CN106754994B - 一种禾谷镰刀菌葡聚糖合成酶基因gls及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种禾谷镰刀菌葡聚糖合成酶基因GLS及应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。将在禾谷镰刀菌中RNAi干扰效果最为明显的GLS‑2，GLS‑3，GLS‑6区段分别以Linker相连，构建得到植物RNAi载体，利用基因枪方法共转化小麦，转基因小麦株系能产生相应的siRNA，通过RNAi途径沉默入侵禾谷镰刀菌GLS基因的表达，达到抑制病原菌侵染。花期接种禾谷镰刀菌表明，转基因小麦抗赤霉病能力有了很大提高，与非转基因植株相比，转基因植株病小穗率降低了42～59％。本发明还公开了该基因在植物抗病性状中的用途。

Description

一种禾谷镰刀菌葡聚糖合成酶基因GLS及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS的克隆，还涉及一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS在检测植物抗病性状中的用途。

背景技术

葡聚糖是真菌细胞壁的主要构成部分，而葡聚糖中又以β-1,3葡聚糖所占比例最大，它构成了细胞壁的骨架，对维持真菌细胞壁的正常功能起着重要作用。β-1,3-葡聚糖合成酶(GLS)是一种细胞膜结合、由多亚基组成的酶复合体，它催化转运UDP-葡萄糖聚合成β-1,3-葡聚糖和少量的β-1,6葡聚糖，形成葡聚糖纤维，葡聚糖纤维分泌出细胞膜形成网状支架，对真菌细胞壁的完整性及保护真菌抵抗低渗透压起重要作用(Shematek等，Biosynthesis of the yeast cell wall.J Biol Chem.1980.10:888-894)。抑制该酶可使真菌细胞壁结构异常，使正在生长的敏感菌的菌丝或芽体尖端的细胞壁合成部位处发生裂解导致导致细胞破裂，内容物渗漏而死亡(Georgopapadakou等，Update on antifungalstargeted to the cell wall:focus on beta-1,3-glucan synthase inhibitors.ExpertOpin Investig Drugs.2001.10(2):269)。

目前普遍认为β-1,3葡聚糖的合成主要由催化亚基和调节亚基来完成的。比如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，β-1,3葡聚糖的合成主要由两种合成酶复合物Fks1p，Fks2p(催化亚基)中的一种以及Rho1p(调节因子)来完成的(Douglas，Fungalβ(1,3)-D-glucan synthesis.Med Mycol.2001.39:55-56)。这两种催化亚基有不同的作用，但是两者间部分功能是可以替代的，FKS1和FKS2基因同时缺失后菌株致死。FKS1编码合成1876个氨基酸的多肽，属于内膜蛋白。通过在NCBI网站上对蛋白保守区分析，FKS分子的GLS区域都是高度保守的区域。FKS2蛋白序列与FKS1的相比有88％的同源性，FKS1基因是菌株生长必不可少的，FKS2基因是细胞营养生长和孢子形成所必须的。FKS1基因体现了GLS催化活性，主要在菌株的营养生长时期表达。FKS2则是在交配信息素，胞外高的钙浓度，低碳营养以及FKS1缺失时才会诱导表达(Mazur et al.,1995)，同时高温、PKC、PKC1、Calcineurin以及Cnb1也会诱导FKS2的表达(Zhao等，Temperature-induced expression of yeastFKS2 is under the dual control of protein kinase C and calcineurin.Mol CellBiol.1998.18:1013-1022)。目前基因测序发现S.cerevisiae中存在FKS3(Chervitz etal.,1998)，其DNA序列与FKS1，FKS2相似，氨基酸序列有55％的同源性，FKS3的敲除实验表明该基因不是菌株生长的必须基因，对于该基因的功能尚不清楚。

