KR101112181B1

KR101112181B1 - 잠두시들음 바이러스-2에 대해 저항성을 가지는 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR101112181B1
Application number: KR1020090035622A
Authority: KR
Inventors: 윤주연; 최승국; 류기현
Original assignee: 서울여자대학교 산학협력단
Priority date: 2009-04-23
Filing date: 2009-04-23
Publication date: 2012-02-24
Also published as: KR20100116943A

Abstract

본 발명은 잠두시들음바이러스-2(BBWV-2)에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA(short interfering RNA)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터 및 상기 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 잠두시들음바이러스-2(BBWV2) 내성 형질전환 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 농작물 생산에 있어서 많은 피해를 주는 주요 식물 바이러스들 중 하나인 BBWV-2에 대한 높은 저항성 효율을 가지는 형질전환 식물체의 제작에 유용하게 이용될 수 있다.

잠두시들음바이러스-2, RNA 간섭, RNAi, 고추

Description

잠두시들음 바이러스-2에 대해 저항성을 가지는 형질전환 식물체{Transformed Plants with Resistance to Broad Bean Wilt Virus 2}

본 발명은 잠두시들음 바이러스-2(BBWV-2)에 대해 저항성을 가지는 형질전환 식물에 관한 것이다.

전 세계적으로 식물 바이러스는 약 2,000여종이 분리 보고되었으며, 국내에서 보고된 식물바이러스는 약 120 여종이다. 식물바이러스는 많은 식물체에 병을 유발하고 각종 농작물과 화훼류의 생산량 저하, 품질 저하 및 품종 퇴화 등 농업생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다. 특히 최근에는 식량 및 각종 식물체 등의 국제 교역량이 증가되면서 국내에 존재하지 않던 외국의 병원성 식물 바이러스까지 유입되어 그로 인한 피해가 점차 심해지고 있는 추세이다. 따라서 재배식물에 대한 바이러스의 예방, 치료 및 검역은 농업에서 중요한 과제이다.

국내 고추 생산에 문제가 되는 주요 바이러스중의 하나인 잠두시들음 바이러스(Broad Bean Wilt Virus)는 입자의 지름이 28-32 nm 의 공 모양의 바이러스이며 잠두에서 처음 분리되었다. 한국에서는 시금치, 백합, 수선화, 글라디올러스, 용담, 마, 고추, 질경이 및 쇠무릎 등에서 자연감염이 확인되었으며, 전 세계적으로 잠두 등 21과 50여종의 쌍자엽 및 단자엽 식물에 대해 감염성이 있다. BBWV는 생물학적 및 혈청학적 특성과 껍질단백질의 염기서열의 상동성에 의해 2종의 변이주 BBWV-1 및 BBWV-2 로 구분하고 있다.

식물 바이러스의 치료는 현재까지는 불가능한 상태이며, 바이러스 저항성 식물의 육성이 유효한 대안으로 제시되고 있다. 바이러스에 저항성을 갖는 내성 변종식물을 생산하는 방법에는 최근 RNA간섭현상(RNA interference, RNAi)를 이용한 식물형질전환 방법에 대한 연구가 각광받고 있다. 특히 BBWV2는 RNA1과 RNA2의 분절게놈형태로 되어있으며, 바이러스 분리균주들 간의 5’말단 비번역부위가 상동성이 매우 높기 때문에 바이러스 저항성 고추 육종을 목적으로 RNAi를 유도시 보다 높은 바이러스 저항성 효율을 기대할 수 있다.

