo que confiere resistencia a Ve427RB en las plantas, retrocruzar las plantas producidas de este modo con plantas de Capsicum que tienen rasgos fenotípicos deseables para un número suficiente de generaciones para obtener plantas de Capsicum que son resistentes a Ve427RB y tienen rasgos fenotípicos deseables y recolectar las semillas producidas de las plantas resultantes del último retrocruce que, cuando se plantan, producen planta de Capsicum que son resistentes a Ve427RB.

En una realización alternativa para producir una planta de Capsicum resistente a Ve427RB se pueden fusionar protoplastos para la transferencia de ácidos nucleicos desde una planta de Capsicum donante a una planta receptora. La fusión de protoplastos es una unión inducida o espontánea, tal como una hibridación somática, entre dos o más protoplastos (células cuyas paredes celulares se eliminan mediante tratamiento enzimático) para producir una célula mono, bi o multinucleada. La célula fusionada que incluso se puede obtener con especies de plantas que no se pueden cruzar entre ellas en la naturaleza, se cultiva in vitro y se regenera en una planta híbrida que exhibe la combinación deseable de rasgos. Más específicamente, se puede obtener un primer protoplasto de una planta de Capsicum u otra línea de planta que exhibe resistencia a la infección por Ve427RB. Se puede obtener un segundo protoplasto de una segunda planta de Capsicum u otra línea de planta, preferentemente una línea de Capsicum que comprende características comercialmente valiosas, tales como, entre otras, resistencia a la enfermedad, resistencia a insectos, características valiosas de los frutos etc. Los protoplastos se fusionan después usando procedimientos de fusión de protoplastos tradicionales, que se conocen en la materia.

Como alternativa se puede usar rescate de embriones en la transferencia de un ácido nucleico que comprende el QTL de la presente invención o una parte del mismo que confiere resistencia a Ve427RB de una planta donante a una planta receptora. El rescate de embriones se puede usar como procedimiento para aislar los embriones de cruces en los que las plantas no pueden producir semillas viables. En este procedimiento, el ovario fertilizado o la semilla inmadura de una planta se cultiva in vitro y se regenera para crear una planta nueva.

Adicionalmente, se proporcionan células aisladas, cultivos celulares y cultivos tisulares in vitro, cultivos de protoplastos, partes de plantas, material recolectado (p. ej., frutos de pimiento recolectados), polen, ovarios, flores, semillas, estambres, partes de flores etc., que comprenden en cada célula un elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB. Por tanto, cuando dichas células o tejidos se regeneran o cultivan en una planta de Capsicum entera, la planta comprende resistencia a Ve427RB Por tanto, también se proporciona un cultivo celular y/o cultivo tisular in vitro de células o tejidos de plantas de la invención. El cultivo celular o tisular se puede tratar con medios de brotes y/o enraizado para regenerar una planta de Capsicum.

También se abarca en el presente documento la propagación vegetativa o clonal de plantas de acuerdo con la invención. Existen muchas técnicas de propagación vegetativa diferentes. Por ejemplo, se pueden usar esquejes (nodulos, puntas de brotes, tallos etc.) para el cultivo in vitro como se ha descrito anteriormente. Asimismo, existen otras técnicas de propagación vegetativa y se pueden usar, tales como injertos o capas de aire. En las capas de aire, se deja que un trozo de tallo desarrolle raíces mientras que todavía está unido a la planta parental y una vez que se han desarrollado suficientes raíces se separa la planta clonal del padre.

Por tanto, en un aspecto se proporciona un procedimiento que comprende: a) Obtener una parte de una planta de la invención (p. ej., células o tejidos, por ejemplo esquejes), b) Propagar vegetativamente dicha parte de planta para generar una planta idéntica a partir de la parte de la planta.

Por tanto, también el uso de partes de planta vegetativas de las plantas de la invención para la propagación clonal/vegetativa es una realización de la invención.

Asimismo se proporciona una pluralidad de frutos de pimiento recolectados que comprende un elemento genético que confiere resistencia a Ve427RB, así como alimentos o productos alimentarios que comprenden partes de dichos frutos de pimiento.

En un aspecto, los frutos son frutos sin semillas.

Información de los depósitos Una muestra representativa de la cepa Ve427RB del TSWV capaz de superar la resistencia mediada por Tsw fue depositada por Nunhems B.V. en el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) el 19 de abril de 201 1 , con el número de acceso DSM24829.