而在禾谷镰刀菌中，FKS基因以单拷贝形式存在，以单拷贝形式存在的真菌还有很多，而有的菌株中存在两种或两种以上FKS基因，到目前为止，真菌中至少含有一种单拷贝的FKS基因，而且都含有高度保守的氨基酸序列。通过RNA干扰技术对烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)β-1,3葡聚糖合成酶的FsFKS1基因进行表达抑制，表明该基因与这两种真菌的生存生长密切相关(Mouyna等，Gene silencing withRNA interference in the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus.FEMSMicrobiol Lett.2004.237:317-324；Ha等，FsFKS1,the 1,3-β-Glucan Synthase fromthe Caspofungin-Resistant Fungus Fusarium solani.Eukaryotic Cell.2006.5:1036-1042)；Garcia-Effron等研究白色链珠菌(Candida albicans)时发现，敲除β-1,3葡聚糖合成酶的合成基因FKS1后，突变子中β-1,3葡聚糖合成酶对药物棘白霉素(echinocandin)敏感性降低了几百至上千倍(Garcia-Effron等，Correlating Echinocandin MIC andKinetic Inhibition of fks1 Mutant Glucan Synthases for Candida albicans:Implications for interpretive breakpoints.Antimicrob agents ch.2009.53:112-122)。Oliveira-Garcia等使用RNA干扰的方法超表达玉米病原菌炭疽病菌(Colletotrichum graminicola)的β-1,3葡聚糖合成酶基因(GLS1)，结果发现附着胞和腐生菌丝的细胞壁能大量检测到β-1,3葡聚糖，而在活体病原菌中GLS1的表达和β-1,3葡聚糖的含量却大大降低，进一步研究表明β-1,3葡聚糖合成酶是维持附着胞细胞壁硬度和活体菌丝快速生长所必须的，下调GLS1的表达会增加附着胞细胞壁的伸缩性，腐生菌丝产生严重畸变，而活体菌丝不会受到影响，同时还发现GLS1的下调表达在活体菌丝的生长过程中能避免β-1,3葡聚糖诱导的免疫反应(Oliveira-Garcia和Deising等，Infectionstructure-specific expression ofβ-1,3glucan synthase is essential forpathogenicity of colletotrichum graminicola and evasion of glucan-triggeredimmunity in maize.The plant cell.2013.25:2356-2378)。

由于葡聚糖是真菌细胞壁的重要功能性组成成分，它存在于真菌细胞壁，哺乳动物中却不存在，并且真菌中的β-1,3葡聚糖合成酶基因都存在较高的同源性，这种结构上的保守性使得其为靶标的抑制剂有可能获得广谱抗真菌效果，因此β-1,3葡聚糖合成酶成为人们设计研发新型杀菌剂和防治真菌病害的理想靶标。

近几年来，Host-induced gene silencing(HIGS)技术在植物抗病虫害方面的应用，开辟了植物病害防治的新途径。针对病原菌生长、发育或致病过程中的关键基因作为靶标基因，在寄主植物中表达该靶标基因的RNAi载体，当病原菌侵染植物的过程中，摄入相应的dsRNA/siRNA会对其内源的靶标基因的表达进行干扰，起到抑制病原菌侵染的作用(Nowara等，HIGS:host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungalpathogen Blumeria graminis.The Plant Cell.2010.22:3130-3141；Koch等，Host-induced gene silencing of cytochrome P450 lanosterol C14α-demethylase-encoding genes confers strong resistance to Fusarium species.Proc Natl AcadSci U S A.2013.110(48):19324-19329)。靶标基因的选择是决定HIGS沉默效应大小的关键。可作为HIGS靶标的基因包括生长发育关键或致死基因、决定致病性或病原菌侵染过程中的必需基因等，用这些靶基因的同源序列构建RNAi载体，将其导入寄主植物，寄主就会通过RNAi途径沉默病原菌中相应的基因的表达，从而达到控制病害的作用。由于具有基于核苷酸序列的靶向特异性，这项技术为培育稳定、环境安全的转基因作物奠定了基础，显示了巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS可作为研发新型杀菌剂和防治真菌病害的理想靶标，为植物抗病性状的改良提供了新的基因资源；

本发明的另一个目的是在于提供了一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS在植物抗病性状中的应用，针对GLS基因为靶标，在植物中表达RNAi载体，为培育可稳定遗传，对环境安全的抗赤霉病转基因作物新品系奠定了基础，具有很大的应用前景。

本发明的GLS基因及其DNA片段在构建到真菌或植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种适用真菌的或植物的强启动子、特异启动子或诱导型启动子以及其他调控序列，以保证目的序列的转录或表达。

本发明还可以针对其他不同类型的病原真菌，以GLS基因或其同源基因作为研发新型杀菌剂和防治真菌病害靶标。

本发明的总体技术方案如下所述：

申请人分离了一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中1-5835位碱基对应的序列；该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ IDNO：2所示。

申请人提供了一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS在在改良植物抗病性状中的应用，所述的禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1中1-5835位碱基对应的序列；该基因GLS的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明的应用植物是麦类作物。优选是大麦或小麦。

申请人构建了一种植物表达载体，该载体含有如序列表SEQ ID NO：29-31所述的片段和Linker，其中所述的Linker是SEQ ID NO：32所述的序列。