siRNA(small interfering RNA)를 이용한 RNAi는 바이러스에 대한 일반적인 방어체계중의 하나로서 siRNA는 침투한 바이러스 유전자의 특정 서열을 인식하여 파괴하도록 하는 21-23 뉴클레오타이드의 조각이다. 이 메카니즘은 포유류 세포내로 합성 siRNA를 주입시켜 특정 타깃 mRNA를 일시적으로 저해(silencing)시킴으로서 유전자의 기능을 알아내는데 응용되기도 한다. 최근 플라스미드 DNA를 이용하여 포유류 세포내에서 siRNA를 발현시키는 방법이 개발되고 있으나, 식물에 대해서는 안정적인 siRNA 매개 유전자 저해(gene silencing)는 아직 활발하게 이루어지지 못하고 있다. 따라서 식물 내에서의 유전자 발현의 특이적이며 안정적인 조절 을 위한 효과적인 전략이 농업분야에서 절실히 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 국내 농산물에 큰 피해를 입히는 주요 식물바이러스인 잠두시들음 바이러스-2(BBWV-2)에 대한 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 BBWV-2에 감염된 식물체내의 특정 서열을 가지는 RNA를 분해시키는 기능을 가지는 뉴클레오타이드 서열을 제시함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열, (b) 서열번호 제1서열의 역위반복서열, 및 (c) 상기 (a)의 서열과 (b)의 서열 사이에 위치하는 루프 서열을 포함하는 잠두시들음바이러스-2(BBWV-2)에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA(short interfering RNA)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 본 발명의 잠두시들음바이러스-2(BBWV-2)에 대하 여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA(short interfering RNA)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 다음의 단계를 포함하는 잠두시들음바이러스-2(BBWV2) 내성 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

(a) 상기 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 BBWV2 내성 형질전환 식물체를 수득하는 단계.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열, (b) 서열번호 제1서열의 역위반복서열, 및 (c) 상기 (a)의 서열과 (b)의 서열 사이에 위치하는 루프 서열을 포함하는 잠두시들음바이러스-2(BBWV-2)에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA(short interfering RNA)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명자들은 식물바이러스인 잠두시들음 바이러스-2(BBWV-2)에 대한 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 BBWV-2에 감염된 식물체내의 특정 서열을 가지는 RNA를 분해시키는 기능을 가지는 뉴클레오타이드 서열을 개발하였다.

본 명세서에서 용어“RNA 간섭”이란 세포내에 주입된 이중가닥의 RNA(double-strand RNA)가 절단되어 이에 상보되는 세포내 RNA를 분해하여 궁극적으로 유전자의 발현을 저해하게 되는 현상을 말한다. 본 발명에 따르면, BBWV-2 유전자의 5’말단의 비번역부위에 대한 서열과 동일서열에 대한 역위반복서열(inverted repeat sequence) 및 이들 서열 사이에 위치하는 루프(loop)서열의 결합에 의해 헤어핀(hairpin)구조가 만들어진다. 상기 역위반복서열은 BBWV-2의 5'말단의 비번역부위에 대한 100-230 bp의 길이이며, 바람직하게는 150-220 bp의 길이이며, 보다 바람직하게는 약 210 bp의 길이이다. 이러한 헤어핀 구조에 의해 부분적으로 이중가닥 RNA가 만들어진 후 세포질 내에 이중가닥 RNA를 절단하는 효소(dicer)에 의해 21-23 bp 의 siRNA가 만들어진다. 이러한 siRNA는 서열 특이적으로 세포내 RNA를 분해함으로서 RNA 간섭현상을 일으키게 된다.

본 명세서에서 용어 “루프(loop) 서열”이란 서열목록 제1서열의 뉴클레오 타이드 서열과 이의 역위반복서열 사이에 위치하며 전사체를 형성하는 경우 전체적으로 헤어핀 구조를 형성하도록 유도하는 서열로서 헤어핀 구조에서 루프에 해당하는 부위의 서열을 의미한다.

본 발명의 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서, 루프서열로 이용될 수 있는 서열은 당업계에 공지된 다양한 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열인 pFGC5941 바이너리 벡터의 페츄니아의 CHSA(chalcone synthase) 인트론 염기서열에 해당되는 약 1353 bp이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 잠두시들음바이러스-2(BBWV-2)에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA(short interfering RNA)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 OCS서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)GV3101이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체를 제공한다.

본 발명의 형질전환 세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol . Genet . 199:178-182;(1985)).

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 형질전환 식물체는, 바람직하게는 담배(Nicotiana) 및 고추(Capsicum) 속 형질전환 식물체이고, 보다 바람직하게는, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 및 캡시쿰아눔(Capsicum annuum) 형질전환 식물체이고, 가장 바람직하게는 니코티아나 벤타미아나 형질전환 식물체이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 잠두시들음바이러스-2(BBWV-2) 내성 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있으며, 바람직하게는 식물형질 전환용 아그로박테리움을 이용한 진공침윤(Agroinfiltration)이다.