Una muestra representativa de semillas de Capsicum annuum que comprende la introgresión de la resistencia a Ve427RB fue depositada por Nunhems B.V. en el NCIMB (NCIMB Limited, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland, Reino Unido) el 14 de marzo de 201 1 con los números de acceso NCIMB 41817 y NCIMB 41818.

Una muestra representativa de PA2638 fue depositada por Nunhems B.V. en el NCIMB (NCIMB Limited, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland, Reino Unido) el 23 de febrero de 2010 con el número de acceso NCIMB41936.

El solicitante solicita que las muestras del material biológico y cualquier material derivado del mismo solo se entreguen a un experto designado de acuerdo con la norma 32(1) EPC o legislación relacionada de países o tratados que tienen normas y reglamentos similares, hasta la mención de la concesión de la patente o durante 20 años desde la fecha de presentación si la solicitud se rechaza, retira o se considera retirada.

El acceso al depósito estará disponible durante la pendencia de la presente solicitud a personas determinadas por el Director de la Oficina de Patentes de EE.UU. a reivindicar a petición. Sujeto al título 37 C.F.R. § 1.808(b), todas las restricciones impuestas por el depositante sobre la disponibilidad al público del material depositado se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de la patente. El depósito se mantendrá durante un periodo de 30 años o 5 años después de la petición más reciente o para la vida ejecutable de la patente, lo que sea más largo, y se sustituirá si se convierte en inviable durante dicho periodo. El solicitante no renuncia a ningún derecho concedido bajo esta patente en esta solicitud o bajo la Ley de Protección de Variedades de plantas (7 USC 2321 et seq.).

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran la producción de plantas de pimiento, semillas y frutos de acuerdo con la invención. Todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan por referencia.

EJEMPLOS Identificación de las fuentes de resistencia eficaces contra Ve427RB La detección selectiva de resistencia se realizó en condiciones de infección natural en Almería, España. En la que la cepa Ve427RB capaz de superar la resistencia y su ^ 30^ silvestre se han aislado originalmente de (Margaría et al. (Plant Pathology Vol 53: p794)). Sorprendentemente, la muestra de PA2638 silvestre mostró resistencia contra la cepa Ve427RB capaz de superar la resistencia.

La resistencia contra la cepa Ve427RB capaz de superar la resistencia se confirmó usando inoculación artificial con la cepa Ve427RB capaz de superar la resistencia mediada por Tsw en Turín, Italia.

El procedimiento de inoculación y la evaluación de la resistencia se evaluaron como se ha descrito anteriormente y más adelante. Imágenes de ejemplos de síntomas locales y sistémicos se pueden encontrar en , por ejemplo, Margaría et al. (2007, MPMI Vol 20: 547-558).

La cepa Ve427RB capaz de superar la resistencia y la cepa p105 ^ silvestre (WT) se evaluaron para determinar el desarrollo de un conjunto de especies huésped. En doce plantas por genotipo se inoculó Ve427RB o la cepa silvestre. Después de la inoculación se evaluaron los síntomas locales en hojas inoculadas tras 7, 15 y 28 días y los síntomas sistémicos se evaluaron en las hojas superiores no inoculadas tras 15 y 20 días.

Las plantas a analizar y las plantas control se sembraron y se cultivaron en las mismas condiciones hasta que tengan dos cotiledones y de cinco a seis hojas verdaderas. Las condiciones de crecimiento fueron: invernadero, suficiente suministro de agua, temperatura: aproximadamente 26°C/18°C día/noche con un fotoperiodo de aproximadamente 14 horas, intensidad de la luz: aproximadamente 120 pmo s"1 *m"2 p[PAR], medio de crecimiento: suelo (mitad césped y mitad piedra).

Las dos hojas más jóvenes completamente desarrolladas de una planta que tiene dos cotiledones y en de cinco a seis hojas verdaderas se inocularon mecánicamente rociando una mezcla de tampón con polvo de carbón activo y Ve427RB sobre las hojas. Tras 5 días se produjo una segunda inoculación mecánica. Para la inoculación, 1 g de polvo de hoja de hojas infectadas con N. benthamiana se mezcló con 5 mi de tampón de Paul (tampón fosfato 0,05 M pH 7, DIECA (dietilditiocarbamato sódico trihidrato) 0,005 M, EDTA-Na2 0,001 M, tioglicolato sódico 0,005 M). Las hojas que se van a inocular se rociaron hasta que la superficie superior estaba húmeda El experto entenderá que la cantidad de tampón depende de la superficie que se va a cubrir. Por tanto, se puede usar, por ejemplo, aproximadamente 0,1 mi, aproximadamente 0,2 mi, aproximadamente 0,5 mi, aproximadamente 0,7 mi, aproximadamente 1 ,0 mi, aproximadamente 1 ,5 mi, aproximadamente 2,0 mi, aproximadamente 2,5 mi, aproximadamente 4,0 mi de tampón para humidificar la superficie superior de una hoja.