本发明的GLS基因或其同源基因中的任意一区段都可以作为HIGS靶标设计基于发卡环结构或表达dsRNA/siRNA的RNAi载体，可以利用基因枪，农杆菌，植物病毒载体，显微注射等生物技术方法导入小麦、大麦等植物寄主中，通过RNAi途径沉默相应病原菌中GLS基因或其同源基因的表达，从而达到控制病害、获得改良植物抗病性状的应用。

本发明的具体技术方案如下：

一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS的克隆方法，其步骤是：

1)利用Trizol抽提试剂盒法，提取在PDA培养基上培养3d的禾谷镰刀菌5035菌丝的总RNA；

2)cDNA第一链的合成：用DNase I(RNase free)降解总RNA中的基因组DNA后，按照cDNA第一链合成试剂盒的说明书(SuperScriptTM III Reverse Transcriptase Kit)合成cDNA第一链；

3)根据Fusarium Comparative Database数据库中的GLS(FGSG_07946)基因cDNA序列，设计特异引物PCR扩增GLS cDNA全长，引物序列如下：

GLScdnacloneP1：ATGTCGGGATATCCGGGCGGTG

GLScdnacloneP2：TCAAAACAGCTTGATCTTGCCAGTAG

分离获得GLS基因的cDNA序列。信息如下：

本发明分离的禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS基因，其核苷酸序列SEQ IDNO：1中1-5835位碱基所示的序列，序列长度为5835bp；其编码的氨基酸如序列表SEQ IDNO：1中4-5835位碱基所示的序列。该GLS基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2所示，编码1943个氨基酸。

申请人提供了一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS的RNAi载体的制备方法，其步骤是：

从禾谷镰刀菌5035菌株中分离克隆的β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS，通过基因敲除手段不能获得突变菌株，说明它是一个与禾谷镰刀菌生长发育相关的致死基因。于是针对GLS基因的13个不同区段(分别命名为GLS-1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12和13)，构建了13个不同的发卡环结构的真菌RNAi载体(申请人将构建的RNAi载体依次命名为pGLSRNAi-1，pGLSRNAi-2，pGLSRNAi-3，pGLSRNAi-4，pGLSRNAi-5，pGLSRNAi-6，pGLSRNAi-7，pGLSRNAi-8，pGLSRNAi-9，pGLSRNAi-10，pGLSRNAi-11，pGLSRNAi-12和pGLSRNAi-13)，在序列表SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列中含有真菌转化载体pGLSRNAi-1，pGLSRNAi-2，pGLSRNAi-3，pGLSRNAi-4，pGLSRNAi-5，pGLSRNAi-6，pGLSRNAi-7，pGLSRNAi-8，pGLSRNAi-9，pGLSRNAi-10，pGLSRNAi-11，pGLSRNAi-12，pGLSRNAi-13的序列信息。利用原生质体转化技术将这些pGLSRNAi载体分别导入野生型禾谷镰刀菌5035菌株中，定向整合至PLS基因位点，产生13种GLSRNAi菌株。与野生型5035菌株相比，发现它们在生长发育及致病力(GLSRNAi-2,GLSRNAi-3和GLSRNAi-6菌株花期接种致病力下降了81～85％)等方面受到显著抑制，综上功能鉴定表明：对GLS-6片段的RNAi干扰效果最为明显，对GLS-2和GLS-3的干扰效果次之。

本发明所述的一种禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS在植物抗病性状中的应用的具体方法，包括下列步骤：

本发明将在禾谷镰刀菌中RNAi干扰效果最为明显的GLS-2，GLS-3，GLS-6区段(序列见SEQ ID NO:29-31)分别以Linker(序列见SEQ ID NO:32)相连，构建得到植物RNAi载体pXJCGM-biubi-Linker-Gls6SA-Gls2SA-Gls3SA，利用基因枪方法共转化小麦，获得的转基因小麦株系能产生相应的siRNA，通过RNAi途径沉默入侵禾谷镰刀菌GLS基因的表达，从而达到抑制病原菌侵染的作用。通过花期接种禾谷镰刀菌表明，获得的转基因小麦的抗赤霉病能力有了很大提高，与非转基因对照植株扬麦15相比，花期接种后，本发明的转基因植株病小穗率降低了42～59％。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS基因的核苷酸序列，序列长度为5835bp，其中1-5835位碱基对应的序列是核苷酸序列，第4-5835位碱基对应的序列是该基因的编码区(CDS)，编码1943个氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS基因编码的蛋白质序列。