바람직하게는 재조합 벡터에 포함되는 뉴클레오타이드의 식물체 내에서의 발 현을 유도하기 위하여 벤조티아디아졸(benzothiadiazole), 이소니코틴산(isonicotinic acid) 및 살리실산(salicylic acid) 등의 다양한 화학적 조절인자(regulator)를 사용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 잠두시들음 바이러스-2(BBWV-2)에 대해 저항성을 가지는 신규 식물 및 그 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 BBWV2 분리균주들간의 상동성이 높은 5말단의 비번역부위를 대상으로 한 RNA 간섭현상을 유도함으로써 보다 높은 바이러스 저항성 효율을 기대할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

바이러스원의 선발

고추에서 분리된 BBWV2-P(Broad bean wilt virus 2)는 서울여자대학교 Plant Virus GenBank(PVGB 접근번호 PV-0091)에서 분양받아 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana) 담배에서 바이러스를 접종시켰고 접종 5일후 BBWV2 병징을 확인하였다. 이렇게 증식된 BBWV2를 본 연구의 바이러스원으로서 사용하였다.

프라이머의 설계

BBWV는 BBWV1 및 BBWV2 타입으로 나뉘어지는데 프라이머 설계를 위해 일본, 싱가폴, 스페인에서 이미 보고된 BBWV들의 염기서열을 참고로 5’말단 비번역부위의 염기들을 비교하였다(표1 및 도 1). 그 중 BBWV2에 속하는 IP 및 ME 분리균주의 RNA1을 기준으로 가장 상동성이 높은 부위를 중심으로 17뉴클레오타이드 위치부터 37뉴클레오타이드까지 업스트림 프라이머 (BBWV5NCR-UP-Asc ; 5’-ATAT GGCGCGCC TTAAAACAAACAGCTTT CGTTC-3’, 밑줄친 이탤릭체 부분은 AscI 사이트이다.)를 디자인 하였으며 다운스트림 프라이머 (BBWV5NCR-DN-Swa ; 5’-GAGA TTTAAA TAAATTAAGGTAGCAAAATGAAA-3, 밑줄친 이탤릭체 부분은 SwaI 사이트이다.)로는 IP 분리 균주의 RNA1 5’비번역부위의 204 뉴클레오타이드 부터 225 뉴클레오타이드까지 포함되면서 약 210 bp 크기의 유전자가 증폭될 수 있도록 프라이머를 디자인하였다(도 2).

프라이머 양말단에 제한효소부위(밑줄친 이탤릭체 부분인 AscI 및 SwaI)를 추가하여 클로닝을 용이하게 하였다. 또한 같은 위치의 유전자에 BamHI 및 XbaI 제한효소서열을 넣어 동일 유전자의 역위 반복 서열(inverted repeat)로 두번째 클로닝을 시켰다. 이를 위해 사용한 프라이머들은 BBWV5NCR-UP-BamH (5’-GAGA GGATCC AAATTAAGGTAGCAAAATGAAA-3’, 밑줄친 이탤릭체 부분은 BamHI 사이트이다.) 및 BBWV5NCR-DN-Xba(5’-GAGA TCTAGA TTAAAACAAACAGCTTTCGTTC-3’, 밑줄친 이탤릭체 부분은 XbaI 사이트이다.)이다 (도 2).

BBWV 분리균주

타입	분리균주	유전자	길이	접근번호	참고문헌
BBWV1	PV132	RNA1	5817bp	NC_005289	Kobayashi et al.(1999)
	PV132	RNA2	3446bp	NC_005290	Kobayashi et al.(1999)
	Ben	RNA1	5951bp	AY_781171	Ferrer et al.(2005)
	Ben	RNA2	3607bp	AY_781172	Ferrer et al.(2005)
BBWV2	ME	RNA1	5815bp	NC_003003	Koh et al.(2001)
	ME	RNA2	3607bp	NC_003004	Koh et al.(2001)
	IP	RNA1	5953bp	AB023484	Kobayashi et al.(2003)
	IP	RNA2	3569bp	AB018698	Kobayashi et al.(2003)