La actividad de cada patotipo se confirmó inoculando en las hojas de plantas susceptibles de N. benthamiana. Todas las plantas de N. benthamiana inoculadas mostraron síntomas sistémicos tras 28 días, Como control negativo, las dos hojas más jóvenes completamente desarrolladas que tienen dos cotiledones y se pueden inocular / se inocularon de cinco a seis hojas verdaderas únicamente con tampón. No se detectaron síntomas sistémicos (o locales) tras 28 días.

Como líneas control se usaron la variedad control C. chinensis Pl 152225 (designado CV1) portadora del gen Tsw y resistente a la cepa p105 ^ silvestre (y susceptible a Ve427RB) y la variedad control Quadrato D'Asti (disponible comercialmente, véase, por ejemplo, http://www.macrolibrarsi.it/prodotti/ peperone-quadrato-d-asti-5-gr-b525.php) (designada CV2) que no transporta el gen Tsw (y, por tanto, es susceptible a p105 ^ y es susceptible a Ve427RB). No obstante, también se pueden usar otras líneas control que se conocen/se pueden identificar como, por ejemplo, resistentes/susceptibles frente al TSWV silvestre. Los resultados se muestran en la tabla 1 siguiente. Las plantas inoculadas con el patotipo P0 (???d^), CV2 y PA2638 mostraron síntomas sistémicas 28 días después de la primera inoculación, mientras que las plantas CV1 (que comprenden el gen de resistencia mediada por Tsw) no mostraron síntomas sistémicos y, por tanto, como cabe esperar, eran resistentes contra la cepa silvestre.

Por el contrario, las plantas inoculadas con el patotipo P1 (Ve427RB ) de CV1 mostraron síntomas sistémicos, lo que confirma que Tsw no es eficaz contra P1. No obstante, PA2638 no mostró síntomas sistémicos. Por tanto, esta muestra silvestre es, de hecho, resistente a P1 y la reacción necrótica local en el sitio de la inoculación parece prevenir la diseminación sistémica del virus.

Tabla 1. Fenotipos tras inoculaciones artificiales 28 días después de la inoculación tal como se describe en la sección del ensayo de resistencia anterior Ejemplo 2- Introgresión de la resistencia frente a P1 (Ve427 ) en las líneas de cultivo de pimiento de élite Con el fin de controlar con eficacia los patotipos PO y P1 del TSWV, se inició un programa de retrocruzamiento usando una línea de cultivo de pimiento de élite que comprende el gen dominante Tsw, de modo que se apilan la resistencia derivada de PA2638 y las resistencias conferidas por el gen Tsw.

La muestra silvestre PA2638 se cruzó con las líneas parentales pertenecientes al tipo campana con forma de bloque {Capsicum annuum L.) y portadoras del gen Tsw deriva de C. chínense Pl 152225. La progenie F-i se autofecundó al menos dos veces.

El análisis con marcadores usando marcadores moleculares publicados para Tsw confirmó que PA2638 no contiene el gen Tsw dominante, mientras que la línea de cultivo de pimiento campana con forma de bloque contiene el gen Tsw.

En las líneas de progenie que comprenden fragmentos de introgresión de PA2638 se analizó el desarrollo de síntomas sistémicos tras las inoculaciones de Ve427RB como se describe en el Ejemplo 1 , cuyos resultados se muestran en la Tabla 2. Se analizaron doce plantas por línea. Los síntomas sistémicos (moteado amarillo en las hojas superiores no inoculadas) se evaluaron 28 días después de la primera inoculación.

Tabla 2- Resultados del ensayo de resistencia a Ve427RB de diferentes líneas tras 28 días de la primera inoculación.