序列表SEQ ID NO:3-28是扩增GLS基因13个不同区段的引物序列。

序列表SEQ ID NO:29是本发明构建的GLS基因片段GLS-2的核苷酸序列，序列长度为608bp。

序列表SEQ ID NO:30是本发明构建的GLS基因片段GLS-3的核苷酸序列，序列长度为522bp。

序列表SEQ ID NO:31是本发明构建的GLS基因片段GLS-6的核苷酸序列，序列长度为562bp。

序列表SEQ ID NO:32是本发明构建植物表达载体pXJCGM-biubi-Linker-Gls6SA-Gls2SA-Gls3SA中的Linker的序列，序列长度为68bp。

图1：是将GLS基因分成13个不同区段以及相应的真菌pGLSRNAi载体构建示意图。

图2：不同禾谷镰刀菌GLSRNAi菌株的表型实验。

图3：不同禾谷镰刀菌GLSRNAi菌株的致病力分析。附图标记说明：

图3中A图：野生型菌株5035及不同GLSRNAi菌株在花期接种小麦品种安农8455的致病力分析(P<0.05)。图3中B图：野生型菌株5035及不同GLSRNAi菌株在小麦品种安农8455上的致病力表现。

图4：一种植物表达载体pXJCGM-biubi-Linker-Gls6SA-Gls2SA-Gls3SA的构建示意图。

图5：是对T₅代转GLSRNAi基因小麦的PCR检测。附图标记说明：

在图5中：Y15为阴性对照植株，H₂O为空白对照植株，G1和G2分别为不同的GLSRNAi转基因阳性植株。

图6：是T₅代转GLSRNAi基因小麦接种禾谷镰刀菌的发病情况。附图标记说明：

在图6中：Y15为阴性对照植株，G1和G2分别为不同的GLSRNAi转基因植株。经花期接种后，非转基因对照植株的病小穗率为34.8％，而转基因植株G1和G2分别为14.3％和20.4％，病小穗率降低了42～59％。转基因小麦的抗赤霉病能力有了显著提高(P<0.01)。

具体实施方式

实施例1禾谷镰刀菌GLS基因RNAi干扰有效区段筛选及鉴定(制备实施例1)

1.GLS基因cDNA的分离与克隆

本发明中的GLS基因序列信息与Fusarium Comparative Database数据库http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_graminearum/MultiHome.html)公布的FGSG_07946序列相对应。通过常规的RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)从PDA培养基培养3d的禾谷镰刀菌5035菌丝中扩增得到cDNA序列。

其具体步骤是：

1)抽提PDA培养基培养了3d的禾谷镰刀菌5035菌株(由申请人所在实验室1999年在武汉分离与保存的一种高致病力禾谷镰刀菌菌株，参见Xu等，Disruption of thechitin synthase gene Chs1 from Fusarium asiaticum results in an alteredstructure of cell walls and reduced virulence.Fungal Genetics andBiology.2010.47:205-215)菌丝的总RNA，菌丝RNA抽提使用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；

2)cDNA第一链的合成

①用DNase I(RNase free)降解总RNA中混的基因组DNA。配制50μl的反应体系:10×DNase I Buffer5μl，DNaseI(RNase free)2μl，RNase inhibitor(40U/μl)0.5μl，总RNA3μg，ddH₂O(RNase free)补充至50μl；37℃反应40min，补加150μl的ddH₂O(RNase free)；加入200μl的P.C.I.(苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)，充分混匀；4℃、12000r/min离心15min，取上层液体180μl于新的离心管中，加入等体积的C.I.(氯仿:异戊醇＝24:1)，充分混匀；4℃、12000r/min离心10min，取上层液体160μl于新的离心管中，加入160μl异丙醇，充分混匀，室温放置15min；4℃、12000r/min离心15min，弃上清，加入500μl 4℃预冷的75％(v/v)乙醇清洗沉淀；12000r/min离心15min，弃上清，室温放置数分钟，使沉淀干燥，加入20μlddH₂O(RNase free)溶解RNA。取1μl电泳检测。

②得到高质量的RNA后，按照cDNA第一链合成试剂盒(SuperScriptTM IIIReverse Transcriptase Kit)的使用说明进行如下反应：混合Oligo(dT)20(100ng/μl)3μl，dNTPs(10mmol/L)1μl，RNA 2μg，ddH₂O(RNase free)补至13μl；65℃水浴反应5min，立即冰浴3min；短暂离心数秒后，加入5×First-stand Buffer4μl，DTT(0.1mol/L)1μl，RNaseinhibitor(40U/μl)0.5μl，SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(200U/μl)0.5μl，ddH2O(RNase free)1μl；轻轻混匀各成分，50℃温浴反应60min；70℃加热15min使酶失活；冰浴冷却3min后-20℃保存备用。