역전사효소 연쇄반응( RT - PCR ) 및 클로닝

BBWV2의 5’비번역부위를 역전사효소연쇄반응법(RT-PCR) 방법으로 증폭하였다. 즉, BBWV2가 감염된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)담배 잎 1 g 으로부터 트리졸 시약(Trizol reagent)(invitrogen, USA)를 이용해 총 RNA를 추출한 후 정제된 100 ng 총 RNA를 RT-PCR의 주형으로 사용하였다. 역전사 과정으로서 SuperScript^TM III 역전사 효소(Invitrogen, USA) 및 디자인된 다운스트림 프라이머와 함께 42℃ 에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였고 10 pM 업스트림 프라이머 및다운스트림 프라이머, 0.2mM dNTP mix(Takara, Japan), 1 unit Ex-Taq 중합효소 (Takara, Japan) 및 제공된 완충액(Takara, Japan)과 함께 PCR을 수행하였다.

PCR은 95℃에서 2분간 분리(denaturation)를 진행한 다음, 95℃ 20초, 55℃ 20초, 68℃에서 1분간 30순환을 수행한 것을 68℃에서 10분간 연장을 시켜 반응을 종료하였다. 약 210bp의 PCR 산물이 증폭되었으며 이를 좀 더 검증하기 위해 염기서열분석을 수행하였다.

그 결과 약 210 bp의 BBWV2-P의 5’비번역부위 염기서열이 확인되었다. RNAi 벡터를 제작하기 위해 첫 번째 cDNA(서열목록 제1서열, 5'-ATAT GGCGCGCC TTAAAACAAACAGCTTTCGTTCCGAAAACAGCTTTCAGTTACTAAACAGCTTTCGTTCCGATTAAACAGCTTTCAAACAAATAGCTTTCATTTTATTTAGTTGTTTTTGGCTTGTGTGGCTTCGGAAAGAACCCGGAAAAAGGGAGTGTGATTAAAAGCGCACCATATATTTCGAAGATCATTTTGAATTTCATTTTGCTACCTTAATTTA TTTAAA TCTC-3' 밑줄친 이탤릭체는 AscI 및 SwaI의 제한효소 사이트이다, F-BBWV2라 명명)를 AscI 및 SwaI 제한효소로 처리해서 pFGC5941 바이너리 벡터(GenBank 접근번호 AY310901, Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC), USA)에 클로닝하여 확인한 다음 동일한 염기서열을 가진 두 번째 cDNA(5'-GAGA GGATCC AAATTAAGGTAGCAAAATGAAATTCAAAATGATCTTCGAAATATATGGTGCGCTTTTAATCACACTCCCTTTTTCCGGGTTCTTTCCGAAGCCACACAAGCCAAAAACAACTAAATAAAATGAAAGCTATTTGTTTGAAAGCTGTTTAATCGGAACGAAAGCTGTTTAGTAACTGAAAGCTGTTTTCGGAACGAAAGCTGTTTGTTTTAA TCTAGA TCTC-3', R-BBWV2라 명명)을 BamHI와 X baI로 처리하여 두 번째 클로닝을 실시하여 결국 역위 반복서열 구조의 RNAi벡터 제작을 완성하였고 이를 pIR-BBWV2라고 명명하였다(도 3).

진공침윤( Agroinfiltration )을 이용한 트랜지언트 분석( Transient assay )

RNAi 벡터인 pIR-BBWV2를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefacience) GV3101 계통(Dr. Tomas Canto and Dr. Peter Palukaitis, Scottish Crop Research Institute)에 화학적 형질 전환법으로 도입하였다. 그 후 분자생물학적 방법으로 정확하게 pIR-BBWV2가 도입된 형질전환 아그로박테리움을 획득하였다. 재조합된 아그로박테리움을 적당한 항생제(50mg/l의 리팜피신, 20mg/l의 젠타마이신 및 100mg/l의 카나마이신, Sigma-Aldrich, USA)가 포함된 배지에서 2번 연속해서 28℃에서 배양 후, 4000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 모은 후, PBS(phosphate buffered saline) 완충액으로 두 차례 세척을 실시하고 진공침윤 완충액(10 mM MES, pH 5.7, 10 mM MgCl², 200μM 아세토시린곤)(Sigma-Aldrich, USA)에 OD₆₀₀에서 0.8이 되게 희석하여 실온에 4시간동안 방치하였다. 1 mL 주사기(syringe)를 이용해 니코티아나 벤타미아나 담배잎에 진공침윤을 먼저 실시를 하였으며, 2일 후 길항바이러스인 BBWV2를 접종하였다. 바이러스의 존재 유무, 이동성 조사, 감염과정 및 식물의 병징을 BBWV2 접종 후 각각의 개체에서 3주 이상 관찰하였다(Van der Hoorn et al. (2000); Wojtkowiak et al. (2002)).