Se seleccionaron las plantas de pimiento con esencialmente el mismo nivel de resistencia contra la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw Ve427RB (comprenden un fragmento de introgresión que confiere resistencia de la muestra de Capsicum silvestre PA2638 en su genoma). Las semillas de estas líneas se depositaron con los números de acceso NCIMB 41817 and NCIMB 41818. Las semillas de Capsicum silvestre PA2638 se depositaron con el número de acceso NCIMB 41936.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Una planta de pimiento del género Capsicum, caracterizada porque es resistente contra la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw del virus del bronceado del tomate (TSWV) designada Ve427RB, una muestra representativa de la cual se ha depositado con el número de registro DSM 24829, y dicha planta de pimiento comprende un elemento genético que comprende un QTL que confiere resistencia a Ve427RB o una parte del mismo que confiere resistencia a Ve427RB que no está en su fondo genético natural.

2. La planta de pimiento de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha planta puede obtenerse cruzando una planta de muestra silvestre PA2638, semillas representativas de la misma están depositadas con el número de acceso NCIMB 41931 , o cruzando una planta cuyas semillas se depositaron con los números de acceso NCIMB 41817 o NCIMB 41818 con otra planta de pimiento.

3. La planta de pimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque al menos el 60 % de las plantas infectadas con o en las que se ha inoculado Ve427RB no desarrollan síntomas sistémicos.

4. La planta de pimiento de acuerdo con cualquierade las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicha planta de pimiento produce frutos seleccionados de los siguientes tipos: tipo campana con forma de bloque, de tipo cayena, Lamuyo, Dulce Italiano, Conical, Capia, Sweet Charleston, Dolma, Cherry, de tipo Jalapeño, Shakira, Pencil o Hot Charleston, Sivri, Hungarian Wax, Kapya, banana, ancho, Fresno, Serrano, Anaheim, Pasilla, Santa Fe, Scotch bonnet, Habanero, preferentemente los frutos producidos son del tipo campana o del tipo Lamuyo.

5. La planta de pimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicha planta de pimiento es una línea endogámica o un híbrido F-i .

6. La planta de pimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende el gen de resistencia Tsw en su genoma.

7. La planta de pimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque la planta no muestra síntomas sistémicos tras la infección con o la inoculación con una cepa del TSWV silvestre, tal como una cepa seleccionada de Br01 m, p105 m, ^430 , Br20 m y p170 m

8. La planta de pimiento de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, caracterizada porque la presencia del gen de resistencia Tsw es detectable usando un marcador de ADN.

9. La planta de pimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicha planta de pimiento es una planta de pimiento cultivada de la especie Capsicum annuum, que comprende el gen de resistencia Tsw y que comprende resistencia contra Ve427RB, una muestra representativa de la cual se ha depositado con el número de acceso DSM 24829, en donde dicha planta de pimiento es de una línea de la que al menos el 60 % de las plantas analizadas en un ensayo de resistencia a Ve427RB como se ha descrito en el presente documento no muestran síntomas sistémicos sobre las hojas superiores no inoculadas tras aproximadamente 28 días desde la primera inoculación con la cepa Ve427RB.

10. La planta de pimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la resistencia se puede obtener cruzando una planta cuyas semillas se depositaron con los números de acceso NCIMB 41817, NCIMB 41818 y NCIMB 41931 , con otra planta de pimiento.

11. Semillas a partir de las cuales se puede obtener una planta de pimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

12. Frutos o partes de los mismos, tales como la pulpa, de una planta de pimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1.

13. Los frutos de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dichos frutos tienen una longitud de al menos 7 cm y/o una anchura de al menos 2 cm.

14. Los frutos de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13, en donde el fruto es un fruto de pimiento dulce.

15. Un cultivo celular o tisular in vitro de una planta de pimiento tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 .

16. Un procedimiento para identificar una planta de Capsicum resistente a Ve427RB dicho método estando caracterizado porque comprende: a) detección selectiva de plantas o variedades de Capsicum para determinar la resistencia a Ve427RB realizando, por ejemplo, un ensayo de resistencia a Ve427RB y b) identificar una planta o línea o variedad de Capsicum que no desarrolla síntomas sistémicos tras infección con Ve427RB.

17. Una planta de pimiento del género Capsicum, caracterizada porque es resistente a la cepa capaz de superar la resistencia mediada por Tsw del virus del bronceado del tomate (TSWV) designada Ve427RB, obtenida cruzando una planta de pimiento obtenida mediante el procedimiento de la reivindicación 16 con otra planta de pimiento.

18. La planta de pimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque al menos el 60 % de las plantas infectadas con o en las que se ha inoculado Ve427RB no desarrollan síntomas sistémicos.