3)根据Fusarium Comparative Database数据库中的GLS(FGSG_07946)基因cDNA序列，设计特异引物PCR扩增GLS cDNA全长。引物如下：

GLScdnacloneP1：ATGTCGGGATATCCGGGCGGTG

GLScdnacloneP2：TCAAAACAGCTTGATCTTGCCAGTAG

PCR反应总体系50μl：cDNA第一链模板1μl，10×LA PCR buffer 5μl，10mM dNTP 4μl，正反向引物各1μl，LATaq酶0.5μl，加水到50μl(PCR反应试剂购自宝生物工程大连有限公司)。

PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，54℃30s，72℃2.5min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

4)PCR产物连接到T/A克隆载体pMD18-T(购自宝生物工程大连有限公司)上并用M13F和M13R引物(由载体pMD18-T自带的引物)测序验证，得到GLS基因的cDNA序列。

通过反转录得到如SEQ ID NO：1中1-5835bp核苷酸序列(序列总长度为5835bp)，该基因的CDS区位于SEQ ID NO：1中4-5835bp所示的序列(共编码1943个氨基酸)。

2.针对GLS基因不同区段的RNAi干扰载体的构建和真菌的转化(下述真菌的转化仅仅用来验证GLS基因不同区段经RNA干扰后对靶标病原菌的抑制作用(中间过程)，以提高植物转基因抗靶标病原分子育种的效率，节约了部分验证过程，得到一种初选的中间结果，下述13个转化菌不是代代相传的生物材料)：

1)本发明将GLS基因分成13个不同区段，其结构见图1所示，分别命名为GLS-1，GLS-2，GLS-3，GLS-4，GLS-5，GLS-6，GLS-7，GLS-8，GLS-9，GLS-10，GLS-11，GLS-12，GLS-13(大小依次为582bp，608bp，522bp，541bp，579bp，562bp，530bp，527bp，651bp，544bp，548bp，479bp及401bp)，扩增上述区段的正、反向引物序列如下：

GLSF1：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCCCAGCAAATGTCTCGAG

GLSR1：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGTAATCCATCTCGGCAGC

GLSF2：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAACGTTCAGCGACTTCAC

GLSR2：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTCGTCACCTTCGAGATC

GLSF3：GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAGAAGAAAGACCCAGAGG

GLSR3：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCACTTCTTCCAGTTCAC

GLSF4：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGTGTGAAGCTCAAGGACGT

GLSR4：GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATGCTGGCAACATACTTCCTG

GLSF5：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTGGTGGAAAGAAGATCGA

GLSR5：GGGGACCACTTTGTCAAGAAAGCTGGGTTTGGGTTTGTATTTGATCTCC

GLSF6：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGATCGGATCTTCCATCTTGA

GLSR6：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCTCATCTGCCAGAATCTTG

GLSF7：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCCTCATGAGTGGGATTG

GLSR7：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAACCTCAGAGTGACCATC

GLSF8：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAAGAACCTCGTCTGTACTC

GLSR8：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTCGTTCAAGTGAAGACC

GLSF9：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATCTTTATGACGACTCGAGG

GLSR9：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAATGAAAGCACGCCAAATG

GLSF10：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCATTCCCCTTATTGTC

GLSR10：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAAGCGTGGCTGCGGGA

GLSF11：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCCTTCATCTTGGATCTCGT

GLSR11：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTACAGGTCGAAACAATAAGC

GLSF12：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCGCATGTTCATTCTGGAGAG

GLSR12：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAAACTACAGCAGGTCCAGCA

GLSF13：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCGAAACAGTCCAAGCTTAG

GLSR13：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTACTTTCTTCTGTGCATAGG

PCR反应总体系为50μl：具体步骤：

cDNA第一链模板1μl，10×LA PCR buffer 5μl，10mM dNTP 4μl，正反向引物各1μl，LATaq酶0.5μl，加水到50μl(PCR反应所用试剂购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经凝胶回收后与商业化的pDONR221供体载体(购自Invitrogen公司)分别混合进行BP反应，pDONR221中的attP1/attP2特异性位点与目的片段上的attB1/attB2特异位点发生重组，形成含有attL1/attL2新位点的入门载体，再将上述入门载体分别与目的载体psxsh-RNAi-att1/att2混合进行LR反应，目的载体上的attP1，attP2性位点与入门载体上的attL1，attL2位点发生特异性重组，将目的片段替换目的载体上的两个ccdB序列，最后将反应产物转化大肠杆菌感受态，形成psxsh-RNAi-att1/att2-GLS系列的干扰表达载体(见图1)。