노던 블롯팅( Northern blotting )

진공침윤시킨 후 바이러스가 접종된 접종잎 1 g 으로부터 트리졸 시약 (Invitrogen, USA)으로 전체 RNA를 추출하고 동량의 10% PEG8000 및 1M 염화나트륨을 첨가하여 siRNA(small-interfering RNA)만을 분리 정제하였다. 이렇게 확보된 siRNA들을 7 M의 요소(Urea)가 포함된 15% PAGE에서 1X TBE(Tris-Borate-EDTA)와 함께 전기영동 실시하였으며, 이후 겔에서 siRNA들을 나일론 막으로 이동시켰다. 막에 siRNA들을 고정시키기 위해 UV-크로스링크을 실시하였고 예열된 교잡 완충액(hybridization buffer)(Ambion, USA) 10 mL 와 함께, 45℃에서 1시간 동안 막을 방치 후 BBWV2 특이적 프로브를 넣어 밤새 교잡(hybridization)시켰다. 막 세척 후 말레산 완충액으로 막을 처리한 뒤, DIG(Dig0xigenln)-라벨링 시스템을 이용하여 DIG 특이적 항체와 실온에서 방치 및 세척 과정을 거친 후 CSPD(Disodium 3-(4-methoxyspiro 1,2-dioxetne-3,2'-(5'-chloro) tricyclo [3,3,1,13,7] decan -4-yl) phenyl phosphate) 용액(Roche, USA)과 반응시키고 엑스레이 필름에서 감광 후 RNA의 존재 유무를 확인하였다.

실험결과

pIR - BBWV2 벡터의 BBWV2 에 대한 저항성의 확인

본 연구에서 개발된 BBWV2 RNAi 벡터(pIR-BBWV2)가 BBWV2 저항성에 효과가 있는지 먼저 검정하였다. 이를 위해 잠정 발현 시스템(transient expression system)인 진공침윤 방법으로 니코티아나 벤타미아나 담배에 실시하고 2일 후 BBWV2를 접종해서 감염성 및 병징 여부 등을 판단하였다. 완충액 및 빈 벡터(empty vector)를 먼저 진공침윤을 실시하고 BBWV2를 접종한 대조군 니코티아나 벤타미아나 담배는 4일째부터 바이러스 병징이 관찰되었으며 접종 후 7일째부터 식물 고사현상이 관찰된 반면, IR-BBWV2가 진공침윤에 의해 발현되는 담배에서는 BBWV2의 뚜렷한 병징이 관찰되지 않았다. 이런 무병징(symptomless) 현상은 접종후 21일 이후에도 관찰되었으며, 건전한 식물체(healthy plant)와 동일한 식물 생장이 관찰되었다(도 4).

진공침윤된 잎의 IR - BBWV2 벡터에 의해 BBWV2 의 RNA 가 완전히 분해되었는지의 확인

과연, BBWV-2 접종 후 21일까지 지속된 무병징이 BBWV2가 비병원성으로 바뀌어서 나타나는 현상인지 혹은 pIR-BBWV2에 의해 유도된 식물의 방어기작에 의해 완전하게 BBWV2 RNA genome이 분해되므로서 나타난 현상인지를 규명하고자 하였다. 이를 위하여, IR-BBWV2 발현을 유도하기 위한 진공침윤 후 BBWV2를 접종한다음 7일째 접종엽 및 상엽에서 BBWV2를 검출을 실시하였다. 대조군으로서 바이러스를 직접 접종한 식물체와 빈 벡터를 진공침윤을 시킨 후 BBWV2를 접종한 식물체를 사용하였다.

BBWV2 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시한 결과 진공침윤하지 않고 바이러스만 접종한 대조군 담배에서는 BBWV2가 검출된 반면 IR-BBWV2가 발현되는 담배에서는 접종엽 및 상엽 모두에서 BBWV2가 검출되지 않았다(도 5a). 이런 사실은 BBWV2 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯법에 의해서 이중으로 검증하였으며 그 결과는 RT-PCR과 동일하였다.

RNA 저해(silencing)에 의한 현상인지 확인하기 위해 접종엽으로부터 siRNA를 추출한 다음 BBWV2 특이적 프로브를 이용해 노던 블롯 교잡(Northern blot hybridization)방법으로 분석한 결과 IR-BBWV2에 의한 BBWV2의 RNA의 분해의 과학적 증거가 되는 약 21-25bp정도의 siRNA가 검출되었다(도 5b). 반면, BBWV2만 접종한 식물체나 완충액만을 접종한 식물체에서는 siRNA가 검출되지 않았다(도 5b).

위에서 기술한 연구 결과는 식물바이러스 저항성 식물 육성을 위하여 헤어핀(hairpin) RNA을 통한 RNA 간섭효과가 효율적이며, 특히 많은 화훼 및 채소작물들에 피해를 입히는 BBWV2에 대한 pIR-BBWV2 운반체를 통한 진공침윤을 통한 신속한 바이러스 저항성 검정 체계는 시간과 노동력을 단축시킬 수 있는 효율적인 시스템임을 확인하였다. 본 발명에서 구축한 시스템은 형질전환 위해성 논란이 적은 RNAi 벡터를 이용함으로서 다양한 식물바이러스 저항성 작물 육성에 새로운 가능성을 제시해준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다

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도 1은 두 개의 BBWV2 분리균주의 RNA1 및 RNA2의 5’비번역부위의 서열의 배열을 분석한 그림이다.

도 2는 BBWV2의 유전자 및 pRNAi 벡터인 piR-BBWV2를 만들기 위한 프라이머 위치를 도식화한 그림이다. 본 발명에서는 고추에서 분리한 BBWV2-P가 주형으로 사용되었다.

도 3은 본 발명에서 사용된 BBWV2-RNAi 벡터(pIR-BBWV2)를 만들기 위한 도식화된 그림을 나타낸 것이다. 안쪽의 그림은 적합한 프라이머를 이용한 RT-PCR의 산물 및 pIR-BBWV2에서 만들어진 헤어핀 구조를 나타낸 것이다. ter은 옥토핀 신타아제 터미네이터(octopine synthase terminator, OCS)이고, MAS1 은 하이그로마이신(hygromycin)에 저항성을 주는 만노핀 신타아제(mannopine synthase) 프로모터이다. BAR은 바스타 저항성 유전자(basta resistance gene)을 의미한다.

도 4는 각 실험군 및 대조군들을 BBWV2에 접종시킨 후 그 증상을 관찰한 결과를 나타낸 그림이다. 진공침윤된 니코티아나 벤타미아나의 잎 중 BBWV2에 접종된 후 21일이 경과된 잎과 시스테믹(Systemic) 잎 모두 BBWV2에 의한 증상을 보이지 않았다. 니코티아나 벤타미아나의 잎은 pIR-BBWV2 벡터를 가진 아그로박테리움(Agrobacterium)에 감염되었으며, 상기 진공침윤된 잎을 접종 2일 후 BBWV2에 의해 접종시켰다. 붉은 반점은 BBWV2에 접종되었는지 혹은 완충액만을 가해준 잎인지를 보여준다.

도 5 a-b는 IR-BBWV2로 진공침윤한 후 BBWV2를 접종한 니코티아나 벤타미아 나에서 BBWV2의 검출여부를 확인하는 RT-PCR 결과(도 5a) 및 siRNA 검출여부를 확인하는 노던 블롯팅 결과를 나타낸 그림이다(도 5b). 레인 1-4는 BBWV2에 접종된 니코티아나 벤타미아나이고, 레인 (-)는 가상 접종된 니코티아나 벤타미아나이며, 레인 (+)는 BBWV2만이 접종된 양성 대조군이다. 18s rRNA가 로딩 컨트롤로서 사용되었으며, 레인 M은 각각 1 kb(+) DNA 래더(ladder)(도 5b) 및 21bp 사이즈 마커(도 5b)이다.