2)利用真菌原生质体转化法(参见：Maier等，Development of a highlyefficient gene targeting system for Fusarium graminearum using the disruptionof a polyketide synthase gene as a visible marker.FEMS Yeast Res.2005.(5):653-662)报道的方法，将上述所得的13个RNAi干扰载体分别导入禾谷镰刀菌5035原生质体中，使启动子(构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA)、GLSRNAi发卡环结构序列(来自稻瘟菌177bp内含子连接目的基因正反向片段形成发卡环结构，参见Nakayashiki等.RNA silencing as a tool for exploring gene function in ascomycetefungi.Fungal Genet Biol.2005.42:275-283)、终止子序列(构巢曲霉色氨酸C基因终止子trpC)定点整合到PLS基因(Rittenour等.Characterization of Fusarium graminearumMes1 reveals roles in cell-surface organization and virulence.Fungal GenetBio.2008.45(6):933-946)位点，产生禾谷镰刀菌GLSRNAi-1，GLSRNAi-2，GLSRNAi-3，GLSRNAi-4，GLSRNAi-5，GLSRNAi-6，GLSRNAi-7，GLSRNAi-8，GLSRNAi-9，GLSRNAi-10，GLSRNAi-11，GLSRNAi-12和GLSRNAi-13菌株。

3.禾谷镰刀菌GLS基因有效RNAi干扰区段的筛选：

1)表型实验：

制备下列PDA培养基平板(马铃薯200g煮沸15min取浸出液，葡萄糖20g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)6cm的皿倒7ml相应的培养基，取浓度为5×10⁵个/ml的各菌株新鲜分生孢子或者子囊孢子液10μl，接种于培养基平板中央，将平板放28℃培养箱内，黑暗下培养，3d后观察菌落形态。结果显示：GLSRNAi-2，GLSRNAi-3和GLSRNAi-6菌株在PDA培养基上生物量降低最为明显(见图2)。这说明针对GLS基因的这3个片段RNAi干扰后可造成菌丝生物量和生长势的降低。

2)花期接种：

在小麦扬花初期，选择长势良好且一致的主穗，用微量注射器分别吸取上述筛选的13个菌株的孢子(5×10⁵个/mL)悬浮液10μL，注入麦穗中部外侧一朵小花的外桴和内桴之间。于25℃，相对湿度90％以上保湿3d。之后，早中晚各喷水保湿一次，相对湿度保持在70％～80％左右。于14d后调查接种麦穗的病小穗数和总小穗数。根据下列公式计算病小穗率：

利用Student’s tests和方差分析中的多重比较对接种调查结果进行差异性分析。

经致病力分析表明，GLS基因的第2、3、6段(片段GLS-2，GLS-3和GLS-6)被干扰后造成禾谷镰刀菌致病力下降尤为明显(花期接种致病力下降了81～85％，发明效果见图3中的A图、图3中的B图)。

实施例2植物GLSRNAi表达载体的构建和遗传转化(制备实例2)

1.植物GLSRNAi表达载体的构建：

综合以上对禾谷镰刀菌GLS基因有效RNAi干扰区段的筛选表明：针对GLS-2，GLS-3和GLS-6区段的RNAi干扰效果最为明显。为了验证利用HIGS技术在植物中表达针对该靶标基因的dsRNA/siRNA能否提高了转基因小麦的抗赤霉病能力，本发明构建了植物表达载体pXJCGM-biubi-Linker-Gls6SA-Gls2SA-Gls3SA，该载体的构建示意图见图4，其中所述的Linker序列为：GTGAGTAAACATCCACGTCCTTGTTTTGTTGCTTGTATGTTTGACAGTTAATTAACCGGTATTATAGT(Capronia semiimmersa,ccd5 intron,68bp,基因登录号：FJ816716.1)这个载体的发卡环结构由组成型启动子玉米Ubi启动子介导，由Nos终止子终止。XJCGM-biubi-Linker-Gls6SA-Gls2SA-Gls3SA质粒由限制性内切酶NotⅠ，凝胶电泳后切胶回收得到最小表达框(Ubi启动子，目的基因发卡环结构，Nos终止子以及两端约150bp的保护碱基)DNA片度，用于基因枪轰击介导的小麦遗传转化。

2.小麦遗传转化过程：

通过基因枪介导的小麦遗传转化方法，将植物表达载体pXJCGM-biubi-Linker-Gls6SA-Gls2SA-Gls3SA以及筛选标记基因bar以最小表达框的方式共转化到小麦品种“扬麦15”(长江中下游地区推广小麦栽培品种)中，经过幼胚愈伤诱导、基因枪轰击、恢复培养、分化筛选、以及生根、壮苗、移栽等程序获得抗性植株。

小麦遗传转化的具体步骤如下：

1)剥取幼胚与愈伤诱导：

剪取小麦(扬麦15)扬花后12～14d后的麦穗，剥取中间部位饱满一致的未成熟籽粒。在超净工作台中，将籽粒倒入无菌三角瓶内，加入适量70％乙醇，消毒30sec；用无菌水快速冲洗1次；再用0.1％升汞溶液消毒6～8min；无菌水冲洗3～4次，每次2min；期间需不断地摇动三角瓶，确保灭菌彻底。在无菌条件下剥取半透明状的幼胚(0.8～1.2mm)，盾片朝上，接种于诱导培养基(成分见表1所示的培养基)中，每皿50～60个幼胚,于27℃暗培养4～6d。

2)高渗处理：

挑选状态良好的胚性愈伤转至高渗培养基(成分见表1所示的培养基)，置于直径约2cm的圆圈内，高渗处理4～6h后进行基因枪轰击，转化后继续高渗处理16～20h，于27℃暗培养。

3)基因枪轰击：

微弹载体的制备：取50μL已制备好的金粉悬液(50mg/mL)，室温下溶解，超声波处理1min；将金粉涡旋混匀后加入5μL DNA(3μg/μL)，涡旋混匀；然后慢慢加入50μL 2.5mol/LCaCl₂·2H₂O(抽滤灭菌)，涡旋混匀；加入20μL 0.1mol/L亚精胺(抽虑灭菌)，一滴一滴加，使离心管一直处于涡旋状态，涡漩振荡3min，然后冰浴静置15min，移液枪移走上清；再加入300μL 70％(体积比)乙醇，重悬后冰浴放置15min，移液枪移走上清；最后重悬于100μL无水乙醇(10μL/枪)，涡旋混匀后涂至微弹承载片，超净工作台吹干后用于基因枪轰击。

轰击参数：压力：1100psi；距离：9cm；真空度：27.5inches Hg；轰击次数：1次；每枪金粉用量为250μg/枪，DNA用量为1.5μg/枪。

4)恢复培养：

轰击后的愈伤继续高渗16～20h后，转入诱导培养基(成分见表1所示的培养基)中，于27℃暗条件下恢复培养2～3周，之后进入分化筛选阶段。

5)分化筛选：

将恢复培养后的愈伤转入分化筛选培养基(含3mg/L除草剂Bialaphos，其他成分见表1所示的培养基)中，于22℃，16h光照条件下进行第一轮分化筛选；2周后将带绿点的愈伤转入分化筛选培养基(含5mg/L Bialaphos，其他成分见表1所示的培养基)中，进行第二轮分化筛选；将再生幼苗(苗高﹥2cm)转入含生根筛选培养基(含5mg/L Bialaphos，其他成分见表1所示的培养基)的直形管或三角瓶中继续筛选1～2轮，每轮2周。

6)壮苗、春化及移栽：

将生根筛选后健壮的幼苗转入壮苗培养基(不含筛选压，成分见表1所示的培养基)中，3～4d后置于4℃春化2周，然后移栽至温室(20～22℃，16h光照)中生长。

具体培养基成分：见表1

表1小麦遗传转化过程中所用的培养基

实施例3转GLSRNAi基因小麦的PCR检测(应用实施例1)

为了检测获得的抗性植株是否为转基因阳性植株，通过T₀-T₅代的PCR检测，获得了2个能稳定遗传转基因株系，分别命名为G1和G2，其T₅代PCR检测结果见图5。转基因植株G1和G2可以扩增出特异的目的条带，阴性对照植株和空白对照则不能扩增出相应的目的条带。

本实施例的PCR检测具体步骤如下：

1.小麦基因组DNA的提取(常规CTAB法)，具体步骤如下：

1)取3～4叶期的小麦幼嫩叶片，置于2mL离心管中，每管加1颗钢珠，在液氮中预冷后，用TissueLyser II(QIAGEN公司产品)研磨样品。

2)往样品中加入900μL预热的CTAB缓冲液并混匀，65℃水浴1h，期间颠倒混匀3～4次。

3)加入305μL 5mol/L KAc，225μL氯仿，颠倒混匀至溶液下层颜色为深绿色，大约5min，-20℃放置30min。

4)12000r/min离心15min，将上清900μL转移至新的离心管，加入900μL P.C.I.(苯酚:氯仿:异戊醇体积比＝25:24:1)，轻柔颠倒混匀5min。