<110> Seoul Women's University Industry-University Cooperation Foundation <120> Transformed Plants with Resistance to Broad Bean Wilt Virus 2 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 211 <212> DNA <213> broad bean wilt virus 2 <400> 1 ttaaaacaaa cagctttcgt tccgaaaaca gctttcagtt actaaacagc tttcgttccg 60 attaaacagc tttcaaacaa atagctttca ttttatttag ttgtttttgg cttgtgtggc 120 ttcggaaaga acccggaaaa agggagtgtg attaaaagcg caccatatat ttcgaagatc 180 attttgaatt tcattttgct accttaattt a 211 <210> 2 <211> 1353 <212> DNA <213> Petunia hybrida <400> 2 gtgtaagaat ttcttatgtt acattattac attcaacgtt ttatcttaat tggctcttca 60 tttgattgaa atttgacaat tatttcttgt tttttttttt gtcacactct ttttgggttg 120 gggtggccga cgaattgtgg gaaggtagaa agaggggagg acttttgtta tactccatta 180 gtaattactg tttccgtttc aatttatgtg acaatatttc ctttttagtc ggttccaaaa 240 gaaaatgtca gcattataaa caatttaatt ttgaaattac aattttgcca ttaataaaat 300 gatttacaac cacaaaagta tctatgagcc tgtttgggtg ggcttataag cagcttattt 360 taagtggctt ataagtcaaa aagtgacant ttttgagaag ttagaaaatc ctaacttctc 420 aaaaagtagc ttttaagcca cttatgactt ataagtccaa aaatttttaa gttaccaaac 480 atatattaat gggtttataa gcttataagc cacttttaag ctcacccaaa cgggttctat 540 gtctcacttt agactacaaa ttttaaaagt cttcatttat ttcttaatct ccgtggcgag 600 tnaaactata acacataaag tgaaacggag ggaataagat ggagtcataa actaatccaa 660 atctatactc tctccgttaa tttgtttttt agtttgattt ggtacattaa taaaacagat 720 ttttcgaagg ttataaacac agacagatgt ttcccagcga gctagcaaaa ttccaagatt 780 tctgtcgaaa attcgtgtgt ttctagctag tacttgatgt tatctttaac cttttagtaa 840 ttttttgtcc ttttctttct atttttcatc ttacaatgaa ttatgagcaa gttccttaag 900 tagcatcaca cgtgagatgt tttttatgat attgactaaa tccaatcttt accattcctt 960 aactagtaaa atacaacaca tgttaattga tacattgctt aacactgagg ttagaaaatt 1020 ttagaaatta gttgtccaaa tgctttgaaa ttagaaatct ttaatccctt attttttttt 1080 aaaatgtttt ttctcactcc aaagaaagag aaactgacat gaaagctcaa aagatcatga 1140 atcttactaa ctttgtggaa ctaaatgtac atcagaatgt ttctgacatg tgaaaatgaa 1200 agctcttaat tttcttcttt tatttattga gggtttttgc atgctatgca ttcaatttga 1260 gtactttaaa gcacctataa acacttactt acacttgcct tggagtttat gttttagtgt 1320 tttcttcaca tcttttttgg tcaatttgca ggt 1353

Claims

(a) 서열목록 제1서열의 염기서열로 이루어진 뉴클레오타이드, (b) 서열목록 제1서열의 역위 반복서열로 이루어진 뉴클레오타이드, 및 (c) 상기 (a)의 뉴클레오타이드와 (b)의 뉴클레오타이드 사이에 위치하는 루프 서열로 이루어진 뉴클레오타이드를 포함하는 잠두시들음바이러스-2(BBWV-2)에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA(short interfering RNA)를 코딩하는 뉴클레오타이드.
(a) 상기 제 1 항의 잠두시들음바이러스-2(BBWV-2)에 대하여 RNA 간섭을 유도하는 siRNA(short interfering RNA)를 코딩하는 뉴클레오타이드; (b) 상기 뉴클레오타이드에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터.
제 2 항에 있어서, 상기 식물발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
상기 제 2 항 또는 제 3 항의 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물세포.
상기 제 2 항 또는 제 3 항의 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체.
다음의 단계를 포함하는 잠두시들음바이러스-2(BBWV2) 내성 형질전환 식물체를 제조하는 방법:

(a) 상기 제2항 또는 제3항의 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 BBWV2 내성 형질전환 식물체를 수득하는 단계.