5)12000r/min离心15min，取上清约800μL，要注意不能吸到上下液体分界面处白色固体蛋白质颗粒部分，加入等体积C.I.(氯仿:异戊醇体积比＝24:1)，点到混匀后，12000r/min离心15min，去除残留苯酚。

6)取出离心管，取上清液700～800μL加入到新的1.5mL离心管中，加入0.8倍体积异丙醇及0.1倍体积3mol/L NaAc，颠倒混匀后，室温静置10min。

7)12000r/min离心15min，弃上清，加500μL预冷的70％(体积比)乙醇洗沉淀，12000r/min离心5min，弃上清。

8)室温下风干，加入适量体积的TER(TE:RNA酶＝499:1)，DNA溶解后-20℃保存备用。

2.PCR检测：

反应体系：2×Taq PCR Mix 10μL，10μmol/L上下游引物(见表2)各0.5μL，模板DNA100～150ng，补ddH₂O至20μL。反应程序：95℃预变性5min；94℃变性40sec，58℃退火(退火温度根据不同引物有所不同)40sec，72℃延伸30sec(延伸时间根据扩增片段长度有所不同，扩增效率一般1kb/min)，共35个循环；72℃再延伸7min。PCR反应结束后，取10μL PCR产物进行电泳(1％(质量体积比)琼脂糖凝胶，90V，～40min)，利用紫外凝胶成像仪进行照相并记录。

表2 PCR扩增引物

^a GLSRNAi-2目的片段PCR检测由引物 GLSR2扩增，片段大小为 605 bp；

^bGLSRNAi-3目的片段PCR检测由引物GLSR3扩增，片段大小为491bp；

^c GLSRNAi-6目的片段PCR检测由引物 GLSR6扩增，片段大小为 293 bp。

实施例4转GLSRNAi基因小麦的抗病性鉴定(应用实施例2)

为了检测转GLSRNAi基因小麦形成的siRNA能否抑制入侵的禾谷镰刀菌的生长，本发明采用花期接种的方法检测了转基因植株的抗赤霉病性状，抗病性鉴定的具体步骤参见实施例3中的“花期接种方法“。试验结果见表3和图6。

表3转GLSRNAi基因小麦的抗赤霉病能力鉴定

注：表中不同字母表示差异极显著(P<0.01)

通过接种表型观察与统计，转基因株系的抗赤霉病能力和非转基因对照(即野生型)扬麦15植株相比，差异达到极显著(P<0.01)。花期接种21d后，非转基因对照植株(野生型扬麦15)的病小穗率为34.8％，而本发明的转基因植株G1和G2病小穗率分别为14.3％和20.0％，病小穗率降低了42～59％。

Claims (2)

1.禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS的RNA干扰片段在在改良植物抗病性状中的应用，其特征在于，所述的应用包括下列步骤：

将对禾谷镰刀菌具有RNA干扰效果的GLS-2，GLS-3，GLS-6三个区段的片段分别构建三个发卡环结构以Linker相连，构建得到植物RNAi表达载体，利用基因枪的方法转化小麦，获得siRNA转基因小麦株系，通过花期接种禾谷镰刀菌验证转基因小麦的抗赤霉病能力；其中所述的表达载体以pXJCGM为骨架，包含有ubi启动子、SEQ ID NO：29-31所示的禾谷镰刀菌β-1,3葡聚糖合成酶基因GLS片段以及Linker，所述的Linker是SEQ ID NO：32所述的序列；所述的GLS-2，GLS-3，GLS-6三个区段的核苷酸序列如SEQ ID NO：29-31所示。

2.一种植物表达载体，其特征在于，该载体按照如下步骤构建得到：将对禾谷镰刀菌具有RNA干扰效果的GLS-2，GLS-3，GLS-6三个区段的片段分别构建三个发卡环结构以Linker相连，构建得到表达载体，该载体以pXJCGM为骨架，包含有ubi启动子和如序列表SEQ IDNO：29-31所述的片段；所述的Linker是SEQ ID NO：32所述的序列；所述的GLS-2，GLS-3，GLS-6三个区段的核苷酸序列如SEQ ID NO：29-31所示。